专利名称：总dna导入培育富集重金属转基因植物的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和环境保护技术领域。具体涉及一种利用总DNA导入技术培育富集重金属转基因植物的方法。
背景技术：
1.金属污染问题重金属污染问题已成为一个世界性重大环境问题，重金属污染不仅威胁动植物、微生物生长发育，还通过食物链等威胁人类健康乃至生命。导致土壤污染的重金属主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn等，一般为几种重金属的复合污染。目前我国受重金属污染的耕地面积近2000万hm，约占耕地总面积的1/5，其中工业“三废”污染1000万hm2，农田污灌面积已达130多万hm2。每年因土壤污染而导致粮食减产1000万吨，直接经济损失达100多亿元。重金属矿区、经济高速发展区的重金属污染情况尤为严重，广东北部7％的农田重金属污染情况严重，重金属是华南主要水系—北江水质严重恶化的主要因素之一，珠江三角洲地区土壤和蔬菜的重金属(Cu、Zn、Cd、Hg、As等)超标率分别达70％和50％以上，我国许多农产品正是因为重金属超标而被拒绝进入国际市场，我国加入WTO后这一问题将更显突出。
2.金属污染的植物修复技术各国对重金属污染的生态效应和防治的研究越来越重视，已探索出多种治理技术。然而传统的重金属污染治理技术如土壤固化、玻璃化、淋滤法、洗土法、客土法、电化学法等物理化学方法，不仅成本高昂，难以大规模使用，而且常常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，寻求一种廉价而永久有效，又可以维持土壤肥力的替代方法一直是国际上研究的难点和热点。植物修复(phytoremediation)技术的出现正好适应了上述要求。
1977年，Brooks提出了超富集植物(hyperaccumulator)的概念。所谓超富集植物是指地上部富集的重金属远超过普通植物承受的量，地上部的重金属含量应明显高于根部的植物。由于各种重金属在地壳中的丰度及在土壤和植物中的背景值存在较大差异，对不同重金属，其超富集浓度界限也有所不同，目前一般把植物地上部(干重)中含Hg达10μg/g，Cd达100μg/g，Co、Cu、Ni、Pb达1000μg/g，Mn、Zn达10000μg/g以上的植物称为超富集植物。1983年Chaney提出了利用超富集植物清除土壤重金属污染的思路，并发展成为一门新兴的环境技术一植物修复。植物修复是利用自然生长的或者通过遗传工程培育的植物种植于污染环境中，通过植物系统及其根际微生物群落将污染物移除、挥发或转变的技术，于九十年代逐步被应用于Zn、Cu、Ni、Cd、As等重金属污染土壤的修复。
植物修复作为一种“绿色”的污染治理手段，即有着较高的生态效益，易于被大众接受，同时也显示了巨大的商业化前景。2000年美国植物修复市场约1亿美元，美国Viridian环境公司对加拿大Ontario镍污染土壤修复的金属回收收入就达2500美元/公顷年，Salt等估计2000年它在北美和欧洲占有4亿美元的市场。据估计，未来5年中，国际植物修复市场将达20亿美元。
3.植物修复技术的局限性由于植物修复在很大程度上依赖重金属超富集植物，在实际应用中还存在以下限制。
(1)超富集植物种类少，通常植株矮小、生物量低、生长缓慢、生长周期长，因而修复效率低，不易于机械化作业。目前世界上报道的超富集植物有400余种，但其中350种都是Ni超富集植物，As超富集植物只有1种，Cu超富集植物虽有25种，但其中24种都分布在扎伊尔境内，由于战乱原因，现已无法进行深入研究和利用。
(2)一种超富集植物往往只吸收一种或少数几种重金属元素，对土壤中其它浓度较高的重金属则表现出某些中毒症状，从而限制了植物修复技术在多种重金属污染土壤治理方面的应用。
4.与植物修复有关的分子生物学和基因工程研究进展针对上述植物修复存在的不足，有人们设想将超富集植物中富集重金属相关基因转入其它植物基因组中，以培育更多更好的富集或超富集重金属的植物。遗憾的是迄今对超富集植物富集重金属的分子机制知之甚少，唯一取得一定进展的遏蓝菜属(Thlaspi)植物。从Zn超富集植物T.caerulescens克隆到Zn(Cd)转移蛋白ZNT1、ZNT2、ZNT4、ZNT5、ZTP1、ZNT1-LC基因、Fe(II)转移蛋白irtl-G基因；从Ni超富集植物T.goesingense克隆到金属离子转移蛋白MTP1、咪唑甘氨酸磷酸脱水酶THB1和组氨醇脱氢酶THD1基因的部分序列，尚没有利用这些基因转化植物的报道。从上述初步结果可知，超富集和生物的许多其它性状一样是一个涉及多基因的过程。同时研究还显示，在同属非富集植物T.arvense中也存在ZNT1基因，且在低Zn浓度下表达，在较高Zn浓度下受抑制；ZNT1与拟南芥的Zn转移蛋白ZIP4基因和Fe转移蛋白IRT1基因，MTP1与拟南芥的Zn转移蛋白ZAT基因有显著的序列一致性，这暗示超富集植物与非富集植物的差异可能不在于有没有重金属富集的相关基因，而在于基因的表达调控上的差异。可见，试图通过常规基因工程途径，转一、二种基因就获得新型超富集植物，将是比较困难的。
转基因植物用于重金属污染修复最有希望的例子是表达merA和/或merB基因的拟南芥和烟草，它们可有效地将土壤中剧毒的甲基汞转变为毒性较低的挥发态汞。遗憾的是merA、merB基因都来自细菌，它们赋予转基因植物转变汞、而非积累汞的性能。不过这提醒人们要重视非植物来源的基因资源。
除了超富集植物，还有许多植物、动物、微生物对重金属有一定富集作用或耐受性，分子生物学研究发现金属硫蛋白(metallothionein，MT)、植物络合素(phytochelatin，PC)两类物质在其中起重要作用。各种MT基因和PC合成酶基因已被克隆出来，用转基因技术提高植物MT或PC的表达量，植物对重金属的耐受性或富集能力也相应增强。然而，MT、PC与超富集的关系，MT、PC转基因植物用于植物修复的前景怎样？尚不得而知。
5.关于总DNA导入技术总DNA导入技术，即把供体生物的总DNA抽提出来，导入受体植物组织、细胞中并发育再生成新的个体，这些个体带有某些供体性状。这是上海生化所周光宇等1989获得国家科技进步二等奖“农作物遗传操纵新技术—授粉后外援DNA导人植物的生物工程育种”的一部分，在其前后，国内外多位科学家应用并改进这一技术。总DNA导入有花粉管通道法、子房注射法、种胚注射法、浸种法等，已成功地将不同供体的总DNA导入烟草、水稻、棉花、小麦、辣椒等，获得相应转基因植物，但是，迄今还没有通过总DNA导入技术获得富集或超富集重金属的转基因植物的报道。该法理论上适用于所有显花并结实的植物，对于尚未克隆基因、或尚未建立组织细胞培养及转化系统、或希望同时导入多个基因的研究具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的是对总DNA导入技术作一些改进，并用这一技术培育富集重金属的转基因植物新品系或品种，以期进一步用于重金属污染土壤的植物修复。
本发明的技术方案包括以下步骤(1)选择已证实为重金属超富集植物作为供体植物，选择生物量大、生长快、适应性广的植物作为受体植物。
(2)用CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)法提取超富集植物的总DNA。DNA溶于TE缓冲液。
(3)用琼脂糖凝胶电泳观察DNA的提取效果，测OD260值并计算DNA浓度。
(4)DNA经限制性内切酶(如BamHI、EcoRI等)部分消化或超声波轻微处理，使之显现10-50kb片段占主要成分。
(5)用液体授粉法、花粉管通道法或/和子房注射法将DNA溶液注入受体植物未成熟子房，每种处理达到1000朵以上花，收获种子；或者用种胚注射法或/和浸种法，每种处理达到1000粒以上种子，种植并收获种子。每朵花或每粒种子注入DNA量1-10μg。
(6)收获的种子，播种于含重金属(达到抑制处理前原型植物生长的浓度)的培养基或土壤中，筛选生长旺盛的植株进行转基因分析和重金属富集试验，转化率为0.1-1％。
(7)对初选的转基因植株留种，进一步种植，观察测定重金属富集能力，用随机扩增片段多态性(RAPD)、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或/和特异DNA片段序列分析等分子生物学手段确定转化基因(transgene)的存在、表达特性和遗传稳定性。
(8)将上述转基因植物用于重金属污染土壤的植物修复试验，选择富集重金属能力比转基因前原型植物提高5倍以上，即富集Cd、Co、Cu、Ni、Pb达100μg/g植物干重以上，或者富集Mn、Zn、As达1000μg/g植物干重以上的植株确定为富集重金属的转基因植物。
本发明具有以下有益效果1.本发明采用总DNA导入技术，可以克服重金属超富集相关基因来源有限、单一基因难以赋予转基因植物理想的富集生重金属能力、缺乏重金属超富集相关基因的调控序列、尚未建立植物组培转化系统等难点；2.本发明在植株或种子水平上进行DNA导入操作，与农杆菌共培养法植物转化相比，避免了重金属富集相关基因克隆、植物表达载体构建、植物组织培养再生等复杂工作，简便易行，有利于节约时间和降低研究成本，以最快速度获得富集甚至超富集重金属的植物新种或新品种；3.远缘杂交和体细胞融合也可实现不同科、属、种植物间遗传性状转移。但不同植物配子或细胞间亲和性差往往是其成功的主要限制因素。总DNA导入技术则不受亲和性影响，理论上可以将供体遗传性状转入任何开花并结实的植物中，故通过这一途径可以获得更多更好的重金属富集或超富集植物。即使转基因植物不能达到超富集水平.但由于它们生长快、生物量通常比超富集植物大10倍以上，也将在重金属污染环境的植物修复中发挥重要作用。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1.Zn超富集植物T.caerulescens总DNA导入长喙田菁(Sesbania rostrata)获得富集Zn的转基因长喙田菁遏蓝菜属植物T.caerulescens是发现最早、重金属富集分子生物学研究得最深入的一种超富集植物，其地上部分富集Zn可达干重的10000ppm以上，富集Cd、Ni可达干重的1000ppm以上，但它的致命弱点是生物量小、生长缓慢，二年才长到10-20cm高，每亩地上生物量约170公斤！长喙田菁是一种可产生固氮根瘤和茎瘤的豆科植物，速生，6个月可长至2-3米高，生物量较大，每亩超过5000公斤，且有一定重金属耐性。通过总DNA导入技术将T.caerulescens富集Zn性状转至长喙田菁，无疑具有重大理论和现实意义。
(1)用CTAB法提取超富集植物T.caerulescens的总DNA。具体操作如下。称取10g超富集植物新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末，装入50ml离心管，加入10ml 2XCTAB缓冲液(2％CTAB，100mM Tris-Cl pH8.0，20mM EDTA，1.4M NaCl)，混匀，置65℃水浴放置45分钟，加入等体积氯仿/异戊醇(24/1)，轻轻振荡2分钟，10000转/分离心5分钟，上相转入新管中，加入2/3体积异丙醇，混匀后立即以10000转/分离心5分钟，弃上清液，用75％、95％乙醇各洗沉淀一次，真空抽干，沉淀溶于1ml TE(10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA)中。
(2)琼脂糖凝胶电泳观察DNA的提取效果，测OD260值，计算DNA浓度。
(3)DNA经限制性内切酶(如BamHI、EcoRI等)部分消化或超声波轻微处理，使之显现10-50kb片段占主要成分，用TE缓冲液调整DNA浓度至0.5mg/ml。
(4)用液体授粉法(将长喙田菁花粉悬浮于DNA溶液中，再滴加到长喙田菁柱头上)、花粉管通道法(将DNA溶液滴在长喙田菁授粉后10-20小时的柱头上)、子房注射法(用微量注射器将DNA溶液注入长喙田菁未成熟子房)将T.caerulescens总DNA导入长喙田菁未成熟子房，每种处理达到1000朵以上花，收获种子；或者用种胚注射法(用微量注射器将DNA溶液注入长喙田菁吸水膨涨的种胚)、浸种法(将长喙田菁种子在DNA溶液中浸泡膨胀，划破种皮并施以真空抽吸30)分钟)，每种处理达到2000粒种子，种植并收获种子。每朵花或每粒种子注入DNA量1-10μg。
(5)收获的长喙田菁种子播种于含Zn培养基或土壤中(Zn浓度达到抑制未处理前原型长喙田菁生长的浓度)，筛选生长旺盛的植株进行转基因分析和Zn富集鉴定，共处理2000朵花，收获其后代种子10000粒播种后，初步显示32株长喙田菁对Zn抗性明显提高，转化率为0.32％；注射和浸种处理的2000粒种子播种后，初步显示5株黑麦草对Zn抗性明显提高，转化率为0.25％。
(6)对初选的转基因长喙田菁植株留种，进一步种植，观察测定Zn富集能力，用随机扩增片段多态性(RAPD)、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、序列分析等分子生物学手段确定转化基因(transgene)的存在、表达特性和遗传稳定性。
(7)将上述转基因长喙田菁用于Zn污染土壤的植物修复试验，其富集Zn能力达到1000μg/g植物干重。实施例2.Ni超富集植物T.goesingense总DNA导入黑麦草(Lolium multiflorum)获得富集Ni的转基因黑麦草遏蓝菜属植物T.goesingense是发现于奥地利的一种野生植物，其地上部分富集Ni可达干重的12300ppm以上，对Cd、Co、Zn也有一定富集作用，但它的致命弱点与T.caerulescens一样，生物量低、生长缓慢、生长周期长。黑麦草适应性广，抗逆性强(耐干旱、瘠薄、盐碱、严寒等)，据我们观察对铜锌还有一定耐受性，其根系发达，分蘖力强，生长迅速，产量高。出苗后30-35天，植株高24-30厘米，即可首次刈割利用，全年刈割4-6次，每亩可收5000公斤。通过总DNA导入技术将T.goesingense富集Ni性状转至黑麦草，具有植物修复实际意义。
(1)用CTAB法提取超富集植物T.goesingense的总DNA，操作步骤同实施例1(1)。
(2)琼脂糖凝胶电泳观察DNA的提取效果，测OD260值，计算DNA浓度。
(3)DNA经植物稀有的限制性内切酶(如BamHI、EcoRI等)消化或超声波处理，使之显现10-50kb片段占主要成分，用TE缓冲液调整DNA浓度至0.5mg/ml。
(4)用液体授粉法(将黑麦草花粉悬浮于DNA溶液中，再滴加到黑麦草柱头上)、花粉管通道法(将DNA溶液滴在长喙田菁授粉后10-20小时的柱头上)将T.goesingense总DNA导入黑麦草未成熟子房，每种处理达到3000朵花，收获种子；或者用种胚注射法(用微量注射器将DNA溶液注入黑麦草吸涨的种胚)、浸种法(将黑麦草种子在DNA溶液中浸泡膨胀，划破种皮并施以真空抽吸30分钟)，每种处理达到3000粒种子，种植并收获种子。每朵花或每粒种子注入DNA量1-10μg。
(5)黑麦草种子播种于含Ni培养基或土壤中(Ni浓度达到抑制原型黑麦草生长的浓度)，筛选生长旺盛的植株进行转基因分析和Ni富集鉴定。共处理3000朵花，收获其后代种子30000粒播种后，初步显示113株黑麦草对Ni抗性明显提高，转化率为0.38％；注射和浸种处理的3000粒种子播种后，初步显示7株黑麦草对Ni抗性明显提高，转化率为0.23％。
(6)对初选的转基因黑麦草植株留种，进一步种植，观察测定Ni富集能力，用随机扩增片段多态性(RAPD)、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、序列分析等分子生物学手段确定转化基因(transgene)的存在、表达特性和遗传稳定性。
(7)转基因黑麦草用于重金属污染土壤的植物修复试验，转基因黑麦草富集Ni能力达100μg/g植物干重。实施例3.As超富集植物蜈蚣草(Pteris vittata)总DNA导入紫云英(Astragalus sinicus)获得富集As的转基因紫云英蜈蚣草是Ma及我国科学家陈同斌等新近发现的一种超富集As的蕨类植物，它的叶部在5周内富集As达22630ppm。蜈蚣草是迄今发现的唯一As超富集植物，且只在温带以南生长，这限制了它的应用范围。紫云英是一种适应性较广的豆科植物，生长快、生物量大、固氮性能良好，耐瘠薄，1亩紫云英，生长4-6个月，地上台鲜重达5000公斤，能固氮10kg，相当于22～23kg尿素。通过总DNA导入技术将蜈蚣草富集As的性状转至紫云英，具有广阔应用前景。
(1)用CTAB法提取超富集植物As超富集植物蜈蚣草的总DNA，操作步骤同实施例1(1)。
(2)琼脂糖凝胶电泳观察DNA的提取效果，测OD260值，计算DNA浓度。
(3)DNA经限制性内切酶(如BamHI、EcoRI等)部分消化或超声波处理，使之显现10-50kb片段占主要成分，用TE缓冲液调整DNA浓度至0.5mg/ml。
(4)用液体授粉法(紫云英花粉悬浮于DNA溶液中，再滴加到紫云英柱头上)、花粉管通道法(DNA溶液滴在紫云英授粉后10-20小时的柱头上)、子房注射法(用微量注射器将DNA溶液注入紫云英未成熟子房)将蜈蚣草总DNA导入紫云英未成熟子房，每种处理达到3000朵以上花，收获种子；或者用种胚注射法(用微量注射器将DNA溶液注入紫云英吸涨的种胚)、浸种法(将紫云英种子在DNA溶液中浸泡膨胀，划破种皮并施以真空抽吸30分钟)，每种处理达到3000粒以上种子，种植并收获种子。每朵花或每粒种子注入DNA量1-10μg。
(5)紫云英种子播种于含As的培养基或土壤中(As浓度达到抑制原型紫云英生长的浓度)，筛选生长旺盛的植株进行转基因分析和As富集鉴定。共处理3000朵花，收获其后代种子40000粒插种后，初步显示102株紫云英对As抗性明显提高，转化率为0.26％；注射和浸种处理的3000粒种子播种后，初步显示5株紫云英对As抗性明显提高，转化率为0.17％。
(6)对初选的转基因紫云英植株留种，进一步种植，观察测定As富集能力，用随机扩增片段多态性(RAPD)、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、序列分析等分子生物学手段确定转化基因(transgene)的存在、表达特性和遗传稳定性。
(7)转基因紫云英用于As污染土壤的植物修复试验，转基因紫云英富集As能力达1000μg/g植物干重以上。
权利要求
1.一种总DNA导入培育富集重金属转基因植物的方法，其特征是包括以下步骤(1) 选择已证实为重金属超富集植物作为供体植物，选择生物量大、生长快、适应性广的植物作为受体植物；(2)用CTAB法提取超富集植物的总DNA。DNA溶于TE缓冲液；(3)用琼脂糖凝胶电泳观察DNA的提取效果，测OD260值并计算DNA浓度；(4)DNA经限制性内切酶部分消化或超声波轻微处理，使之显现10-50kb片段占主要成分；(5)用液体授粉法、花粉管通道法或/和子房注射法将DNA溶液注入受体植物未成熟子房，每种处理达到1000朵以上花，收获种子；或者用种胚注射法或/和浸种法，每种处理达到1000粒以上种子，种植并收获种子每朵花或每粒种子注入DNA量1-10μg；(6)收获的种子，生长旺盛的植株进行转基因分析和重金属富集试验；转化率为0.1-1％；(7)对初选的转基因植株留种，进一步种植，观察测定重金属富集能力，用随机扩增片段多态性、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳或/和特异DNA片段序列分析的分子生物学手段确定转化基因的存在、表达特性和遗传稳定性；(8)将上述转基因植物用于重金属污染土壤的植物修复试验，选择富集重金属能力比转基因前原型植物提高5倍以上，即富集Cd、Co、Cu、Ni、Pb达100μg/g植物干重以上，或者富集Mn、Zn、As达1000μg/g植物干重以上的植株即为富集重金属的转基因植物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是以Zn超富集植物T.caerulescens作为供体植物，以长喙田菁作为受体植物，获得富集Zn的转基因长喙田菁。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是以Ni超富集植物T.goesingense作为供体植物，以黑麦草作为受体植物，获得富集Ni的转基因黑麦草。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是以As超富集植物蜈蚣草作为供体植物，以紫云英作为受体植物，获得富集As的转基因紫云英。
全文摘要
本发明涉及一种利用总DNA导入技术培育富集重金属转基因植物的方法。选择已证实为重金属超富集植物作为供体植物，生物量大、生长快、适应性广的植物作为受体植物；用CTAB法提取供体植物的总DNA；用改进的总DNA导入技术将供体植物DNA导入到受体植物未成熟子房或种胚中，种子播种于含重金属达到抑制处理前原型植物生长的浓度的培养基或土壤中，筛选出富集重金属能力比转基因前原型植物提高5倍以上的植株确定为富集重金属的转基因植物。本发明方法简便易行，不受植物配子或细胞间亲和性影响，可以较低的成本和较快的速度获得更多更好的重金属富集或超富集植物。它将使得“用基因工程手段获得富集重金属的转基因植物”的设想得以实现。
文档编号A01H1/02GK1433676SQ0211476
公开日2003年8月6日 申请日期2002年1月21日 优先权日2002年1月21日
发明者叶长明, 杨中艺, 袁剑刚 申请人:中山大学