一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物技术领域，。

背景技术：

手性纯的环氧化物及其对应的水解产物邻二醇被认为是一类具有高附加值的多功能手性砌块，在手性药物和精细化学品的合成中应用广泛。然而，在一些手性环氧化物的制备过程中，sharpless不对称环氧化、jacobsen环氧化等化学法的反应结果往往无法达到期望的手性纯度，产物(指保留下来的单构型环氧化物和生成的二醇)的对映体过剩率(enantiomericexcess,ee)值通常只有30％～80％，而且所使用的重金属等催化剂也给环境带来巨大的威胁。近年来，生物酶所介导的动力学拆分和对映体归一性水解法因其较为专一的立体选择性而逐渐走进人们的视野，环氧化物水解酶(epoxidehydrolase,eh,ec3.3.2.x)就是其中一类重要的酶，该酶可以催化环氧化物的开环水解，使水分子立体选择性地加成到环氧化物的含氧三元环上，生成相应的1,2-二醇，是一种典型的α/β折叠型水解酶。eh来源广泛、反应无需辅因子、底物谱广、反应条件温和，被认为是一种颇具开发潜力和研究价值的生物催化剂。

目前，人们已经从动物、植物和微生物中发现了300多种eh，并根据酶的亚细胞定位及底物的特异性将其划分为七个亚家族，其中可溶性环氧化物酶是当前研究较多的eh之一。bellucci等研究了存在于哺乳动物体内微粒体环氧化物水解酶的立体化学特性，利用其催化水解一些β烷基取代的环氧苯乙烷衍生物，结果得到对应的r型二醇。胡蝶等从宇佐美曲霉中成功发掘出一种新型的环氧化物水解酶aueh2，发现其对r型环氧苯乙烷(styreneoxide,so)的亲和性较s型的高，认为该酶在外消旋(rac-)so的手性拆分反应中具有很大的应用潜力。较之上述几种来源，植物eh则更加容易获得且原料也较为廉价。当前已经在包括大豆(glycinemax)、木豆(cajanuscajan)、蒺藜状苜蓿(medicagotruncatula)、本氏烟草(nicotianabenthamiana)等植物基因组中确定了编码eh的开放阅读框，其中研究最深入的是马铃薯eh，其晶体结构早在2006年就已通过x射线衍射图谱的解析获得。最近，许建和课题组从绿豆(vignaradiata)中发现的两种eh(mbeha,mbehb)在以对硝基环氧苯乙烷为底物的情况下表现出互补的对映选择性，引起了相关学者的关注。

迄今报道的环氧化物水解酶虽然均具有一定的不对称水解环氧化物的活性，但是目前仅有40余种eh针对于一种或多种环氧化物表现出高的对映选择性(即对映选择率e值>30)，据我们所知，除国外学者研究的马铃薯eh之外，目前尚无植物来源的eh可以高效的拆分rac-so制备高手性纯的r-so，因此，通过分子生物学手段挖掘能够表达具有高选择性的eh基因构建其表达体系，并将其应用于光学纯环氧化物的制备等研究工作具有着重要经济和社会效益。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶pveh2，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述环氧化物水解酶pveh2的基因，基因命名为pveh2，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，该序列全长951bp，编码316个氨基酸。

本发明的第三个目的是提供一种用于生产r-环氧苯乙烷的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达seqidno.2所示的环氧化物水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pet-28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是按如下方法构建的：(1)扩增seqidno.1所示序列，在基因两端引入限制性内切酶ndei和xhoi的酶切位点；(2)用上述两种内切酶分别处理seqidno.1所示序列和表达载体pet-28a(+)，并将上述酶解消化产物在17℃连接过夜，得到重组表达质粒pet-28a(+)-pveh2；(3)将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，即可得到重组菌株e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2。

本发明的第四个目的是提供一种r-环氧苯乙烷的生物转化方法，所述方法是应用seqidno.2所示的环氧化物水解酶，催化外消旋环氧苯乙烷生产手性纯(ee>99％)的r-环氧苯乙烷。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组环氧化物水解酶pveh2按照0.1～0.5u/mg底物的比例溶解于浓度为ph为7.0～8.0缓冲溶液中，在20～35℃下保温10min后加入外消旋环氧苯乙烷，并在相同的条件下进行动力学拆分反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组环氧化物水解酶pveh2按照0.017u/mg底物的比例溶解于浓度为100mmol/l的ph为7.0～7.2的nah2po4-na2hpo4缓冲溶液体系中，在20～35℃下保温10min后加入外消旋环氧苯乙烷，并在相同的条件下进行动力学拆分反应。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶以酶液、具有生物活性的细胞、固体酶制剂的形式应用。

在本发明的一种实施方式中，以表达seqidno,2所示环氧化物水解酶的重组大肠杆菌进行生物转化。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述的重组大肠杆菌活化后按照1％(v/v)的接种量转接至含有0.1mg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基，并在发酵体系的od600值达到0.5～1.0时加入终浓度为0.05～1.0mmol/l的iptg，然后在25℃下培养6～7h，离心、收集菌体，将菌体用于r-环氧苯乙烷的生物转化。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将经过诱导表达的含有重组环氧化物水解酶的菌体或细胞破碎，将上清液或上清液经纯化后的纯酶溶解于浓度为100mmol/l的ph为7.2的nah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.2)缓冲溶液体系中，然后在25℃下保温10min后加入外消旋环氧苯乙烷，进行动力学拆分反应。

本发明还提供所述生产r-环氧苯乙烷的重组大肠杆菌在食品、生物、化工领域的应用。

本发明的有益效果：(1)本发明发现一种环氧化物水解酶基因pveh2，其核苷酸序列如seqidno.1所示，该基因编码一种新型的环氧化物水解酶pveh2，其氨基酸序列如seqidno.2所示；(2)本发明发现了由seqidno.1所示环氧化物水解酶基因表达的重组酶的新应用；与其它来源的环氧化物水解酶相比，催化的专一性更强；(3)本发明构建的重组大肠杆菌作为催化剂进行生物转化，可以以外消旋环氧苯乙烷为底物，经对映体选择性水解生产手性纯(ee>99％)的r-环氧苯乙烷，产率由原先报道的马铃薯eh的45.6％提高至49.3％。

附图说明

图1为本发明的重组表达载体pet-28a(+)-pveh2的物理图谱。

图2为12％sds-page图谱，其中，m为蛋白分子量marker；1为e.colibl21(de3)；2为未经过诱导的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2；3为经0.2mmol/liptg诱导的e.colibl21(de3)//pet28a(+)-pveh2。

图3为重组环氧化物水解酶对外消旋环氧苯乙烷的水解反应进程；其中，—▼—为底物so的对映体过量率ees；—▲—为转化率c；—●—为s-so；—■—r-so。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述：

各构型环氧苯乙烷的浓度利用手性气相毛细色谱柱(cyclosil-b,agilent公司)进行检测，测定方法、转化率及ee值的计算参见2016年公开的《新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性》。

环氧化物水解酶的测定：取250μlpveh2粗酶液或纯酶液或表达有pveh2的菌体悬浮液加入到225μl磷酸钠缓冲液中并混匀，置于25℃下预热10min，再加入25μlrac-so(母液浓度为200mmol/l，溶解于甲醇)，使催化体系中底物so的初始浓度为10mmol/l，反应期间每10min从体系中取200μl至1ml乙酸乙酯(含1mmol/l正己醇作为内标物)中萃取，上层有机相利用气相色谱法进行检测。酶活定义为每分钟环氧化物水解酶催化1.0μmol的环氧苯乙烷水解或生成1.0μmol的苯乙二醇所需要的酶量为1u。

实施例1环氧化物水解酶基因的克隆及表达质粒的构建

提取菜豆的总rna(使用trizol试剂盒，invitrogen公司)，参照试剂盒说明书进行操作。反转录过程参照takara公司的rt-pcr试剂盒pcrprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)说明书，然后以反转录得到的cdna为模板，上、下游引物序列分别为seqidno:3和seqidno.4(引物中引入ndei和xhoi限制性内切酶酶切位点，引物均由上海生工有限公司合成)，采用常规pcr方法扩增pveh2全长基因，其核苷酸序列如seqidno.1，pcr反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，再在72℃下延伸10min。pcr产物用1.0％琼脂糖核酸凝胶电泳检测与纯化后用dna胶回收试剂盒(上海生工)回收目的片段，回收产物和表达载体pet-28a(+)经相同的限制酶的处理之后，用t4dna连接酶将两者在17℃下过夜连接，得到重组表达载体pet-28a(+)-pveh2，并将其导入到e.colibl21(de3)的感受态细胞内，涂布于含有0.1mg/ml硫酸卡那霉素的lb平板上，37℃培养16h，挑取阳性克隆，转接于含有相同卡那霉素含量的lb液体培养基中振荡培养，提取质粒并用ndei和xhoi进行双酶切鉴定，pveh2序列如序列图seqidno.1所示，所推导的氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例2环氧化物水解酶pveh2的制备

将实施例1中的基因工程菌e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2接种于lb液体培养基(含0.1mg/ml硫酸卡那霉素)中，37℃培养10～16h(优化的，为12h)，然后再以1％(v/v)的接种量转接于含有相同成分的lb培养基内继续扩大培养，当菌体浓度od600值达到0.8～1.0(优化的，为0.8)时加入iptg至其终浓度为0.2mmol/l，在25℃下诱导培养4～9h(优化的，为7h)后4℃下8000r/min离心5min，收集菌体沉淀，依照上述步骤每100ml培养基可以发酵得到0.5～0.8g的湿菌体。菌体细胞的sds-page分析结果如图2所示，目的蛋白的表观分子约为37.9kda。。

实施例3环氧化物水解酶pveh2在制备手性环氧苯乙烷中的应用

将实施例2中经离心获得的湿菌体按照每g对应10mlnah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.2)缓冲液的比例重新混悬，菌细胞悬液直接作为生物酶催化剂，以外消旋环氧苯乙烷为底物进行转化，制备r型环氧苯乙烷。具体操作为：在10ml的ep塑料管内加入2.5ml菌细胞悬液(菌浓50mg/ml，活力为0.04u/ml)、2.25ml缓冲液、0.25ml浓度为200mmol/l的外消旋环氧苯乙烷(在催化体系的终浓度为10mmol/l)，在25℃振荡的条件下转化120min，最后加入相同体积的乙酸乙酯进行萃取及终止反应。

pveh2在上述条件下对于环氧苯乙烷的反应进程如图3所示。经检测，反应40min时ees已超过70％，转化率达到42％；反应80min时转化率达45％；反应完全时得到ee>99％的r型环氧苯乙烷，产率达到49.3％(手性拆分的理论产率为50％)。

对照例1

按实施例2的方法制备pveh2酶，区别在于，当发酵体系od600值达到1.5时，在30℃下加入0.5mmol/l的iptg诱导培养6h时，所产的重组pveh2基本以无酶学活性的包涵体形式存在。

对照例2

按实施例3的方法利用重组pveh2对外消旋环氧苯乙烷进行生物转化，区别在于，转化过程控制温度为35℃，受到底物较强的自水解作用的影响，导致当反应70～75min时，s-so水解完全，得到97.6％ee的r-so，其最终产率仅为32.4％。此外，重组pveh2在40℃条件下保持1h后，其残余活力仅为原酶的8.3％。

对照例3

其它来源的eh酶水解制备r-so的效果如表1所示。

表1不同来源的环氧化物水解酶在rac-so动力学拆分中保留r-so的效果

以上所述的仅为本发明较佳实施例，并非以此来限定本发明的范围，上述实施例还可以进行进一步的优化。即凡是依据本发明所申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效的变化与修饰，皆为本发明申请的权利要求的保护范围。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用

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