一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于杨树基因技术领域，具体涉及一种杨树耐盐有关基因/^ΜΤ7及其表 达蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，加快杨树育种的应用基础 研宄具有紧迫性和必要性。据第七次全国森林资源清查统计，截止2008年底，我国杨树人 工林总面积已超过700万公顷，居世界第一，杨树木材产量占全国木材总量的30%左右。土 壤盐渍化是严重制约农业生产的一个全球性问题。选育和创制耐盐新种质，提高植物对盐 渍化环境的适应能力，是减轻土壤盐渍化危害以及开发利用沿海滩涂等极端生境资源的重 要途径。
[0003] HKT (High-Affinity K+Transporter)是一类存在于真核和原核生物中的阳离 子转运载体蛋白家族，具有Na+转运以及K +-Na+同向转运的双重功能，它们在植物响应盐 胁迫过程中起着重要的作用。不同植物种甚至同种植物的不同M7成员之间存在功能差 异，研宄认为，拟南芥观T/,作用机制主要为韧皮部装载-循环模式（Na+ loading into phloem) (Berthomieu et al. 2003)和木质部外排-卸载（Na+ exclusion from xylem) (Sunarpi et al. 2005; Horie et al. 2006; Davenport et al. 2007 )〇
[0004] 目前，在杨树中尚未有HKT基因家族克隆和功能研宄的相关报道。在杨树中克隆 和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明杨树抗逆的分子调控机制，为杨树抗性育种提 供理论依据，而且可以培育新的转基因耐盐品种，对开发利用沿海滩涂等极端生境资源具 有不可估量的价值。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树耐盐重要 基因/^MT7。本发明的另一目的是提供一种杨树不定根发育关键基因 Pe/^MT7的应用。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 一种杨树耐盐重要基因/?猫77,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 含有所述的杨树耐盐重要基因/^MT7的载体。所述载体在/^MT7.·7基因的5' 端组装组成型强表达启动子P35S。所述载体在/^麗77基因的3'端组装有强终止子N0S。 所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨 树的筛选。所述载体组装有能促使组装于其间的/^MT7基因表达框架和筛选标记基因 HPT 整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。
[0008] 含有所述的杨树耐盐重要基因/^MT7的宿主细胞。
[0009] 所述的杨树耐盐重要基因/^MT7在杨树抗盐胁迫中的应用。
[0010] 所述的杨树耐盐重要基因/?猫T7的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0011] 有益效果：本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了 /^MT7 基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体该基因位于启动 子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，/bMT7可在杨树体内高效表达，从而可提高杨树的 抗盐性，所以/^MT7基因是杨树响应盐胁迫的重要基因，在林木基因工程领域有重要应用 价值。
【附图说明】
[0012] 图1是植物表达载体PH5GS的结构示意图； 图2是/^MT7基因在不同浓度NaCl胁迫下杨树不定根发中的表达模式图； 图3是过量表达/^MT7的转基因杨的分子检测图； 图4是过量表达/^MT7的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比图，图中，左边为转 基因杨，右边为未转基因杨； 图5是过量表达/^MT7的转基因杨与未转基因在4%NaCl胁迫下比较图，图中，左边到 右依次为未转基因杨正对照，未转基因杨负对照，转基因杨。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未进行详尽说明的 操作可参照生物学实验手册、相关试剂盒使用说明以及生物领域中的常规操作实现。
[0014] 实施例1通过RACE技术克隆/^猫77基因 以895杨cDNA为模板，使用01 igo 6设计特异性引物，扩增/^MT7基因短片段，其中， 作观77短片段正向引物为：5' -TGGACTCCAAAGCCAGAGCAA-3'，作观77短片段反向引物为： 5' -CCAAACCATGCATCCTTGCA-3'。
[0015] 高保真 PCR 反应体系如下：10XLA PCR Buffer (Mg2+ free) 5. 0 μ 1 ;2· 5mM dNTP Mixture 8.0yl;25mM Mg2+ 5.0yl;LA Taq DNA Polymerase(5U/yl) 0·5μ1;正向引 物（10μΜ) 2μ1;反向引物（10μΜ) 2μ1;模板（895杨cDNAMyl;加无菌ddH20补足 50 μ 1〇
[0016] 反应程序：预变性 94°C 3min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 3〇8,35个循环；72°〇 lOmin。对产物测序，获得的7基因短片段序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 依据上述/^猫77基因短片段序列设计3'末端的RACE引物，进行3'RACE，获得3' cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段 与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3' cDNA末端片段序列设 计5 '末端的RACE引物，进行5 ' RACE，获得5 ' cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段 进行PCR筛选后进彳丁测序。
[0018] 3 ' RACE 正向引物：3 ' RACE gene-sp e c i f i c ou t er pr imer : 5'-ATCTATTGTCGATCTCTCCATC-3'，3' RACE gene specific inner primer :5'-TGCCGAAA AAGCAACAGGAAGAGGTTGA-3' ；3' RACE Outer Primer:5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3'， 3' RACE Inner Primer :5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3'；5' RACE Outer Primer :5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3'，5' RACE Inner Primer :5'-CGC GGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3, ；5' RACE gene-specific outer primer： 5'-AGAACCCGACATTTCCGTATGC-3'，5' RACE gene specific inner primer :5'-GGTGAGAACA ACAGGCACTGAACCAAAGAC-3'。
[0019] (1)3，RACE 反应 I)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1 μ g Total RNA,4yL dNTP Mix,2yL 3' RACE Adapter^ μ L IOX RT Buffer, I μ L RNase Inhibitor, IyL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water 补齐 20 yL。轻轻混勾，短暂 离心，42°C温育Ih ;进入PCR步骤，或-20°C保存反应物。
[0020] 2)3，RACE 巢式 PCR 反应体系：〇uter 3' RACE Component :5.0yL 10XLA PCR BuffeKMg2+ Free)，5.0yL MgCl2(25mM), 8. 0 μ L dNTP MixtureCeach 2. 5mM),2. OyL 3' RACE gene-specific outer primer, 2. 0 μ L 3' RACE Outer Primer (10 μ M)，IyL RT reaction product, 0. 5 μ L TakaRa LA Taq (5U/μ L)，26. 5 μ L Nuclease-free Water，Total volume50yL〇 Inner 3' RACE Component ：5. 0 yL 10XLA PCR Buffer (Mg2+ Free),5. OyL MgCl2 (25mM),8. OyL dNTP Mixture (each 2. 5mM),2. 0 μ L 3' RACE gene specific inner primer,2. 0 μ L 3' RACE Inner Primer (10 μ M), IyL Outer 3' RACE PCR product, 0. 5 μ L TakaRa LA Taq (5U/μ L), 26. 5 μ L Nuclease-free Water, Total volume50yL〇
[0021] 反应程序：94 °C，3min ;94 °C，30sec，60 °C，30sec，72 °C，2min，35cycles ;72 °C， 7min〇
[0022] 3)纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19_T simple Vetor 克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。反应体系（5 μ L) :2. 2 μ L 纯化回收的 PCR 产物，0.3 yL pMD-19 Simple Vector，2.5yL Solution I。反应条件：16°C 2min ;4°C 过夜。
[0023] 4)大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70°C冻存的大肠杆菌T0P10感受态细胞在冰上 融化；取5 μ L纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100 μ L感受态细胞中，并轻轻混匀， 冰浴30min左右；42°C水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min ;加入800 μ L LB液体培养 基，37°C &100rmp摇菌Ih ;4000rmp离心3min，吸掉上层800 μ L培养基，混勾剩余菌液；将 菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37 °C倒置培养过夜。
[0024] 5)阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基 中，37°C&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反 应体系（20.0 μυ:2· OyL 10XPCR BuffeKMg2+free)，1.2 yL MgCl2 (25mM)，1.6 yL dNTP Mixture (each 2. 5mM), LOyL 3' RACE gene specific inner primer (10 μ M), I. 0 μ L 3' RACE Inner Primer (10 μ M)，1.0 yL 菌液，0.2 yL rTaq，12. OyL Milli-Q Water。反 应程序：94°C，3min ;94°C，30sec，6(TC，30sec，72°C，lmin，30cycles ;72°C，7min。菌液 PCR 检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司（上海）测序鉴定。
[0025] (2)5，RACE 反应 I) RNA 处理（RNA Processing) CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10 μ g Total RNA，2 μ L 10Χ CIP buffer,2 μ L Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP), Nuclease-free Water补齐20 μ L。轻混匀，短暂离心；37°C温育lh。加入以下试剂到CIP反应离心管： 15 μ L Ammonium Acetate Solution，115 μ L Nuclease-free Water,150 μ L acid phenol:chloroform。充分祸旋，室温高速离心（兰10000 g) 5min。转移上层水相到一个 新的离心管中，加入150yL氯仿，充分涡旋，室温高速离心（兰10000 g)5min。转移上 层水相到一个新的离心管中，加入150 μ L异丙醇，充分祸旋，冰浴lOmin。最大转速离心 20min，用0. 5ml预冷的70%乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀。以 11 μ LNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP' RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或 者-20°C保存。TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5yL CIP'd RNA (from f above), IyL 10X TAP buffer,2 yL Tobacc