有效的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的制作方法
本申请根据35U.S.C.§119(e)的规定要求2014年3月27日提交的美国序列号61/971,410的优先权权益，该申请的全部内容以引用方式整体并入本文中。
政府权利声明
本发明部分地在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R43ES025598号基金的政府资助下进行。政府对本发明享有一定的权利。
背景
发明领域
本发明一般涉及化合物，更具体地说涉及抑制可溶性环氧化物水解酶(sEH)的化合物以及制备和使用所述化合物的方法。
背景信息
可溶性环氧化物水解酶(sEH，EC 3.3.2.10)是一种哺乳动物中由Ephx2基因编码的双功能酶。sEH发现于细胞溶质和细胞溶质的过氧化物酶体部分，将特定环氧化物(包括环氧脂肪酸)水解成相应1，2-二醇，同时所述蛋白的不同区还具有脂类磷酸盐磷酸酶活性。
环氧脂肪酸(EpFA)，来自花生四烯酸级联中的细胞色素P450(CYP450)路径的代谢物，是重要的脂质介质。环氧二十碳三烯酸(EET)、环氧二十碳四烯酸和环氧二十二碳五烯酸，其分别是来自CYP450路径的花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的环氧化物代谢物，已经证明具有抗炎、血管调节(vasoregulatory)、止痛和血管生成作用。
EpFA主要被sEH显著代谢成它们相应的1，2-二醇，这降低它们的活性。因此，通过抑制sEH使体内EET稳定可以通过使体内EET稳定来抗炎、抗高血压和止痛。因此，sEH是重要的药物靶标。
大部分糖尿病患者将最终发展成肾衰竭、高血压和/或中风。此外，约65％的糖尿病患者将发展成外周神经病。除许多其它并发症之外，患有糖尿病性神经性疼痛的人经历自发性疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛，极大地影响患者的生活品质。有人认为，高血糖是引发导致疼痛的外周神经纤维变性的起始原因。然而，积极的血糖控制只能控制神经元退化的进展，但不能逆转神经病变。虽然可利用糖尿病性神经病变的半有效治疗，包括三环类抗抑郁药和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，但它们有副作用，限制了它们的使用。因此，需要一种没有或大大减少副作用的替代疗法。
最近的研究表明，可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂在糖尿病性神经性疼痛模型中是止痛剂。结果表明，sEH抑制剂是更有效的，有用的，而且比临床批准药物加巴喷丁(gabapentin)具有更少副作用。
这些年来，若干团体报道具有不同中心药效基团的sEH抑制剂(效能从微摩尔到纳摩尔范围变动)的合成和评价，所述药效基团包括但不限于酰胺、氨基甲酸酯和脲。二取代脲是用于抑制sEH的有效中心药效基团之一，因为尿素氮与活性残基Asp337形成紧密氢键键合，且该化学容易接近。
许多最有效的化合物的物理性质一般都较差。为改进物理性质(包括水溶性、亲水性)、降低clogP和降低熔点而作的努力一般造成效能降低以及更不理想的药代动力学。这还可能导致吸收差，较差的药代动力学性质，并可能需要大剂量(heroic)配制。因此，有必要进一步优化结构，改进其物理性质，可以使药物配制过程变简单并改进带有二取代脲作为中心药效基团的sEH抑制剂的口服生物利用度。
证据强烈表明，抑制剂在靶标酶上的滞留时间(t1/2)是影响体内功效的最重要参数之一。具有长滞留时间的抑制剂对靶标酶的作用时间长，在体内转化的功效长。然而，至今报导的大部分sEH抑制剂不具有在酶上的最佳滞留时间。在下式(II)的R7处带有甲基的sEH抑制剂具有短的t1/2，这可以解释其在人中缺乏功效。因此，具有更长滞留时间(t1/2)的sEH抑制剂对于致力于此药学靶标是必要的。
概述
在一个方面，本发明提供结构式(I)化合物，或其光学纯立体异构体或药学上可接受的盐。
其中：
R1选自由以下基团组成的组：三氟甲基-或三氟甲氧基-；
R2选自由以下基团组成的组：H-或F-；
R3选自由以下基团组成的组：H-、三氟甲基-或-CH2CO2H；
X选自碳、氮或氧；
Y选自碳、氮或氧；
下标m为0、1或2；以及
下标n为1或2。
在另一个方面，本发明提供结构式(II)化合物，或其光学纯立体异构体或药学上可接受的盐。
其中：
X选自碳或氮；
Y选自碳、氮或氧；
R5选自由以下基团组成的组：三氟甲基-或三氟甲氧基-；
R6选自由以下基团组成的组：H-或F-；且
R7选自由以下基团组成的组：1H-吡咯、呋喃、吡喃、四氢吡喃、4，5-二氢呋喃、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、乙基-、异丙基-、环丙基-、2-甲基丁基-和(S)-2-甲基丁基-。
所述化合物包括其所有药学上可接受的衍生物，诸如盐、前药、软药(soft drug)、溶剂化物和水合物。
某些实施方案还提供药物组合物，其包含一种或多种本文中公开的化合物，连同药学上可接受的载剂，以及制备和使用所述化合物和组合物的方法。
在另一方面，本发明提供一种抑制可溶性环氧化物水解酶的方法，包括使可溶性环氧化物水解酶与抑制量的具有上述式(I)或(II)的化合物接触。
在一个相关方面，本发明提供治疗由可溶性环氧化物水解酶调节的疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的具有选自上述式(I)或(II)的式的化合物。在一个方面，所述有效量是治疗有效量。
在另一方面，本发明提供一种通过在X处并入杂原子来增加式(I)化合物水溶性的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R7处并入杂环来增加式(II)化合物水溶性的方法。
在另一方面，本发明提供一种通过在R2处并入氟来降低式(I)化合物熔点的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R6处并入氟来降低式(II)化合物熔点的方法。
在另一方面，本发明提供一种通过在X处并入氧且下标m为0、1或2以及n为1或2来增加式(I)化合物在pH 1-7范围时的水溶性的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R7处并入杂环来增加式(II)化合物在pH 1-7范围时的水溶性的方法。
在另一方面，本发明提供一种通过在R1处并入三氟甲氧基-来增加式(I)化合物在可溶性环氧化物水解酶上的滞留时间(t1/2)的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R5处并入三氟甲氧基-以及在R7处并入异丙基-、环丙基-、2-甲基丁基-或(S)-2-甲基丁基-来增加式(II)化合物在可溶性环氧化物水解酶上的滞留时间(t1/2)的方法。
在另一方面，本发明提供一种监测可溶性环氧化物水解酶(sEH)的活性的方法。所述方法包括使可溶性环氧化物水解酶与足以产生所述可溶性环氧化物水解酶的光学荧光的可检测变化的量的式(I)或(II)化合物接触，所述可检测变化通过与存在于所述sEH催化位点中的一个或多个色氨酸残基相互作用而产生。
在另一个方面，本发明提供一种治疗受试者中的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的具有选自上述式(I)或(II)的式的化合物。在实施方案中，所述疾病或病症是疼痛，诸如糖尿病性神经性疼痛、炎症性疼痛或术后疼痛。在一些实施方案中，神经性疼痛可能是由于糖尿病(不管是先天或其它形式)或者其它类型神经系统病症造成的神经损伤的结果，这种损伤由外力(诸如事故、手术或疾病状态，包括感染)或用于治疗另一种病痛的药物引起。在相关实施方案中，所述疾病是癫痫病症。
附图简述
图1是显示式(II)的R7处连接的不同杂环的偶极矩关系的图表且它与如表II中所示得到的提高的溶解度不相关。
图2是显示式(II)的R7处连接的不同杂环的实验logP关系的图表且它与如表II中所示得到的提高的溶解度不相关。
图3是显示所选择的抑制剂在pH 7.4时的溶解度的图表。
图4是显示所选择的抑制剂在pH 3.0时的溶解度的图表。
图5是显示所选择的化合物在pH 3.0时的溶解度随它们的效能(Ki)而变化的曲线图。
图6是显示具有提高的类药性的抑制剂的抗疼痛反应效果的图表，且这些抑制剂具有比临床批准的药物加巴喷丁在100x剂量下好得多的体内功效。
图7是显示sEH抑制剂(0.3mpk，皮下注射)相对于皮下戊四氮的抗惊厥功效的图表)。在五种基于1，3-二取代脲的sEH抑制剂中，化合物29延迟了野生型Swiss小鼠癫痫发作(seizure)的强直期发作(*＝p＜0.05)。
图8是显示sEH抑制剂对CNS保护作用的图表。几种sEH抑制剂防止小鼠死于PTZ诱导的癫痫发作。
图9是显示化合物1和29的溶解度随pH增加而增加的一系列图表。
详述
缩略语和定义
“环氧化物水解酶”(“EH”；EC 3.3.2.3)是α/β-折叠水解酶家族中向称为环氧化物的3元环醚中加入水的酶。
“可溶性环氧化物水解酶”(“sEH”)是一种位于内皮、平滑肌及其它细胞类型中的酶，其将EET转化成称为二羟基二十碳三烯酸(“DHET”)的二羟基衍生物。在Grant等人，J.Biol.Chem.268(23)：17628-17633(1993)中阐述了鼠科sEH的克隆和序列。在Beetham等人，Arch.Biochem.Biophys.305(1)：197-201(1993)中阐述人类sEH序列的克隆、序列和登录号。人类sEH的氨基酸序列还如美国专利第5,445,956号的SEQ ID NO：2所阐述；编码人类sEH的核酸序列如该专利的SEQ ID NO：1的核苷酸42-1703所阐述。在Beetham等人，DNA Cell Biol.14(1)：61-71(1995)中讨论了所述基因的进化和命名法。可溶性环氧化物水解酶表示在啮齿动物和人类之间有超过90％同源性的单个高度保守的基因产物(Arand等人，FEBS Lett.，338：251-256(1994))。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指缓解或消除疾病或它的伴随症状的任何方法。
术语“治疗有效量”是指所施用的化合物的量足以预防或减少待治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状的发展。
术语“调节”是指化合物增加或减少相关活性的功能或活性的能力(例如可溶性环氧化物水解酶)。以各种形式在本文中使用的“调节作用”意图包括与sEH相关的活性的拮抗作用和部分拮抗作用。sEH的抑制剂是例如结合、部分或全部阻断酶活性的化合物。
如本文中所用的术语“化合物”意在不仅包括指定的分子实体，而且还包括它的药学上可接受的、药理学活性衍生物，包括但不限于盐、前药偶联物，诸如酯和酰胺、代谢物等等。
如本文中所用的术语“组合物”意在包括一种包含指定量的指定成分的产物，以及直接或间接地从指定量的指定成分的组合得到的任何产物。“药学上可接受的”意指载剂、稀释剂或赋形剂必须与制剂中的其它成分相容并且对其接受者无害。
本文所定义的“受试者”包括动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、家兔、大鼠、小鼠等等。在一些实施方案中，受试者是人。
如本文中所用，术语“sEH介导的病症或疾病”等等是指特征在于小于或大于正常sEH活性的疾病或病状。she介导的病症或疾病是一种这样的病症或疾病：其中sEH的调节作用导致对以下病状或疾病的某些效果(例如sEH抑制剂或拮抗剂至少在一些患者的患者健康中得到某些改善)。这些病症和疾病可包括癫痫发作，诸如癫痫、肾病、心肌病、高血压、疼痛、炎症、炎症性疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、糖尿病性神经性疼痛、组织创伤或由此而来的疼痛、急性炎症、来自败血症的炎症、胰腺炎、多种外伤，诸如脑损伤，和组织损伤，诸如肌肉系统撕裂伤、脑部手术、出血性休克，以及免疫介导的器官损伤、成人呼吸窘迫综合征、肺气肿、慢性支气管炎、阻塞性肺病、慢性阻塞性肺病(COPC)、小气道疾病、间质性肺病(ILD)、特发性肺纤维化、皮肤病中的灼伤或疼痛，诸如皮炎、化学灼伤、热灼伤、皮肤变红，以及化学诱导的病变、神经痛、由于外伤或对接近皮肤表面的周围神经的刺激所造成的疼痛。
如本文中所用，术语“烷基”是指可以是直链或支链的饱和烃基(例如乙基、异丙基、叔戊基或2，5-二甲基己基)。当所述术语单独使用时和当它用作化合物术语的部分，诸如“芳烷基”、“烷基氨基”和类似术语时，此定义皆适用。在一些实施方案中，烷基是那些含有1至24个碳原子的基团。在本说明书和权利要求中的所有数值范围意在包括它们的上下限在内。低级烷基是指具有1-4个碳原子的烷基。此外，所述烷基和杂烷基可以在烷基或杂烷基上的另外被氢原子占据的任何位置处连接至其它部分(诸如例如2-戊基、2-甲基戊-1-基和2-丙基氧基)。二价烷基可称为“亚烷基”，以及二价杂烷基可称为“亚杂烷基”，诸如本发明中用作连接子的那些基团。烷基、亚烷基以及杂烷基部分还可以任选地被卤素原子或其它基团取代，诸如氧代、氰基、硝基、烷基、烷基氨基、羧基、羟基、烷氧基、芳氧基等等。
术语“环烷基”和“环烯基”是指饱和烃环且包括二环和多环。类似地，具有替换碳环原子的杂原子(例如N、O或S)的环烷基和环烯基可分别称为“杂环烷基”和“杂环亚烷基”。环烷基和杂芳基的实例是例如环己基、降冰片基、金刚烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氧硫代吗啉基等等。环烷基和杂环烷基部分还可以任选地被卤素原子或其它基团取代，诸如硝基、烷基、烷基氨基、羧基、烷氧基、芳氧基等等。在一些实施方案中，环烷基和环烯基部分是那些环中具有3至12碳原子的部分(例如环己基、环辛基、降冰片基、金刚烷基等等)。在一些实施方案中，杂环烷基和杂环亚烷基部分是那些环中具有1至3个杂原子的部分(例如吗啉基、硫代吗啉基、二氧硫代吗啉基、哌啶基等等)。此外，术语“(环烷基)烷基”是指具有连接于烷基部分的环烷基部分的基团。实例是环己基甲基、环己基乙基和环戊基丙基。
如本文中所用的术语“烯基”是指含有一个或多个为双键的不饱和部位的如上所述的烷基。类似地，如本文中所用的术语“炔基”是指含有一个或多个为三键的不饱和部位的如上所述的烷基。
所述术语“烷氧基”是指还带有能够共价连接至另一烃基团的氧取代基的如上所述的烷基(诸如例如甲氧基、乙氧基、芳氧基和叔丁氧基)。
术语“芳基”是指可为单环或稠合在一起的多环的芳族碳环取代基共价连接或连接至一个共同基团，诸如亚乙基或亚甲基部分。类似地，具有替换碳环原子的杂原子(例如N、O或S)的芳基称为“杂芳基”。芳基和杂芳基的实例是例如苯基、萘基、联苯基、二苯基甲基、2，2-二苯基-1-乙基、噻吩基、吡啶基和喹喔啉基(quinoxalyl)。芳基和杂芳基部分还可以任选地被卤素原子或其它基团取代，诸如硝基、烷基、烷基氨基、羧基、烷氧基、苯氧基等等。此外，芳基和杂芳基可以在芳基或杂芳基上的另外被氢原子占据的任何位置处连接至其它部分(诸如例如2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基)。二价芳基为“亚芳基”，且二价杂芳基被称为“亚杂芳基”，诸如本发明中用作连接子的那些基团。
术语“芳基烷基”、“芳基烯基”和“芳氧基烷基”是指分别直接连接至烷基、烯基，或连接至烷基上的氧上的芳基。简而言之，作为如上组合术语的一部分，芳基也意图包括杂芳基。
除非另有说明，否则术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”的术语意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“C1-C6卤代烷基”意图包括三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
如在“含杂原子的烷基”(“杂烷基”)或“含杂原子的芳基”(“杂芳基”)中所用的术语“杂”是指其中一个或多个碳原子被非碳原子，例如氮、氧、硫、磷或硅，通常为氮、氧或硫或那些完全不是非碳原子(例如磺酰胺)替换的分子、键或取代基。类似地，术语“杂烷基”是指含有杂原子的烷基取代基，术语“杂环”是指含有杂原子的环状取代基，术语“杂芳基”和“杂芳族”分别是指含有杂原子的“芳基”和“芳族”取代基等等。杂烷基的实例包括烷氧基芳基、烷基硫烷基取代的烷基、N-烷基化的氨基烷基等等。杂芳基取代基的实例包括吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、喹啉基、吲哚基、嘧啶基、咪唑基、1，2，4-三唑基、四唑基等，以及含杂原子的脂环族基团的实例是吡咯烷子基(pyrrolidino)、吗啉代(morpholino)、哌嗪子基(piperazino)、哌啶子基(piperidino)等。
术语“疏水性基团”或“疏水基”是指降低分子水溶性的基团。在一些实施方案中，疏水性基团是含有至少3个碳原子的基团。
如在“杂原子”中所用的术语“杂”是指除碳或氢之外的任何原子，例如氮、氧、硫、磷或硅。
术语“羧酸类似物”是指具有能够模拟羧酸残基的酸性部分的各种基团。这些基团的实例是磺酸、亚磺酸、磷酸、膦酸、次膦酸、磺酰胺，以及杂环部分，诸如例如咪唑、三唑和四唑。
术语“取代的”是指化合物的一个原子或一个原子团被另一原子或原子团替代。例如，一个原子或一个原子团可以被一个或多个以下取代基或基团取代：卤代基、氰基、硝基、烷基、烷基氨基、羟基烷基、卤代烷基、羧基、羟基、烷氧基、烷氧基烷氧基、卤代烷氧基、硫烷基、芳基、芳氧基、环烷基、环烷基烷基、芳基、杂芳基(其任选地被1个或1个以上，优选地1至3个选自卤代基、卤代烷基和烷基的取代基取代)、芳烷基、杂芳烷基、含有1至2个双键的烯基、含有1至2个三键的炔基、烷(烯/炔)基、卤代基、氰基、羟基、卤代烷基和多卤代烷基(优选地卤代低级烷基，特别是三氟甲基)、甲酰基、烷基羰基、芳基羰基(其任选地被1个或1个以上，优选地1至3个选自卤代基、卤代烷基和烷基的取代基取代)、杂芳基羰基、羧基、烷氧羰基、芳氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基、烷氧基、芳氧基、全氟烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、芳基烷氧基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、叠氮基、硝基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、硫氰基、异硫氰基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基和芳基氨基磺酰基。当术语“取代的”出现在一系列可能的取代基之前时，它是指所述术语适用于该组中每个成员。
术语“未取代的”是指没有原子或原子团替代的天然化合物。
概况
最近数十年来，1，3-二取代脲已成为可溶性环氧化物水解酶(sEH)的有效的中心药效基团之一。然而，具有1，3-二取代脲的sEH抑制剂总是因不良溶解度和高熔点而受困扰，这使它们难以配制并且具有较少类药性(druglikeness)。
溶解度和熔点是影响类药性的重要参数，且配制的容易度极大地受这两种参数的影响。然而，这两种参数难以预测和改变。此外，过去对这两种参数的修改对抑制剂的效能常常具有副作用。
1，3-二取代脲的一端上具有柔性取代基的抑制剂具有较低熔点，这有利于药物配制过程。然而，这些抑制剂一般代谢不稳定且口服生物利用度差。因此，合成了具有受限或刚性取代基的抑制剂，但它们具有高得多的熔点(＞180℃)，这使它们成为较差的药物候选者，并且没有降低所述sEH抑制剂的熔点的任何具体修饰的报导。
sEH的结合袋(binding pocket)有很强疏水性。因此，在nM水平具有很好效能的sEH抑制剂总是在1，3-二取代脲的两端带有疏水性取代基。这些取代基总是导致抑制剂在广泛pH范围内具有非常不良的水溶性。这些性质导致药物配制时的困难和许多问题并且总是导致生物利用度差。
为了提高sEH抑制剂的溶解度，将极性取代基并入sEH抑制剂中。然而，这种并入常常导致对于sEH的效能减少。
已表明滞留时间(t1/2)对体内功效起重要作用，但没有关于增加sEH抑制剂的滞留时间的报导。已报导具有短烷基链的sEH抑制剂具有短的t1/2，这可以解释它们在人类临床试验中缺少体内功效。
对治疗神经疾病而言，可以穿透血脑屏障的抑制剂很重要。然而，很难鉴定可穿过血脑屏障的化合物以及因为不能穿透血脑屏障而受外周限制的化合物。
从某些sEH抑制剂可进一步官能化以提供具有改进的物理性质的更有效的sEH抑制剂的发现推导出本发明。
如本文中所描述，杂环引入抑制剂中增加了sEH抑制剂的水溶性和口服利用度。确定进一步修饰降低熔点并显著地增加对靶标的效能。
化合物
在一个方面，本发明提供结构式(I)化合物，或其光学纯的立体异构体或药学上可接受的盐。
其中：
R1选自由以下基团组成的组：三氟甲基-或三氟甲氧基-；
R2选自由以下基团组成的组：H-或F-；
R3选自由以下基团组成的组：H-、三氟甲基-或-CH2CO2H；
X选自碳、氮或氧；
Y选自碳、氮或氧；
下标m为0、1或2；以及
下标n为1或2。
在另一个方面，本发明提供结构式(II)化合物，或其光学纯立体异构体或药学上可接受的盐。
其中：
X选自碳或氮；
Y选自碳、氮或氧；
R5选自由以下基团组成的组：三氟甲基-或三氟甲氧基-；
R6选自由以下基团组成的组：H-或F-；且
R7选自由以下基团组成的组：1H-吡咯、呋喃、吡喃、四氢吡喃、4，5-二氢呋喃、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、乙基、异丙基、环丙基、2-甲基丁基和(S)-2-甲基丁基-。
所述化合物包括其所有药学上可接受的衍生物，诸如盐、前药、软药、溶剂化物和水合物。
本发明的代表性化合物呈现于下表I中。
表I：sEH抑制剂(物理性质和相对于人类sEH的效能)
缩略语：Mol.Weight：分子量；Sol：溶解度；Ki：亲和纯化的重组人类sEH的抑制常数；elogP：实验log P；clogP：计算log P；-：未测定。
aelogP是通过HPLC法所测定，由摇动烧瓶法测定的4种选定的抑制剂的eLogP来校准。
bclogP是通过来自ChemBioOffice 2012的Cambridge Soft CLogP的CLogP Driver计算所得。
cKi是通过先前公开的FRET位移测定法测量(Lee等人，Anal.Chem.2013，参见实施例53)
d此酶的t1/2定义为根据荧光信号从重组亲和纯化的人类sEH分离的药物降至一半所需要的时间。
在例示性实施方案中，本发明提供来自表I的以下化合物：1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)脲(化合物19)；1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(化合物1)；1-(1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)-3-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)脲(化合物24)；(S)-1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲(化合物26)；和1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)脲(化合物29)。
本发明的某些实施方案还提供药物组合物，其包含一种或多种本文中公开的化合物，连同药学上可接受的载剂，以及制备和使用所述化合物和组合物的方法。
化合物制备
本发明化合物可通过以下显示的通用合成方案中所概述的各种方法制备，所述通用合成方案概括了三种合成路径，每种路径在实施例1中进一步详细论述。
通用合成方案
为了提高溶解度，将杂环在R7处并入抑制剂(式II)。然而，有趣的是，与如式(II)中所示在R7处具有疏水性烷基的式(II)的sEH抑制剂相比，大多数杂环能够在pH 7.4时提高抑制剂溶解度(表II和图3)。
表II：化合物溶解度(在pH 7和pH 3时)
缩略语：Sol：溶解度；Ki：抑制常数；ND：未测定
a药物的溶解度在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中测量
b药物的溶解度在pH 3的乙酸盐缓冲液中测量
不同于所有其它杂环，与式(II)的R7处具有疏水性烷基的sEH抑制剂相比，向sEH抑制剂(式(II))的R7处并入四氢吡喃能够显著提高sEH抑制剂的溶解度(表II和图3；化合物1、8、27和29)。
在R7处由于四氢吡喃而提高的溶解度令人惊奇，因为它与杂环的偶极矩或杂环的实验logP不相关(图1和2)。
令人惊讶的是，与R7处有烷基取代基(乙基、环丙基、2-仲丁基)的式(II)的sEH抑制剂相比，带杂环的sEH抑制剂显示与pH 7的溶解度相比在pH 3(胃酸的pH值)下溶解度提高了至少3倍，同时保持抑制剂效能在单一位数纳摩尔水平(表1和2及图4和5)。
除其它杂环外，R7处有四氢吡喃的sEH抑制剂(式(II))在pH3时显示意料之外的溶解度提高。R7处有四氢吡喃的抑制剂在酸性pH3下的溶解度至少是R7处有烷基的任何其它sEH抑制剂式(II)的5倍，并且这些抑制剂(化合物1、8和27)中的几个在pH 3下的溶解度比可溶性最强的1，3-二取代脲sEH抑制剂(化合物APAU)还要好得多(表II和图4)。这提高了此系列sEH抑制剂的类药性。因为药物吸收的主要器官之一：胃，具有强酸性环境。通过带有四氢吡喃的抑制剂格外提高的pH 3时的溶解度改进它们的吸收和口服生物利用度，满足了该领域的重要需求。
因此，本发明提供一种通过在X处并入杂原子来增加式(I)化合物水溶性的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R7处并入杂环来增加式(II)化合物水溶性的方法。
抑制剂结构的修饰通常对化合物的熔点有小的和明显的随机效应。然而，出乎意料和令人惊讶的是，在式I的R2处和在式II的R6处添加氟原子，将此系列sEH抑制剂的熔点降低平均约20℃，同时效能改进(表I和III)。熔点降低不仅使药物的配制过程变容易而且一般提高药物的口服生物利用度，并减少稳定多晶型物的问题。因此，在工业上一直探索降低高熔点的改进。
表III：化合物熔点(在式(I)的R2位处或在式(II)的R6位处并入氟降低了sEH抑制剂的熔点(℃))
缩略语：Sol：溶解度
a熔点变化＝在芳基的脲上有间位F取代时抑制剂的熔点-原来的抑制剂的熔点。
b效能增强＝原来的抑制剂的Ki/间-F取代的抑制剂的Ki。
在式(II)的R6处的氟取代是独特的，因为在式(II)的R6处包括除氟之外的卤素的取代都增加抑制剂的熔点，且大部分那些取代阻碍抑制剂的效能(表I和图6)。
此外，在这种情况下，在式(I)的R2处或在式(II)的R6处加入氟将sEH抑制剂的效能提高约2倍(表I)。因此，通过增加对靶标的效能，此修饰降低晶体稳定性和增加配制的容易度(如根据熔点降低所示)。
因此，本发明提供一种通过在R2处并入氟来降低式(I)化合物熔点的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R6处并入氟来降低式(II)化合物熔点的方法。
这些不同的方法的组合来改进抑制剂，即在式(II)的R6处并入氟原子和在R7处并入四氢吡喃，得到令人惊讶的超强效能、亚纳摩尔(sub-nanomolar)效能及显著高的水溶性(＞100μg/mL)(化合物27，表2和图3及4)以及较低的熔点(表III)。与所有早先的sEH抑制剂相比，这些修饰显著提高了抑制剂的类药性。
对化合物1和29的pH滴定显示当pH低于4时溶解度显著增加(图9)。
因此，本发明提供了一种通过在X处并入氧且下标m为2以及n为2来增加式(I)化合物在pH 1-7范围时的水溶性的方法。
在一个相关方面，本发明提供一种通过在R7处并入杂环来增加式(II)化合物在pH 1-7范围时的水溶性的方法。
在实施方案中，pH的范围为约1-7、2-5、2-4、3-4或约1、2、3、4、5、6或7。
在式II的R7处并入大的烷基和在R5处并入三氟甲氧基-(例如，化合物26)使抑制剂具有比APAU(t1/2约6分钟)长的滞留时间(t1/2约20分钟)，其显示更佳的体内功效，验证方法的值在本文中公开(表I)。
因此，本发明提供一种通过在R1处并入三氟甲氧基-来增加式(I)化合物对可溶性环氧化物水解酶的滞留时间(t1/2)的方法。
表IV：化合物熔点和Ki(在式(I)的R2位或在式(II)的R6位并入除氟之外的其它取代基增加了sEH抑制剂的熔点(℃))
a熔点变化＝在芳基的脲上有取代时抑制剂的熔点-原来的抑制剂的熔点。
通过标准化学诱导的癫痫发作测定，确定本公开的化合物保护小鼠免于惊厥和相关致死性表明，本发明化合物能够穿过受试者的血脑屏障(实施例52和图7)。
如以下实施例54中所论述，在使用I型糖尿病大鼠的疼痛反应测定中，本公开的化合物胜过注册的用于神经性疼痛的标准药物加巴喷丁和标准sEH抑制剂(化合物APAU)。本公开的化合物更快速达到高的功效水平。此外，本公开的化合物与本领域的标准相比显示出更高的效能和更高的功效(图6)。
此外，本公开的化合物在癫痫发作测定中展示出显著功效，这是由于所述化合物具有穿过血脑屏障的能力，从而容易穿透CNS并保护受试者免于癫痫发作(实施例52)。
方法和治疗用途
已发现sEH抑制剂的施用具有许多有益的应用，如美国专利第8,815,951号、第8,513,302号、第8,399,425号、第8,501,783号、第7,662,910号以及美国专利公开第2015/0065540号和第2015/0017267中所描述，这些专利以引用的方式整体并入本文中。
因此，本发明提供一种抑制可溶性环氧化物水解酶的方法，包括使可溶性环氧化物水解酶与抑制量的具有上述式(I)或(II)的化合物接触。
优选地，抑制剂抑制sEH还不会显著地抑制微粒体的环氧化物水解酶(“mEH”)。优选地，在500μM浓度下，抑制剂将sEH活性抑制至少50％而不会将mEH活性抑制超过10％。优选化合物的IC50(抑制效能或，根据定义，降低50％酶活性的抑制剂浓度)小于约500μM。优选IC50小于500μM的抑制剂，随着IC50降低更优选IC50小于200μM、更优选100μM，且更优选IC50为50μM、40μM、30μM、25μM、20μM、15μM、10μM、5μM、3μM、2μM、1μM或甚至更少。本领域已知测定sEH活性的测定并在本文中其它地方描述。
本文公开的化合物可以作为治疗上可接受的盐存在。本发明包括上文所列的盐形式的化合物，包括酸加成盐。合适的盐包括那些与有机酸和无机酸形成的盐。这些酸加成盐通常是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的盐的盐可在制备和纯化所讨论的化合物时利用。碱加成盐也可以形成并且是药学上可接受的。对于盐的制备和选择的更完全论述，参考Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use(Stahl，P.Heinrich.Wiley-VCHA，Zurich，Switzerland，2002)。
因此，本发明提供一种治疗如本文中定义的sEH介导的疾病或病状的方法。所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的具有选自式(I)或(II)的式的化合物。在一个方面，有效量是治疗有效量。
如本文中所用的术语“治疗上可接受的盐”表示本文中公开的化合物的盐或两性离子形式，其是水或油溶的或可分散的并且是如本文中定义的治疗上可接受的。盐可在最终分离和纯化化合物过程中制备或单独地通过使呈游离碱形式的适当化合物与合适的酸反应制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、L-抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate/besylate)、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、龙胆酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、外消旋扁桃酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、膦酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、焦谷氨酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、L-酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐(para-toluenesulf onate/p-tosylate)，和十一烷酸盐。同时，本文中公开的化合物中的碱性基团可以是用甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物，和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基，和二戊基硫酸盐；癸基、月桂基、肉豆寇基，和硬脂基氯化物、溴化物，和碘化物；以及苄基和苯乙基溴化物季铵化。可利用来形成治疗上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸，诸如草酸、马来酸、琥珀酸，和柠檬酸。还可通过所述化合物与碱金属或碱土金属离子通过配位来形成盐。因此，本发明涵盖本文中公开的化合物的钠、钾、镁和钙盐，等等。
碱加成盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中通过将羧基与合适的碱，诸如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备得到。治疗上可接受的盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝，以及无毒的季胺阳离子，诸如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁基胺、吡啶、N，N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯乙基胺、1-麻黄胺(1-ephenamine)和N，N′-二苄基乙二胺。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪等等。
虽然本发明化合物可能作为原料化学品施用，但它们也可能作为药物制剂提供。因此，本文提供药物制剂，其包括一种或多种本文中公开的某些化合物，或一种或多种其药学上可接受的盐、酯、前药、酰胺，或溶剂化物，连同其一种或多种药学上可接受的载剂以及任选的一种或多种其它治疗成分。载剂在与制剂的其它成分兼容的意义上必须是“可接受的”，而不是对其接受者有害。合适的制剂取决于所选择的施用途径。任何众所周知的技术、载剂和赋形剂都可适当使用，并为本领域，如Remington’s Pharmaceutical Sciences中所理解。本文公开的药物组合物可以按照本领域已知的任何方式制造，例如借助于常规混合、溶解、造粒、制造糖衣丸、研碎、乳化、装入胶囊、包封或压缩方法。
所述制剂包括适用于口服、肠胃外(包括皮下、真皮内、肌内、静脉内、关节内和髓内)、腹膜内、透过粘膜、经皮、直肠和局部(包括皮肤、颊、舌下和眼内)施用的那些制剂，尽管最合适的途径可能取决于例如接受者的病状和病症。所述制剂可便利地以单位剂量形式提供，且可通过制药领域熟知的任何方法制备。通常，这些方法包括下述步骤：将本发明的化合物或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、前药或溶剂化物(“活性成分”)与构成一种或多种附加成分的载剂结合。一般而言，通过将活性成分与液体载剂或细碎的固体载剂或者两者兼有的载剂均匀和紧密地结合来制备制剂，然后必要时，将所得产品成型成所想要的制剂。
适于口服施用的本文中公开的化合物的制剂可提供为呈离散单位的形式，诸如呈胶囊、扁囊剂或片剂，它们各含有预定量的活性成分；呈粉剂或颗粒剂；呈水性液体或非水性液体的溶液剂或混悬剂；或呈水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。所述活性成分也可提供为大丸剂(bolus)、干药糖剂或糊剂。
可以口服使用的药物制剂包括片剂、由明胶制成的推入配合(push fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软质密封胶囊。片剂可以通过任选地与一种或多种附加成分压制或模压而制备。通过在适当的机器内压制任选地与粘合剂、惰性稀释剂或润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分可制备压制片剂。模制片剂可以采用适当的机器将粉末状化合物的混合物用惰性液体稀释剂润湿后经模制加工而成。可任选地对所述片剂包衣或刻痕，以及可配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放。所有用于口服施用的制剂应该具有适于此施用方式的剂量。所述推入配合式胶囊可含有活性成分与下列成分的混合物：填充剂，诸如乳糖；粘合剂，诸如淀粉；和/或润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁；和任选地稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶解于或悬浮于适当的液体诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可添加稳定剂。糖衣丸的核芯具有适当的包衣。出于此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣中添加染料或色素以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以将化合物配制成用于经由注射，例如大丸剂注射或连续输注来进行的肠胃外施用形式。用于注射的制剂可以是例如在安瓿或多剂量容器中的单位剂量形式，并添加有防腐剂。所述组合物可以采用以下形式，如溶于油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有配制剂(formulatory agent)诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。所述制剂可以在例如密封安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量容器中提供，并且可以粉剂形式或在冻干条件下储存，仅需要在临用前加入无菌液体载剂，例如盐水或无菌无热原的水。即用的注射溶液剂和混悬剂可以从先前描述的无菌粉剂、颗粒剂和片剂等来进行制备。
用于肠胃外施用的制剂包括所述活性化合物的水性和非水性(油性)无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可使制剂与预想接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。适当的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可含有能够增加混悬剂粘性的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，所述混悬剂也可含有适当的稳定剂或增加所述化合物溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
除前述制剂之外，所述化合物还可配制为贮库制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射而施用。因此，例如，所述化合物可以与适当的聚合物或疏水性物质(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂，或微溶的衍生物(例如微溶的盐)一起配制。
对于颊部或舌下施用，组合物可以采用由常规方式配制的片剂、糖锭、软锭剂或凝胶剂形式。这些组合物可包含在调味基质(诸如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)上的活性成分。
所述化合物也可配制成直肠组合物，诸如栓剂或缓释灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，诸如可可脂、聚乙二醇或其它甘油酯。
可以经局部、即通过非全身施用形式施用本文中公开的某些化合物。这包括将本文中公开的化合物外部应用到表皮或颊腔中，以及将这样的化合物滴注至耳、眼和鼻中，使得化合物不会显著地进入血流中。相反，全身施用是指口服、静脉内、腹膜内和肌肉内施用。
适用于局部施用的制剂包括适用于渗透入皮肤至发炎部位的液体或半液体制剂(诸如凝胶剂、搽剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂或糊剂)和适用于眼、耳或鼻施用的滴剂。用于局部施用的活性成分可包含例如0.001％至10％w/w(以重量计)的制剂。在某些实施方案中，活性成分可包含多达10％w/w。在其它实施例中，它可包含小于5％w/w。在某些实施方案中，活性成分可包含2％w/w至5％w/w。在其它实施例中，它可包含0.1％至1％w/w的制剂。
除活性成分之外，本发明的局部眼部、耳和鼻的制剂还可包含赋形剂。在这些制剂中常用的赋形剂包括(但不限于)张度剂、防腐剂、螯合剂、缓冲剂和表面活性剂。其它赋形剂包含增溶剂、稳定剂、舒适增强剂、聚合物、软化剂、pH-调节剂和/或润滑剂。可以在本发明的制剂中使用的任何各种赋形剂包括水、水与水混溶性溶剂，诸如C1-C7链烷醇、植物油或矿物油的混合物，其包含0.5％至5％无毒的水溶性聚合物，天然产物，诸如藻酸盐、果胶类、黄蓍胶、刺梧桐树胶、瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、琼脂和阿拉伯胶，淀粉衍生物，诸如淀粉乙酸酯和羟丙基淀粉，以及其它合成产物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚氧化乙烯，优选交联的聚丙烯酸以及这些产品的混合物。赋形剂的浓度通常是活性成分浓度的1至100,000倍。在优选实施方案中，包括在制剂中的赋形剂通常是根据其对所述制剂的活性成分组分的惰性来选择。
相对于眼部、耳和鼻的制剂，适当的张力调节剂包括(但不限于)甘露糖醇、氯化钠、甘油、山梨糖醇等等。适当的缓冲剂包括(但不限于)磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐等等。适当的表面活性剂包括(但不限于)离子型和非离子型表面活性剂(不过，优选非离子型表面活性剂)、RLM 100、POE 20十六烷基十八烷基(cetylstearyl)醚，诸如CS20和泊洛沙姆(poloxamer)，诸如F68。
本文中阐述的制剂可包含一种或多种防腐剂。这类防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸酯，过硼酸钠，亚氯酸钠，醇类诸如氯代丁醇、苯甲醇或苯乙醇，胍衍生物诸如聚六亚甲基双胍，过硼酸钠，聚季铵-1，氨基醇诸如AMP-95，或山梨酸。在某些实施方案中，制剂可以是自身防腐的，所以无需防腐剂。
对于眼部、耳或鼻的施用，制剂可以是溶液剂、混悬剂或凝胶剂。在优选方面，制剂以呈滴剂形式的水溶液局部施用于眼、鼻或耳。术语“水性”通常表示水性制剂，其中以水重量计，制剂大于50％，更优选大于75％，且具体而言大于90％。这些滴剂可以单剂量安瓿递送，其可优选为无菌的且因此无需提供制剂的抑菌组分。或者，可以从多剂量瓶中递送滴剂，所述多剂量瓶可优选包括一种装置，该装置从递送的制剂中提取任意防腐剂，诸如本领域公知的装置。
对于眼部病症，可以将本发明的组分作为浓缩凝胶或类似媒介物或作为在置于眼睑下可溶解的插入物递送至眼。
适合于对眼局部施用的本发明的制剂优选为等渗的或稍微低渗的，以对抗由于蒸发和/或疾病所致的泪液的任何高渗性。这可能需要张度剂以便使制剂的摩尔渗透压浓度达到或接近210-320毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)的水平。本发明的制剂一般具有220-320mOsm/kg范围的摩尔渗透压浓度，且优选具有235-300mOsm/kg范围的摩尔渗透压浓度。一般将眼部制剂配制成无菌水溶液。
在某些眼部实施方案中，本发明的组合物与一种或多种泪液替代品一起配制。各种泪液替代品在本领域内是已知的，且包括(但不限于)：单体多元醇，诸如甘油、丙二醇和乙二醇；聚合多元醇，诸如聚乙二醇；纤维素酯，诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素；右旋糖酐，诸如右旋糖酐70；乙烯基聚合物，诸如聚乙烯醇；和卡波姆，诸如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940和卡波姆974P。本发明的某些制剂可以与隐形眼镜或其它眼用产品一起使用。
优选制剂使用缓冲系统制备，所述缓冲系统保持制剂在约pH 4.5至约pH 8。最优选制剂pH是从6到8。
在特定实施方案中，本发明的制剂一天施用一次。然而，制剂也可为了在任何施用频率施用而配制，包括每周一次、每5天一次、每3天一次、每2天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天八次、每小时一次或任何更高的频率。这个施用频率也可根据治疗方案维持不同的持续时间。具体的治疗方案持续时间可以在一次施用至延续数月或数年的方案之间改变。所述制剂以不同剂量施用，但典型的剂量是在各次施用中一至两滴，或相当量的凝胶或其它制剂。本领域中的普通技术人员将熟练确定针对具体适应症的治疗方案。
局部或经皮施用的凝胶一般可包含挥发性溶剂、不挥发溶剂和水的混合物。在某些实施方案中，缓冲溶剂系统的挥发性溶剂组分可包括低级(C1-C6)烷基醇、低级烷基二醇和低级二醇聚合物。在进一步实施方案中，挥发性溶剂是乙醇。挥发性溶剂组分被认为用作渗透增强剂，同时当它蒸发时还在皮肤上产生冷却效应。缓冲溶剂系统的不挥发溶剂部分选自低级亚烷基二醇和低级二醇聚合物。在某些实施方案中，使用丙二醇。不挥发溶剂减缓挥发性溶剂的蒸发并降低缓冲溶剂系统的蒸气压。这种不挥发溶剂组分的量，就像挥发性溶剂一样，通过所使用的医药化合物或药物来测定。当系统中的不挥发性溶剂太少时，医药化合物可由于挥发性溶剂的蒸发而结晶，同时过量可导致由于溶剂混合物中药物释放不良而缺乏生物利用度。缓冲溶剂系统的缓冲组分可选自通常用于本领域中的任何缓冲剂；在某些实施方案中，使用水。常见的成分比率是约20％的不挥发性溶剂、约40％的挥发性溶剂以及约40％的水。有若干种任选成分可添加到局部组合物中。这些包括(但不限于)螯合剂和胶凝剂。适当的胶凝剂可包括(但不限于)半合成纤维素衍生物(诸如羟丙基甲基纤维素)、合成聚合物、半乳甘露聚糖聚合物(诸如瓜尔胶和其衍生物)以及美容剂。
洗剂包括那些适用于皮肤或眼的制剂。眼部洗剂可包括任选含有杀菌剂的无菌水溶液且可以通过与制备滴剂相似的方法来制备。施用于皮肤的洗剂或搽剂还可以包括促进干燥并使皮肤凉爽的试剂，诸如乙醇或丙酮和/或增湿剂，诸如甘油或油，诸如蓖麻油或花生油。
乳膏、软膏或糊剂是供外用的活性成分的半固体制剂。借助于适当的机械，使用油脂性或非油脂性基质，单独或在水性或非水性流体中的溶液剂或混悬剂中，通过使细碎的或粉末形式的活性成分混合可制备它们。基质可以包括：烃类，诸如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；胶浆剂；天然来源的油，诸如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物或脂肪酸，诸如硬脂酸或油酸与醇，诸如丙二醇或大粒凝胶。制剂可掺入任何适当的表面活性剂，诸如阴离子、阳离子或非离子型表面活性剂，诸如脱水山梨醇酯或其聚氧化乙烯衍生物。还可包括助悬剂，诸如天然胶类、纤维素衍生物或无机材料，诸如硅质二氧化硅(silicaceous silicas)和其它成分，诸如羊毛脂。
滴剂可包含无菌水或油溶液或悬浮液并且可以通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它适当的防腐剂，且在某些实施方案中包括表面活性剂的适当的水溶液中制备。然后，可将所得溶液通过过滤澄清，转移到适当的容器中，该容器随后被密封并通过高压灭菌法或保持在98-100℃下半小时进行灭菌。或者，该溶液可以通过过滤灭菌并通过无菌技术转移到容器中。适用于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯基汞或乙酸苯基汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备油性溶液的适当的溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
用于口腔局部施用，例如，颊部或舌下施用的制剂，包括在调味基质诸如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中包含活性成分的糖锭，以及在诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的基质中包含活性成分的软锭剂。
对于通过吸入的施用，化合物可便利地通过吹入器、雾化器加压包装或递送气溶胶喷雾的其它便利方式进行递送。加压包装可以包含适当的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。或者，对通过吸入或吹入法施用，根据本发明的化合物可以制成干粉组合物形式，例如所述化合物和适当的粉剂基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以用单位剂量的形式提供于例如，胶囊、药筒、明胶或泡罩包装中，从中粉剂可以借助于吸入器或吹入器施用。
优选的单位剂量制剂是含有活性成分的如下文中所述有效剂量或者其适当部分的。
应理解除上述具体提及的成分外，上述制剂可包括具有讨论中制剂类型的本领域中常规的其它药剂，例如那些适合口服施用的制剂可包括调味剂。
化合物可以每天0.1至500mg/kg的剂量口服或经注射施用。用于成年人的剂量范围一般为5mg至2g/天。以离散单位提供的片剂或其它形式的呈现可便利地含有一定量的一种或多种化合物，它在这样的剂量下或作为多个相同剂量，例如含有5mg至500mg，通常约10mg至200mg的单位是有效的。
可与载剂物质组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据所治疗的主体和特定施用模式而变化。
所述化合物可以各种模式施用，例如口服、局部，或通过注射。施用于患者的化合物的精确量将由主治医师负责。对于任何特定患者的具体剂量水平将取决于各种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、药物组合、所治疗的准确病症，以及所治疗的适应症或病状的严重度。施用途径也可根据病状和它的严重度而变化。
在某些情况下，可能适于以本文中描述的化合物的至少一种(或其药学可接受的盐、酯或前药)与另一种治疗剂相组合施用。仅为举例而言，如果接受本文中的化合物之一的患者经历的副作用之一为高血压，那么可适当地以抗高血压药剂与最初的治疗剂相组合施用。或，仅为举例而言，本文中描述的化合物之一的治疗效果可通过施用佐剂(即佐剂自身仅具有很小的治疗益处，但与另一种治疗剂组合时，对患者的整体疗效益处增强)而得到增强。或，仅为举例而言，患者所经历的益处可通过施用本文中描述的化合物之一与另一种也具有治疗益处的治疗剂(其也包括治疗方案)而增加。仅为举例而言，在包括施用本文中描述的化合物之一的糖尿病性神经性疼痛的治疗中，通过向患者还提供另一种糖尿病治疗剂可以获得增加的治疗益处。在任何情况下，无论所治疗的疾病、病症或病状如何，患者经历的整体益处可能是二种治疗剂的简单相加或者患者可经历协同益处。
在任何情况下，多种治疗剂(其中至少一种是本文中公开的化合物)可以任何顺序施用或甚至同时施用。如果同时施用，多种治疗剂可以单一、统一的形式，或以多种形式(仅举例而言，作为单一丸剂或作为两种单独的丸剂)来提供。治疗剂之一可以多个剂量提供，或两种化合物均可以多个剂量提供。如果不同时，则多个剂量之间的时间可为任何持续时间，范围为几分钟至四周。
提供以下实施例以进一步说明本发明的实施方案，但并非意欲限制本发明的范围。尽管它们是可以使用的典型的实施例，但也可用本领域技术人员所公知的其它程序、方法或技术进行替代。
实施例
实施例1-51
所有试剂和溶剂均购自商业供应商且直接使用无需进一步纯化。除非另有说明，否则所有合成均在干燥氮气氛中进行。反应是通过薄层色谱法(TLC，在Merck F254硅胶60铝板上，斑点在灯光或紫外光(254mm)下可见或经氧化溶液染色(KMnO4染色)监测。使用相同的TLC系统测试纯度，并且所有最终产物在TLC上显示为单个斑点。用硅胶进行柱色谱法。
1H-NMR谱在Varian QE-300光谱仪上记录，使用含有TMS内标的氘代氯仿(CDCl3；δ＝7.24ppm)或氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)。13C-NMR谱在Varian QE-300TM光谱仪上在75MHz下记录。
本文中报导的抑制剂纯度通过以下方法测定：1)HPLC-UV，其使用Agilent 1200TM系列HPLC系列，配备有PhenomenexTM Luna2C18反相柱(C18，4.6mm×150mm，5μm)，与Agilent G1314 UV-vis检测器耦合(在230nm下检测)，在甲醇∶水(以体积计2∶1)的等度流下90分钟；或2)H-NMR。报导了最低获得纯度。将抑制剂以100μM溶于EtOH且在HPLC上注入10μL。纯度是基于使用HPLC-UV在230nm下的总峰面积的百分率。将纯度估算与来自H-NMR的值对比。最终产物中所存在的苯胺从H-NMR来估算。报导了最低获得纯度。纯度还进一步如补充材料中所描述通过以下技术支持：监控总离子流的LC/MS、在若干系统中的TLC、明确熔点和偶见的其它技术。元素分析是通过MIDWESTMICRO实验室的LCC进行。
先前已报导4-(3-(4-(三氟甲基)苯基)脲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯、1-(哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲、1-(哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲和4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成。
实施例1
sEH抑制剂的通用合成方案
本发明化合物通过如下文中通用合成方案概述的各种方法制备。
通用合成方案
合成路径1
步骤1
将相应的异氰酸酯(1当量)和4-氨基-1-Boc-哌啶(1.1当量)溶于CH2Cl2(50mM，相应于异氰酸酯)中并在室温下搅拌12小时。通过添加水来淬灭反应。分离有机层并且水层用EtOAc(EtOAc∶水层/1∶1(v∶v))萃取4次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥并在真空下浓缩，并通过快速色谱法进一步纯化，得到相应的Boc-保护的脲。
步骤2
将来自步骤1的Boc保护的脲溶于HCl溶液(2M，MeOH)中制得反应混合物(186mM，Boc保护的脲)。使所得溶液回流2小时。真空下去除溶剂并且用NaOH调节粗反应产物至pH 12。过滤沉淀并在高真空下干燥。最终未保护的脲用作下一步合成的骨架。
步骤3
除非指明，否则将来自步骤2的未保护的脲(1当量)、EDCI(1.5当量)、DMAP(1.5当量)和相应的羧酸(1.5当量)溶于CH2Cl2(8.3mM，未保护的脲)并在室温下搅拌过夜(12小时)。通过添加HCl溶液(1M)来淬灭反应。收集有机层并且水层用EtOAc(EtOAc∶水层/1∶1(v∶v))萃取4次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥并在真空下浓缩，并通过快速色谱法进一步纯化。
合成路径2
步骤1
将相应胺(1当量)和三乙胺(1.5当量)溶于CH2Cl2(54mM相应于胺)并在-78℃下搅拌。在-78℃下逐滴加入溶于CH2Cl2(20mM，相应三光气)的三光气(0.45当量)。随后将反应加温至室温并搅拌30分钟。将反应冷却至0℃。缓慢加入溶于CH2Cl2(54mM，相应哌啶)的相应哌啶(1.5当量)和三乙胺(1.5当量)并且将反应进一步在室温下搅拌12小时。通过添加HCl溶液(2M)来淬灭反应。收集有机层并且水层用EtOAc(EtOAc∶水层/1∶1)进一步萃取3次。用饱和NaCl溶液洗涤合并的有机层。有机层经无水硫酸镁干燥并在真空中浓缩。产物无需进一步纯化即可使用。
步骤2
将来自步骤1的Boc保护的脲溶于HCl溶液(2M，MeOH)中制得反应混合物(186mM，Boc保护的脲)。使所得溶液回流2小时。真空下去除溶剂并且用NaOH调节粗反应产物至pH 12。过滤沉淀并在高真空下干燥。最终未保护的脲用作下一步合成的骨架。
步骤3
除非指明，否则将来自步骤2的未保护的脲(1当量)、EDCI(1.5当量)、DMAP(1.5当量)和相应的羧酸(1.5当量)溶于CH2Cl2(8.3mM，未保护的脲)并在室温下搅拌过夜(12小时)。通过添加HCl溶液(1M)来淬灭反应。收集有机层并且水层用EtOAc(EtOAc∶水层/1∶1(v∶v))萃取4次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥并在真空下浓缩，并通过快速色谱法进一步纯化。
合成路径3
将相应胺(1当量)和三乙胺(1.5当量)溶于CH2Cl2(54mM相应于胺)并在-78℃下搅拌。在-78℃下逐滴加入溶于CH2Cl2(20mM，相应三光气)的三光气(0.45当量)。随后将反应加温至室温并搅拌30分钟。将反应冷却至0℃。缓慢加入溶于CH2Cl2(54mM，相应哌啶)的相应哌啶(1.5当量)和三乙胺(1.5当量)并且将反应进一步在室温下搅拌12小时。通过添加HCl溶液(2M)来淬灭反应。收集有机层并且水层用EtOAc(EtOAc∶水层/1∶1)进一步萃取3次。用饱和NaCl溶液洗涤合并的有机层。有机层经无水硫酸镁干燥并在真空中浓缩。产物通过快速色谱法纯化。
实施例2
合成4-(3-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(A)
方案
将间-氟-4-(三氟甲氧基)苯胺(500mg，2.56mmol)和三乙胺(388mg，3.84mmol)溶于CH2Cl2(4mL)中并在-78℃下逐滴加入溶于CH2Cl2(5mL)的三光气(341mg，1.15mmol)溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时且随后冷却至-78℃。将4-氨基-1-Boc-哌啶(769mg，3.84mmol)和三乙胺(388mg，3.84mmol)溶于CH2Cl2(4mL)并将悬浮液在-78℃下逐滴加入反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌2小时。通过添加水来淬灭反应。分离有机层并且有机层被HCl溶液(1M)进一步洗涤4次。有机层经无水硫酸镁干燥并在真空中浓缩，得到最终粗产物(1.05g，纯度86％，2.13mmol，产率83.4％)。杂质38通过柱色谱法使用EtOAc∶Hex(1∶1)纯化。
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：A：8.77(s，1H)，7.66(dd，J＝13.5，2.4Hz，1H)，7.38(t，J＝8.1Hz，1H)，7.10(d，J＝9Hz，1H)，6.33(d，J＝7.5Hz，1H)，3.81(d，J＝12.9Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，2.8-3.0(m，2H)，1.78(dd，J＝12.3Hz，3.3Hz，2H)，1.40(s，9H)，1.2-1.4(m，2H)；38：9.28(s，1H)，7.69(dd，J＝14.9，2.4Hz，1H)，7.46(t，J＝9Hz，1H)，7.2-7.3(m，1H)
实施例3
合成1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(51.5mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：56mg，135μmol，产率51％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：8.55(s，1H)，7.46-7.48(m，2H)，7.21(d，J＝9Hz，2H)，6.24(d，J＝7.8Hz，1H)，4.19(d，J＝13.2Hz，1H)，3.88(d，J＝13.8Hz，1H)，3.83(m，2H)，3.70-3.72(m，1H)，3.36-3.40(m，2H)，3.16(t，J＝12Hz，1H)，2.85-2.90(m，1H)，2.76-2.80(m，1H)，1.79-1.89(m，2H)，1.55-1.62(m，2H)，1.48-1.52(m，2H)，1.20-1.32(m，2H)
实施例4
合成1-(1-(1H-吡咯-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(51.5mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：61mg，154μmol，产率58.3％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：11.14(s，1H)，8.57(s，1H)，7.47(d，J＝9.6Hz，2H)，7.21(d，J＝9Hz，2H)，7.08(d，J＝1.2Hz，1H)，6.75-6.77(m，1H)，6.22-6.26(m，2H)，4.19(d，J＝13.5Hz，2H)，3.72-3.74(m，1H)，3.08-3.12(m，2H)，1.83-1.86(m，2H)，1.26-1.37(m，2H)
实施例5
合成1-(1-(呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(51.5mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：64mg，161μmol，产率61％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.59(s，1H)，8.02(s，1H)，7.74(s，1H)，7.47(d，J＝9.6Hz，2H)，7.21(d，J＝9Hz，2H)，6.65(s，1H)，6.26(d，J＝6.9Hz，2H)，3.8-4.4(br，2H)，3.74-3.65(m，1H)，2.9-3.2(br，2H)，1.87(d，J＝9.9Hz，2H)，1.29-1.40(m，2H)
实施例6
合成(R)-1-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与(R)-四氢呋喃-3-羧酸(46.2mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：58mg，145μmol，产率55％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.53(d，J＝5.4Hz，1H)，7.47(d，J＝9.6Hz，2H)，7.21(d，J＝9Hz，2H)，6.23-6.26(m，1H)，4.65(t，J＝6.3Hz，1H)，4.05-4.10(m，1H)，3.89(d，J＝14.7Hz，1H)，3.6-3.8(m，3H)，3.15(q，J＝14.7Hz，1H)，2.81(q，J＝15.3Hz，1H)，1.9-2.1(m，2H)，1.7-1.9(m，4H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例7
合成1-(1-(4，5-二氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(45.4mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：68mg，170μmol，产率65％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.56(s，1H)，7.47(d，J＝8.7Hz，2H)，7.21(d，J＝8.7Hz，2H)，6.99(s，1H)，6.23(d，J＝7.8Hz，1H)，4.37(t，J＝9.6Hz，2H)，4.04(d，J＝13.5Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，3.04(t，J＝11.4Hz，2H)，2.79(t，J＝10.5Hz，2H)，1.84(d，J＝9.6Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例8
合成1-(1-(2-甲基呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与2-甲基呋喃-3-羧酸(50mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：59mg，144μmol，产率54％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.57(s，1H)，7.56(d，J＝1.8Hz，1H)，7.47(d，J＝8.7Hz，2H)，7.21(d，J＝8.7Hz，2H)，6.49(d，J＝1.8Hz，1H)，6.25(d，J＝7.5Hz，1H)，4.0-4.4(br，1H)，3.6-3.8(m，2H)，3.0-3.2(m，2H)，2.30(s，3H)，1.83-1.88(m，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例9
合成1-(1-(3-甲基呋喃-2-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与3-甲基呋喃-2-羧酸(50mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：53mg，129μmol，产率49％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.57(s，1H)，7.67(s，1H)，7.48(d，J＝9.6Hz，2H)，7.21(d，J＝8.7Hz，2H)，6.48(s，1H)，6.27(d，J＝7.8Hz，1H)，4.0-4.2(br，2H)，3.7-3.9(m，1H)，3.0-3.2(br，2H)，2.14(s，3H)，1.88(d，J＝9.3Hz，2H)，1.3-1.4(m，2H)
实施例10
合成1-(1-(四氢-2H-吡喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与四氢-2H-吡喃-3-羧酸(50mg，396μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：43mg，104μmol，产率39％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.55(s，1H)，7.47(d，J＝9.3Hz，2H)，7.21(d，J＝8.7Hz，2H)，6.23(d，J＝7.8Hz，1H)，4.1-4.2(m，1H)，3.6-3.9(m，4H)，3.1-3.4(m，3H)，2.7-2.9(m，2H)，1.7-1.9(m，3H)，1.5-1.7(m，3H)，1.1-1.4(m，2H)
实施例11
合成1-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(32mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：50mg，125μmol，产率76.8％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.57(s，4H)，6.34(d，J＝7.5Hz，1H)，4.19(d，J＝12.3Hz，1H)，3.8-3.9(m，3H)，3.7-3.8(m，1H)，3.38(t，J＝11.4Hz，3H)，3.18(t，J＝9.9Hz，1H)，2.7-2.9(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.4-1.7(m，2H)，1.1-1.4(m，2H)
实施例12
合成1-(1-(呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与呋喃-3-羧酸(32mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：43mg，113μmol，产率69％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.81(s，1H)，8.03(s，1H)，7.74(s，1H)，7.57(s，4H)，6.65(s，1H)，6.36(d，J＝7.8Hz，1H)，3.8-4.4(br，2H)，3.7-3.9(m，1H)，3.0-3.4(br，2H)，1.87(d，J＝11.7Hz，2H)，1.3-1.5(m，2H)
实施例13
合成(R)-1-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与(R)-四氢呋喃-3-羧酸(28.7mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：42mg，109μmol，产率66.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.76(d，J＝4.8Hz，1H)，7.57(s，4H)，6.36(d，J＝4.2Hz，1H)，4.66(t，J＝6.3Hz，2H)，4.14(t，J＝13.2Hz，1H)，3.96(d，J＝15.9Hz，1H)，3.6-3.8(m，3H)，3.15(q，J＝14.4Hz，1H)，2.82(d，J＝12.3Hz，1H)，1.9-2.1(m，2H)，1.7-1.9(m，4H)，1.2-1.5(m，2H)
实施例14
合成1-(1-(4，5-二氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与4，5-二氢呋喃-3-羧酸(28.4mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：45mg，117μmol，产率72.1％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.57(s，4H)，6.99(s，1H)，6.34(d，J＝7.5Hz，1H)，4.37(t，J＝9.6Hz，2H)，4.05(d，J＝13.5Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，3.04(t，J＝11.1Hz，2H)，2.79(t，J＝9.6Hz，2H)，1.85(d，J＝10.5，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例15
合成1-(1-(2-甲基呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与2-甲基呋喃-3-羧酸(30mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：48mg，121μmol，产率74.5％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.80(s，1H)，7.57(s，4H)，6.48(d，J＝1.8Hz，1H)，6.35(d，J＝7.8Hz，1H)，4.0-4.3(br，2H)，3.6-3.9(m，1H)，3.0-3.2(br，2H)，2.30(s，3H)，1.85(d，J＝10.5，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例16
合成1-(1-(3-甲基呋喃-2-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与3-甲基呋喃-2-羧酸(30mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(8∶2)洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：45mg，114μmol，产率69.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.80(s，1H)，7.67(s，1H)，7.57(s，4H)，6.48(s，1H)，6.38(d，J＝7.5Hz，1H)，3.9-4.2(br，2H)，3.7-3.9(m，1H)，3.0-3.2(br，2H)，2.14(s，3H)，1.89(d，J＝9.9，2H)，1.3-1.5(m，2H)
实施例17
合成1-(1-(四氢-2H-吡喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与四氢-2H-吡喃-3-羧酸(32.4mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。通过甲醇和水重结晶进一步纯化产物。通过过滤收集白色晶体。
产量：42mg，105μmol，产率64.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.57(s，4H)，6.38(d，J＝7.5Hz，1H)，4.16(d，J＝12.6Hz，1H)，3.6-3.9(m，4H)，3.1-3.3(m，3H)，2.7-2.9(m，2H)，1.7-1.9(m，3H)，1.5-1.7(m，3H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例18
合成1-(1-(1H-吡咯-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(47mg，164μmol)与1H-吡咯-3-羧酸(27.2mg，245μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：52mg，137μmol，产率83.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.79(s，1H)，7.57(s，4H)，7.08(s，1H)，6.76(d，J＝1.8Hz，m)，6.34(d，J＝7.8Hz，1H)，6.22(s，1H)，4.18(d，J＝13.5Hz，1H)，3.7-3.9(m，1H)，3.09(t，J＝10.2Hz，2H)，1.86(d，J＝9.9Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例19
合成1-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(80mg，264μmol)与2-甲基呋喃-3-羧酸(61mg，528μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：59mg，144μmol，产率54％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.55(s，1H)，7.47(d，J＝9.3Hz，2H)，7.21(d，J＝8.7Hz，2H)，6.23(d，J＝7.2Hz，1H)，4.18(d，J＝12.9Hz，1H)，3.8-3.9(m，2H)，3.6-3.8(m，3H)，3.3-3.4(m，1H)，3.1-3.3(m，1H)，2.82(t，J＝12Hz，2H)，1.9-2.1(m，2H)，1.84(t，J＝12.9Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例20
合成1-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(80mg，278μmol)与2-甲基呋喃-3-羧酸(65mg，556μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：64mg，166μmol，产率60％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.57(s，4H)，6.33(d，J＝6.9Hz，1H)，4.19(d，J＝13.5Hz，1H)，3.8-3.9(m，2H)，3.6-3.8(m，4H)，3.3-3.4(m，1H)，3.1-3.3(m，1H)，2.83(t，J＝12Hz，1H)，1.9-2.1(m，2H)，1.84(t，J＝13.8Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例21
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使3-氟-4-(三氟甲氧基)苯胺(109mg，559μmol)与1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丙-1-酮(143mg，838μmol)反应。将产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯∶己烷(7∶3)纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：150mg，383μmol，产率68.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：8.78(s，1H)，7.67(dd，J＝13.89Hz，1.2Hz，1H)，7.38(t，J＝9.6Hz，1H)，7.12(d，J＝9.6Hz，1H)，6.35(d，J＝13.8Hz，1H)，4.20(d，J＝13.2Hz，1H)，3.84(d，J＝13.8Hz，1H)，3.7-3.8(m，1H)，3.15(t，J＝12Hz，1H)，2.8-2.9(m，1H)，2.77(t，J＝11.4Hz，1H)，1.86(d，J＝10.8Hz，1H)，1.79(d，J＝11.4Hz，1H)，1.2-1.4(m，2H)，0.98(t，J＝7.8Hz，6H)
实施例22
合成1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使3-氟-4-(三氟甲氧基)苯胺(100mg，558μmol)与1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丙-1-酮(142mg，838μmol)反应。将产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯∶己烷(7∶3)纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：120mg，320μmol，产率68.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.02(s，1H)，7.66(d，J＝14.7Hz，1H)，7.58(t，J＝8.7Hz，1H)，7.20(d，J＝8.7Hz，1H)，6.46(d，J＝7.5Hz，1H)，4.20(d，J＝12.9Hz，1H)，3.85(d，J＝13.5Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.16(t，J＝12Hz，1H)，2.8-2.95(m，1H)，2.77(t，J＝11.4Hz，1H)，1.83(t，J＝14.1Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)，0.98(d，J＝5.7Hz，6H)
实施例23
合成N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-2-(1-异丁酰基哌啶-4-基)乙酰胺
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶H(38mg，118μmol)与异丁酸(12.3mg，142.9μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：120mg，320μmol，产率68.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：10.28(s，1H)，7.85(dd，J＝12.9Hz，1.8Hz，1H)，7.49(t，J＝9Hz，1H)，7.36(d，J＝9.6Hz，1H)，4.36(d，J＝12.6Hz，1H)，3.91(d，J＝12.9Hz，1H)，3.00(t，J＝11.7Hz，1H)，2.7-2.9(m，1H)，2.5-2.6(m，1H)，2.27(d，J＝6.9Hz，2H)，1.9-2.1(m，1H)，1.70(t，J＝14.4Hz，2H)，1.1-1.2(m，2H)，0.98(s，6H)
实施例24
合成2-(1-(2-氧代-2-(4-(3-(4-(三氟甲基)苯基)脲基)哌啶-1-基)乙基)环己基）乙酸
方案
将2，2’-(环己烷-1，1-二基)二乙酸(35mg，175μmol)、EDCI(30mg，157μmol)和DMAP(21.2mg，157μmol)溶于THF(20mL)中，并在室温下将悬浮于THF(4mL)中的哌啶D(75mg，261μmol)添加到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌12小时并通过添加HCl溶液(1M)淬灭。收集有机层并通过乙酸乙酯进一步萃取水层3次。将合并的有机层在真空中干燥并通过快速色谱法使用乙酸乙酯中1％甲醇来纯化，并通过TLC监测。合并所收集的馏分并在真空中干燥得到最终白色沉淀。
产量：15mg，31.9μmol，产率18.3％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.75(s，1H)，7.56(s，4H)，6.35(d，J＝7.8Hz，1H)，4.2-4.3(m，1H)，3.92(d，J＝12.9Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.14(t，J＝11.4Hz，1H)，2.7-2.9(m，1H)，2.55(s，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.5-1.7(br，2H)，1.2-1.5(m，6H)
熔点(℃)：171.8-176.7
实施例25
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-丙酰基哌啶-4-基)脲
方案
向哌啶B(30mg，93.5μmol)和三乙胺(141mg，141.7μmol)的悬浮液中逐滴加入丙酸酐(18.2mg，141.7μmol)。将反应在室温下搅拌12小时并通过添加硅胶(50mg)淬灭。使浆液在真空中干燥并施用快速色谱法。将产物经乙酸乙酯∶己烷(9∶1)洗脱并通过TLC监测。将所收集的馏分在真空中干燥并通过甲醇和水再结晶。通过过滤收集最终白色晶体。
产量：33mg，87.5μmol，产率93％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.77(s，1H)，7.66(dd，J＝13.5Hz，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝9Hz，1H)，7.10(d，J＝9Hz，1H)，6.34(d，J＝7.5Hz，1H)，4.18(d，J＝12.9Hz，1H)，3.6-3.8(m，2H)，3.12(t，J＝11.7Hz，1H)，2.77(t，J＝11.7Hz，1H)，2.31(q，J＝7.5，2H)，1.82(d，J＝12.3Hz，1H)，1.2-1.4(m，2H)，0.98(t，J＝7.5Hz，6H)
实施例26
合成1-(1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(30mg，93.4μmol)与环丙烷甲酸(12mg，140μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(9∶1)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：31mg，93.4μmol，产率85％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.66(d，J＝13.5Hz，1H)，7.39(t，J＝9Hz，1H)，7.11(d，J＝8.7Hz，1H)，6.36(d，J＝7.8Hz，1H)，4.16(br，2H)，3.6-3.8(m，1H)，3.2-3.3(m，1H)，2.7-2.9(m，1H)，1.7-2.0(m，3H)，1.1-1.4(m，2H)，0.6-0.8(m，4H)
实施例27
合成(R)-1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(30mg，93.4μmol)与(R)-四氢呋喃-3-羧酸(16mg，140μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶来进一步纯化产物(32mg，76.3μmol，产率81.7％)。
产量：32mg，76.3μmol，产率81.7％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.79(s，1H)，7.66(dd，J＝13.8Hz，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝8.7Hz，1H)，7.11(d，J＝9Hz，1H)，6.35(d，J＝7.8Hz，1H)，4.18(d，J＝12.9Hz，1H)，3.8-3.9(m，2H)，3.6-3.8(m，4H)，3.3-3.4(m，1H)，3.1-3.2(m，1H)，2.81(t，J＝12Hz，1H)，1.9-2.1(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.1-1.4(m，2H)
实施例28
合成(S)-1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(30mg，93.4μmol)与(S)-2-甲基丁酸(14mg，140μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶来进一步纯化产物(30mg，83.9μmol，产率79.2％)。
产量：30mg，83.9μmol，产率79.2％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：8.78(d，J＝17.4Hz，1H)，7.66(dd，J＝13.8Hz，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝9Hz，1H)，7.11(dd，J＝9Hz，1.2Hz，1H)，6.3-6.4(m，1H)，4.23(t，J＝13.2Hz，1H)，3.88(d，J＝10.8Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.1-3.2(m，1H)，2.6-2.8(m，2H)，1.8-1.9(br，1H)，1.7-1.8(m，1H)，1.5-1.6(m，1H)，1.1-1.4(m，3H)，0.9-1.0(m，3H)，0.7-0.9(m，3H)
实施例29
合成(R)-1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(30mg，93.4μmol)与四氢-2H-吡喃-3-羧酸(18mg，140μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：34mg，78.4μmol，产率84％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.66(dd，J＝13.5Hz，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝8.7Hz，1H)，7.11(d，J＝9Hz，1H)，6.34(d，J＝7.5Hz，1H)，4.16(d，J＝11.4Hz，1H)，3.6-4.0(m，4H)，3.1-3.3(m，2H)，2.7-2.9(m，2H)，1.7-1.9(m，3H)，1.5-1.6(m，3H)，1.1-1.4(m，3H)
实施例30
合成1-(4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(1-(三氟甲基)环丙烷-1-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶E(50mg，165.0μmol)与1-(三氟甲基)环丙烷-1-羧酸(30.5mg，198μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(4∶1)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：60mg，142μmol，产率71.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.57(s，4H)，6.36(d，J＝7.8Hz，1H)，4.10(d，J＝12.9Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，2.9-3.2(br，2H)，1.87(d，J＝9.3Hz，2H)，1.2-1.4(m，4H)，1.1-1.2(s，2H)
实施例31
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(60mg，186.9μmol)与四氢呋喃-2H-吡喃-4-羧酸(48.6mg，373.8μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：58mg，134μmol，产率71.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：8.78(s，1H)，7.67(dd，J＝13.2Hz，2.4Hz，1H)，7.37(t，J＝9Hz，1H)，7.11(d，J＝9.6Hz，1H)，6.35(d，J＝7.2Hz，1H)，4.20(d，J＝13.2Hz，1H)，3.8-3.9(m，3H)，3.7-3.8(m，1H)，3.3-3.4(m，2H)，3.16(t，J＝12Hz，1H)，2.8-2.9(m，1H)，2.7-2.9(m，1H)，1.7-1.9(m，2H)，1.5-1.7(m，2H)，1.4-1.5(m，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例32
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(60mg，186.9μmol)与1-(三氟甲基)环丙烷-1-羧酸(57.6mg，373.8μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：60mg，131μmol，产率70.2％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.78(s，1H)，7.67(dd，J＝13.2Hz，2.1Hz，1H)，7.39(t，J＝9Hz，1H)，7.11(d，J＝8.7Hz，1H)，6.37(d，J＝7.5Hz，1H)，4.10(d，J＝13.2Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.0-3.2(br，1H)，1.86(d，J＝11.7Hz，2H)，1.2-1.4(m，4H)，1.1-1.2(s，2H)
实施例33
合成1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-丙酰基哌啶-4-基)脲
方案
按照抑制剂23的合成进行反应。简言之，使哌啶D(40mg，131.1μmol)与丙酸酐(25mg，192μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：42mg，116μmol，产率88.7％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.50(s，1H)，7.65(d，J＝14.1Hz，1H)，7.56(t，J＝9Hz，1H)，7.19(d，J＝8.7Hz，1H)，6.85(d，J＝7.2Hz，1H)，4.14(d，J＝12.6Hz，1H)，3.6-3.8(m，2H)，3.11(t，J＝11.1，1H)，2.79(t，J＝12.1Hz，1H)，2.2-2.4(m，2H)，1.79(t，J＝12.6Hz，2H)，1.1-1.4(m，2H)，0.96(t，J＝7.5Hz，3H)
实施例34
合成1-(1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)-3-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与环丙烷甲酸酸(17mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(9∶1)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：45mg，121μmol，产率91.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.03(s，1H)，7.65(d，J＝14.1Hz，1H)，7.56(t，J＝9Hz，1H)，7.19(d，J＝8.7Hz，1H)，6.47(d，J＝6.9Hz，1H)，4.16(br，2H)，3.6-3.8(m，1H)，3.2-3.3(m，1H)，2.7-2.9(m，1H)，1.7-2.0(m，3H)，1.1-1.4(m，2H)，0.6-0.8(m，4H)
实施例35
合成(R)-1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-(四氢呋喃-3-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与(R)-四氢呋喃-3-羧酸(23mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：41mg，102μmol，产率77.5％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.02(s，1H)，7.65(d，J＝14.7Hz，1H)，7.58(t，J＝9Hz，1H)，7.19(d，J＝8.7Hz，1H)，6.45(d，J＝6.9Hz，1H)，4.20(d，J＝13.2Hz，1H)，3.8-3.9(m，2H)，3.6-3.8(m，4H)，3.3-3.4(m，1H)，3.10(t，J＝14.7Hz，1H)，2.81(t，J＝12.1Hz，1H)，2.00(q，J＝7.5Hz，2H)，1.84(t，J＝13.5Hz，2H)，1.1-1.4(m，2H)
实施例36
合成(S)-1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与(S)-2-甲基丁酸(20mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(4∶1)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：36mg，92.4μmol，产率70.5％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.00(d，J＝4.5Hz，1H)，7.66(d，J＝14.1Hz，1H)，7.58(t，J＝9Hz，1H)，7.19(d，J＝8.7Hz，1H)，6.4-6.5(m，1H)，4.2-4.3(br，1H)，3.87(d，J＝12.9Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.16(t，J＝12Hz，1H)，2.6-2.9(m，2H)，1.8-1.9(m，2H)，1.4-1.6(m，3H)，0.97(s，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例37
合成1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-3-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与四氢-2H-吡喃-3-羧酸(22.8mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：41mg，98.2μmol，产率74.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.02(s，1H)，7.65(d，J＝14.7Hz，1H)，7.58(t，J＝8.4Hz，1H)，7.18(d，J＝9Hz，1H)，6.45(d，J＝6.9Hz，1H)，4.16(d，J＝13.5Hz，1H)，3.6-4.0(m，4H)，3.1-3.4(m，3H)，2.7-3.0(m，2H)，1.8-2.0(m，3H)，1.5-1.8(s，3H)，1.1-1.4(m，2H)
实施例38
合成1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-(1-(三氟甲基)环丙烷-1-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与1-(三氟甲基)环丙烷-1-羧酸(30mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯∶己烷(9∶1)洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：46mg，104μmol，产率79.5％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.02(s，1H)，7.65(d，J＝14.1Hz，1H)，7.58(t，J＝9Hz，1H)，7.19(d，J＝8.7Hz，1H)，6.48(d，J＝7.2Hz，1H)，4.10(d，J＝12.3Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，3.0-3.2(br，2H)，1.87(d，J＝9.9Hz，2H)，1.1-1.5(m，6H)
实施例39
合成1-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶D(40mg，131.1μmol)与四氢-2H-吡喃-4-羧酸(22.8mg，197.4μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：46mg，108μmol，产率82.2％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：9.02(s，1H)，7.66(d，J＝14.1Hz，1H)，7.58(t，J＝8.4Hz，1H)，7.20(d，J＝8.7Hz，1H)，6.45(d，J＝7.5Hz，1H)，4.19(d，J＝12.3Hz，1H)，3.8-4.0(m，3H)，3.6-3.8(m，1H)，3.38(t，J＝11.4Hz，2H)，3.16(t，J＝12Hz，1H)，2.8-3.0(m，1H)，2.78(t，J＝11.7Hz，1H)，1.84(t，J＝15.3Hz，2H)，1.4-1.7(m，4H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例40
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-异丁酰基哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使5-(三氟甲基)吡啶-2-苯胺(100mg，617μmol)与(S)-1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丁-1-酮(174mg，944μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：153mg，411μmol，产率73.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.98(d，J＝7.5Hz，1H)，8.66(s，1H)，8.12(d，J＝8.7Hz，1H)，7.75(d，J＝11.7Hz，1H)，6.5-6.6(m，1H)，4.2-4.4(br，1H)，3.88(d，J＝13.5Hz，1H)，3.7-3.8(m，1H)，3.16(t，J＝10.8Hz，1H)，2.6-2.9(m，2H)，1.7-2.0(m，2H)，1.4-1.6(m，1H)，1.1-1.4(m，3H)，0.97(s，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例41
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(吗啉-4-羰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使哌啶B(40mg，124μmol)与吗啉(12mg，138μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯中的1％甲醇纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：46mg，106μmol，产率85.4％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.77(s，1H)，7.66(dd，J＝13.5，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝8.4Hz，1H)，7.10(d，J＝8.7Hz，1H)，6.33(d，J＝7.5Hz，1H)，3.6-3.7(m，1H)，3.4-3.6(m，5H)，3.11(t，J＝4.2Hz，3H)，2.87(t，J＝11.1Hz，1H)，1.79(d，J＝10.2Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)
实施例42
合成2-(1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰胺
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶H(38mg，118μmol)与环丙烷甲酸(12.3mg，142.9μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：32mg，82.4μmol，产率69.8％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：10.29(s，1H)，7.85(dd，J＝12.9，2.1Hz，1H)，7.50(t，J＝9Hz，1H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，4.2-4.4(m，2H)，3.0-3.2(m，1H)，2.57(t，J＝12Hz，1H)，2.28(d，J＝6.9Hz，2H)，1.9-2.1(m，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.0-1.2(m，2H)，0.69(m，4H)
实施例43
合成((S)-N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-2-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)乙酰胺
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶H(38mg，118μmol)与(S)-2-甲基丁酸(14mg，142.9μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱)。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体(27mg，66.8μmol，产率56.6％)。
产量：27mg，66.8μmol，产率56.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：10.28(s，1H)，7.84(dd，J＝12.6，2.4Hz，1H)，7.50(t，J＝9Hz，1H)，7.36(d，J＝9Hz，1H)，4.39(d，J＝12.3Hz，1H)，3.95(d，J＝12.6Hz，1H)，3.00(t，J＝12.3Hz，1H)，2.6-2.8(m，1H)，2.27(d，J＝6.9Hz，2H)，1.9-2.1(m，1H)，1.6-1.8(m，2H)，1.5-1.6(m，1H)，1.2-1.4(m，1H)，1.0-1.2(m，2H)，0.96(t，J＝6Hz，3H)，0.7-0.9(m，3H)
实施例44
合成N-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-2-(1-异丁酰基哌啶-4-基)乙酰胺
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶H(38mg，118μmol)与异丁酸(12.6mg，142.9μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱)。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。
产量：30mg，76.8μmol，产率65.1％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：10.28(s，1H)，7.84(dd，J＝12.9，1.8Hz，1H)，7.49(t，J＝9Hz，1H)，7.36(d，J＝9.6Hz，1H)，4.36(d，J＝12.6Hz，1H)，3.91(d，J＝12.9Hz，1H)，3.00(t，J＝11.7Hz，1H)，2.8-2.9(m，1H)，2.5-2.6(m，1H)，2.27(d，J＝6.9Hz，2H)，1.9-2.1(m，1H)，1.70(t，J＝13.5Hz，2H)，0.9-1.2(m，8H)
实施例45
合成(S)-1-(3-氯-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使3-氯-4-(三氟甲氧基)苯胺(50mg，236μmol)与(S)-1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丁-1-酮(65mg，353μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：78mg，185μmol，产率78.4％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.98(d，J＝4.5Hz，1H)，8.65(s，1H)，8.13(d，J＝8.7Hz，1H)，6.4-6.6(m，1H)，4.2-4.3(br，1H)，3.88(d，J＝13.5Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.13(t，J＝12Hz，1H)，2.6-2.9(m，2H)，1.8-1.9(m，2H)，1.4-1.6(m，1H)，1.2-1.4(m，3H)，0.97(s，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例46
合成(S)-1-(3-氯-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使3-溴-4-(三氟甲氧基)苯胺(55mg，234μmol)与(S)-1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丁-1-酮(65mg，353μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯纯化。合并所收集的馏分并在真空中干燥。
产量：81mg，174μmol，产率74.4％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.70(d，J＝4.5Hz，1H)，7.97(d，J＝1.8Hz，1H)，7.3-7.4(m，2H)，6.4-6.6(m，1H)，4.2-4.3(br，1H)，3.88(d，J＝11.7Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.15(t，J＝12.9Hz，1H)，2.6-2.9(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.4-1.6(m，1H)，1.2-1.4(m，3H)，0.97(s，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例47
合成(S)-1-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)-3-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使4-(三氟甲氧基)-3-(三氟甲基)苯胺(55mg，224μmol)与(S)-1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丁-1-酮(64mg，347μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯纯化。通过使用甲醇和水重结晶进一步纯化产物。
产量：73mg，160μmol，产率71.6％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.89(d，J＝8.4Hz，1H)，8.06(d，J＝2.4Hz，1H)，7.63(dd，J＝9.6，2.4Hz，1H)，7.51(d，J＝11.7Hz，1H)，6.42(t，J＝7.2Hz，1H)，4.2-4.3(br，1H)，3.88(d，J＝13.5Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.15(t，J＝12.9Hz，1H)，2.6-2.8(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.4-1.6(m，1H)，1.2-1.4(m，3H)，0.9-1.1(m，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例48
合成(S)-1-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)-3-(三氟甲基)苯基)脲
方案
反应根据合成路径2进行。使3，4-双(三氟甲氧基)苯胺(60mg，230μmol)与(S)-1-(4-氨基哌啶-1-基)-2-甲基丁-1-酮(64mg，347μmol)反应。产物通过快速色谱法使用乙酸乙酯纯化。通过使用甲醇和水重结晶来进一步纯化产物(68mg，144μmol，产率62.7％)。
产量：68mg，144μmol，产率62.7％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.86(d，J＝7.5Hz，1H)，7.91(s，1H)，7.47(d，J＝11.7Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.7，2.4Hz，1H)，6.39(t，J＝7.8Hz，1H)，4.2-4.3(br，1H)，3.88(d，J＝12.3Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.15(t，J＝11.4Hz，1H)，2.6-2.8(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.4-1.6(m，1H)，1.2-1.4(m，3H)，0.97(s，3H)，0.8-0.9(m，3H)
实施例49
合成4-(3-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)哌啶-1-羧酸乙酯
方案
向哌啶B(30mg，93.5μmol)和三乙胺(11.6mg，115μmol)的悬浮液中逐滴加入氯甲酸乙酯(29.6mg，274μmol)。将反应在室温下搅拌12小时并通过添加硅胶(50mg)淬灭。使浆液在真空中干燥并施用快速色谱法。将产物经乙酸乙酯∶己烷(4∶1)洗脱并通过TLC监测。在真空中干燥所收集的馏分得到最终白色粉末。
产量：87.1％(32mg，81.4μmol)纯度：≥95％(H-NMR)
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：8.78(s，1H)，7.66(dd，J＝14.1，2.4Hz，1H)，7.38(t，J＝9Hz，1H)，7.09(d，J＝12Hz，1H)，6.34(d，J＝9Hz，1H)，4.02(q，J＝6.9Hz，2H)，3.85(d，J＝13.5Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，2.8-3.0(m，2H)，1.79(t，J＝10.2Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)，1.18(t，J＝7.2Hz，3H)
实施例50
合成4-(3-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)脲基)哌啶-1-羧酸乙酯
方案
向哌啶D(30mg，97μmol)和三乙胺(13.1mg，129μmol)的悬浮液中逐滴加入氯甲酸乙酯(31.9mg，294μmol)。将反应在室温下搅拌12小时并通过添加硅胶(50mg)淬灭。使浆液在真空中干燥并施用快速色谱法。将产物经乙酸乙酯∶己烷(4∶1)洗脱并通过TLC监测。在真空中干燥所收集的馏分得到最终白色粉末。
产量：90.2％(33mg，87.5μmol)纯度：≥95％(H-NMR)
1H NMR(d6-DMSO，600Mhz)：9.02(s，1H)，7.65(d，J＝14.1Hz，1H)，7.58(t，J＝8.7Hz，1H)，7.19(d，J＝9Hz，1H)，6.45(d，J＝7.5Hz，1H)，4.02(q，J＝6.9Hz，2H)，3.85(d，J＝13.5Hz，2H)，3.6-3.8(m，1H)，2.8-3.0(m，2H)，1.80(dd，J＝12.6，3.3Hz，2H)，1.2-1.4(m，2H)，1.18(t，J＝7.2Hz，3H)
实施例51
合成1-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-3-(1-(2-甲基丁酰基)哌啶-4-基)脲
方案
反应根据合成路径1，步骤3进行。使哌啶B(52mg，161.8μmol)与(S)-2-甲基丁酸(24mg，243μmol)反应。将产物通过快速色谱法纯化并经乙酸乙酯洗脱。在真空中干燥所收集的馏分，得到白色固体。通过使用乙酸乙酯和己烷重结晶进一步纯化产物。
产量：52mg，145μmol，产率89.9％。纯度(H-NMR)：≥95％
1H NMR(d6-DMSO，300Mhz)：8.75(d，J＝6.9Hz，1H)，7.67(dd，J＝13.5Hz，2.4Hz，1H)，7.39(t，J＝9.3Hz，1H)，7.11(d，J＝8.7Hz，1H)，6.3-6.4(m，1H)，4.23(m，1H)，3.88(d，J＝10.8Hz，1H)，3.6-3.8(m，1H)，3.1-3.2(m，1H)，2.6-2.8(m，2H)，1.7-1.9(m，2H)，1.5-1.6(m，1H)，1.1-1.4(m，3H)，0.9-1.0(m，3H)，0.7-0.9(m，3H)
实施例52
癫痫发作测定
戊四氮(PTZ)诱导的癫痫发作模型
使用涉及施用惊厥前药戊四氮(PTZ)的标准灵敏测试(standard acute test)来研究sEH抑制剂的中枢神经系统穿透功效。在皮下戊四氮(PTZ)测试中，通过皮下途径施用80mg/kg的PTZ，持续30分钟监测第一次阵挛性癫痫发作(阵挛)的发作时间、强直性后肢伸展和致死性(强直性痉挛)的时间。使用PEG400作为媒介物将sEH的抑制剂完全溶解得到澄清溶液。在根据早先数据以单一区别剂量施用惊厥前药之前1小时，经腹膜内途径施用抑制剂或媒介物。这个剂量的PTZ在施用后30分钟内产生100％致死性。
发现化合物29保护小鼠免于惊厥以及相关的致死，表明本文中主张的化合物可穿过血脑屏障(图7)。PTZ是一种诱导癫痫发作的化学品。认为此测定具有从小鼠到人类的高度可平移性。在这个完全取决于化合物穿过血脑屏障的能力的癫痫发作测定中，化合物29展示出显著功效，表明此化合物容易穿透CNS并保护小鼠免于癫痫发作(图7和8)。
实施例53
FRET-位移测定程序
如先前所述对表I化合物进行FRET测定以测定Ki(Lee等人，Analytical Biochemistry 434(2013)259-268)。为了防止荧光杂质从塑料管中浸出并与sEH抑制剂非特异性结合，将抑制剂储备溶液(10mM，DMSO)储存在玻璃小瓶。此外，将sEH用磷酸钠缓冲液(PB)(100mM磷酸钠，pH 7.4，0.01％明胶)稀释到想要的浓度(20nM)以避免非特异性结合至比色皿表面造成蛋白质损失。在此测定中使用的所有缓冲液均通过灭菌过滤装置(Durapore PVDF膜，孔径：0.22um)过滤
在96孔板中测量
在96孔板形式中基于FRET的位移测定的所有测量均是在TECAN M1000Pro 96孔荧光板读数器中进行。
96孔板的预处理：
为了防止sEH或抑制剂非特异性结合在96孔板上，将所述96孔板用PB与0.1％明胶在室温下预先孵育过夜。明胶包覆所述板并防止sEH和sEH抑制剂非特异性结合至板上。将缓冲液丢弃且在使用前将板干燥。
测定程序
经PB(100mM磷酸钠，0.1％明胶，pH 7.4)将sEH储备液稀释至想要的浓度(20nM)。将ACPU(对于sEH为1当量，10mM，乙醇)添加到sEH溶液中并在室温下孵育2小时。将sEH-ACPU混合物(20nM，100mM磷酸钠，0.1％明胶，pH 7.4，150uL)添加到各个孔。
在z位置之后测量样品的基线荧光(F0)(λ激发为280nm，λ发射为450nm)且增益通过荧光计自动优化。z和增益值被记录，并将用于以后的荧光测量。因为已知DMSO猝灭荧光，所以将PB中的1％DMSO用作对照(FDMSO)。想要的抑制剂浓度是sEH 100％结合至抑制剂的浓度，将该浓度加入第一个孔中并在所有其余孔中进一步稀释2倍。根据我们的研究，12个基准点对应于12种不同的抑制剂浓度，提供了重要数据来计算抑制剂的精确Ki。将样品在30℃下孵育1.5小时。随后，使用先前获得的z位置和增益值测量样品的荧光(λ激发为280nm，λ发射为450nm)。将得到的荧光信号如下转换，并根据以下“曲线拟合”部分用来计算抑制剂的Ki。
初始荧光＝FDMSO(孔X)/F0(孔X)
饱和荧光＝F在饱和浓度下(孔X)/F0(孔X)
观察到的荧光＝F(孔X)/F0(孔X)
曲线拟合
Ki测定的曲线拟合先前有报导(Lee等人)。数据处理和Ki计算是基于Wang(Febs Letters 360(1995)111-114)的原始著作，Roehrl等人(PNAS 101(2004)7554-7559)提出修改。
位移测定是基于三态平衡结合模型的。这被如下所述建模(等式1)
其中[RI]代表受体或酶抑制剂复合物；
L代表报告配体；
I代表抑制剂；
[RL]代表受体或酶-报告配体复合物。
三态平衡(等式1)由sEH-抑制剂复合物、sEH和sEH-报告配体复合物组成。在这项研究中，相对于sEH抑制剂的浓度绘制相对荧光强度(F3)，并将得到的曲线拟合入由Wang关于三态平衡导出的等式(等式2)。
其中a＝Kd1+Kd2+L+I-R；
b＝Kd2(L-R)+Kd1(I-R)+Kd1Kd2；
c＝-Kd1Kd2R；且
θ＝arccos{(-2a5+9ab-27c)/[2(a2-3b)5/2]}。
其中F3＝相对荧光＝(观察到的荧光-饱和荧光)/(初始荧光-饱和荧光)
I＝添加的未经标记的竞争配体的浓度；
R＝sEH的总浓度；
L＝报告配体的总浓度；
Kd1＝报告配体的解离常数(通过荧光结合测定发现)，以及；
Kd2＝抑制剂的抑制常数
koff测量程序
koff测量如前所述进行。[10]将sEH(8μM)用选定抑制剂(8.8μM，100mM PB缓冲液，pH 7.4)在室温下预先孵育1.5小时。随后将sEH-抑制剂复合物用ACPU(20μM，100mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)稀释40倍。每30秒直至5100秒立即监测荧光(λ激发为280nm，λ发射为450nm)。相对于时间(秒)绘制荧光(λ发射为450nm)数据。将由此得到的曲线拟合单一指数增长并获得相关的koff。
实施例54
疼痛反应的测定
糖尿病大鼠疼痛反应的测定的等级模型
采用雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250-300克。动物被个别地安置在标准条件下，自由获取食物和水，并且实验前保持至少1周。使用von Frey机械异常性疼痛测试对疼痛量化。所有的实验都是在一天中的相同时间在日光光周期期间进行。
首先在两个单独的时间期间将大鼠训练至实验室。在诱导神经病变的当天，测量动物对测试的基本反应，然后静脉内施用链脲霉素(55mg/kg)以诱发糖尿病状态。随后追踪动物们神经性疼痛随时间的发展，所述疼痛发生在7-10天。随后在疼痛症状发作大约一周后经皮下施用测试化合物。如配图说明所示，在几个小时的时间内测量疼痛反应。通过将化合物溶解在载剂中来配制，以得到配图说明中所示的量。每组至少使用六只动物，不过一些实验中使用十二只大鼠。von Frey测试是通过用连接到测力传感器(IITC Inc，Woodland Hills CA)的校准细丝刺激大鼠后爪的足底面来进行的。随着此细丝的应用，施加在爪上的力的量增加，且当力达到它的阈值时，动物撤回它的爪子。此刻的力通过连接到测力传感器上的显示器以电子方式展示。
在使用I型糖尿病大鼠的疼痛反应测定中，本公开的化合物胜过注册的神经性疼痛的标准药物加巴喷丁和标准sEH抑制剂APAU。本公开的化合物更快速达到高的功效水平。此外，本公开的化合物与本领域的标准相比显示出更高的效能和更高的功效(图6)。
虽然本发明已经参照上述实施例作了描述，但应理解的是，修改和变动包括在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅受以下权利要求限制。
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