抗牛支原体蛋白Md-UF1的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具有涉及抗牛支原体蛋白基因 IUF1、抗牛支原体蛋白 Md-UFl及其在制备治疗牛支原体引起传染性疾病药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 牛支原体Αοια'5·)是感染牛的致病性病原体，于1961年首 次从患有乳房炎的病牛中分离出来，1976年被报道与牛呼吸系统疾病有关。近年来，该病原 引起的疾病已在我国普遍发生，给我国畜牧养殖业造成了巨大的经济损失。
[0003] 目前，仅有美国具有商业化的疫苗用于预防牛支原体的感染，而其它国家均采用 抗菌药物对其进行治疗，由于抗生素的广泛使用，甚至滥用，使出现耐药株，且耐 药率较高，其产生耐药性的直接后果不仅给控制和治疗该病带来困难，也加剧了抗生素在 牛体内的残留，为此，研制新型抗I Aoris药物已迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种家蝇抗菌蛋白Md-UFl及编码该蛋白的基因。
[0005] 抗菌蛋白Md-UFl基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示； 抗菌蛋白Md-UFl，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示； 抗菌蛋白Md-UFl基因的制备方法，它包括： 1) 提家蝇幼虫总RNA，分离提纯mRNA，反转录合成cDNA ; 2) 以cDNA为模板，用引物： Pl 5'-GCGAATTCATGGGAGTCTTCA-3' ； P2 5'-CGCAGCTCGAGTTACTGAATATAAA-3' ； 扩增。
[0006] 抗菌蛋白Md-UFl表达载体，它是在表达载体上插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示 的基因。
[0007] 所述的表达载体为pET_32a。
[0008] 表达抗菌蛋白Md-UFl的工程菌，它转染了上述的抗菌蛋白Md-UFl表达载体的大 肠杆菌。
[0009] 抗菌蛋白Md-UFl在制备治疗牛支原体引起的疾病药物方面的应用。
[0010] 本发明提供了抗牛支原体蛋白Md-UFl，它是用肺炎支原体诱导家蝇幼虫，构建了 抑制性消减文库，在抑制性消减文库中筛选，得到了抗牛支原体蛋白基因 IUF1，表达了抗 牛支原体蛋白Md-UFl，经实验证明，对牛支原体有较强的抑制作用。
【附图说明】
[0011]图1肺炎支原体"煎蛋样"菌落； 图2肺炎支原体16S rRNA基因的扩增结果；其中，M: DL2000; 1-3:16S rRNA PCR产 物；4:阳性对照； 图3 IUFl基因的扩增结果； 图4纯化的抗牛支原体蛋白Md-UFl，SDS-PAGE分析结果。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1肺炎支原体诱导家蝇幼虫后抑制性消减文库的构建及抗牛支原体蛋白 基因筛选 一、 诱导菌株肺炎支原体分离鉴定 采集自患肺炎的猪的肺脏病灶，按支原体分离培养程序分离培养，经菌落形态学观察， 分子生物学方法对分离菌进行鉴定，结果显示，分离菌菌落在40倍普通光学显微镜下观察 其菌落形态具有"油煎蛋"样典型特征(见图1)，初步证明所分离菌为支原体。
[0013] 采用肺炎支原体16S rRNA全长引物对其进行鉴定(见表1)，扩增出约1.5kb的片 段(见图2)，与预期片段大小相符，该基因片段测序后使用BLAST对其碱基序列进行分析， 其结果显示，所分离菌株的16S rRNA相应序列与Genbank登陆的肺炎支原体同源性为99%， 进一步证明所分离菌株为肺炎支原体。
[0014] 表1引物序列
二、 肺炎支原体诱导家蝇幼虫后抑制性消减文库的构建 选用2、3日龄家幡（Jfesca Z.)幼虫来源（品种为绿头幡，幡卵购买自吉林 省辽源生态养殖厂，由吉林农业大学药理与毒理实验室孵育)。采用2号昆虫针蘸取肺炎支 原体菌液(浓度为108ccu/mL)刺入家蝇幼虫（3日龄）腹部，每虫1针。以蘸取菌液针刺的 为诱导组，空针刺作为对照组。将同等数量的诱导组和对照组家蝇幼虫置于人工气候箱中， 在相同条件下(温度为25~35°C，湿度65~75%)培养24h。分别提取实验组及对照组家蝇幼 虫的总RNA，利用磁珠法分离mRNA，反转录获得cDNA，采用SSH技术，构建肺炎支原体诱导家 蝇幼虫后的抑制性消减文库，结合反向Northern杂交技术筛选出差异基因，并进一步通过 RACE技术获取差异基因的全长。实验结果表明，本研宄成功构建了肺炎支原体诱导家蝇幼 虫后的抑制性消减文库，从正向消减文库中得到689个单克隆，通过PCR筛选得到568个单 克隆，随机挑取的阳性克隆的大小均在200~750bp之间。
[0015] 三、基因的筛选 通过斑点杂交技术共筛选出186个差异基因片段，对差异基因克隆、测序及同源性分 析后共鉴定出21个无同源序列片段，12个抗菌肽基因片段以及其它19个其它编码蛋白的 基因片段。进一步通过cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE) 对一未知功能基因 （unknown functional gene of ifesca 简称 #oHJFl)进行扩 增，产物测序分析。通过T-A克隆技术，将全长PCR产物克隆至pMD18-T Vector中，成功构 建出阳性克隆质粒i^UFl-pMDlS-T。MUFl基因全长ORF序列531bp ; 实施例2抗牛支原体基因 IUFl的克隆 1、 用Promega公司生产的试剂盒（SV Total RNA Isolation)提取家幡三日龄幼虫总 RNA，用 TaKaRa 公司生产的试剂盒 ft/igoii^r^-oTJiXSupei^mRNA Purification Kit (From Total RNA)分离提纯 mRNA ; 2、 反转录合成cDNA第一链 (1)取两个EP管，分别加入以下试剂见表2 : 表2反应体系
(3)混匀，瞬时离心，PCR仪中42°C温浴90min，70°C温浴lOmin。
[0016] (4)瞬时离心，各加 Tricine-EDTA Bufer250 μ L稀释反应产物，于-80°C保存。
[0017] 3、所用引物： Pl 5'-GCGAATTCATGGGAGTCTTCA-3' ； P2 5'-CGCAGCTCGAGTTACTGAATATAAA-3' ； 以cNA为模板进行扩增，扩增产物插入pMD18-T中，经及^ I、ZAo I双酶切鉴定，得 531bp条带，如图3所示，阳性质粒送往生工生物工程(上海）股份有限公司测序后去除载 体、酶切位点（斜体部分）和保护碱基后，得到一条全长ORF为531bp的序列。IUFl基因 其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 运用NCBI上的BLASTX与已经公布基因的氨基酸同源性进行分析，结果显示与 Genbank 登录号为 ΧΡ_005184638· 1 的家幡未知功能蛋白 L0C10189111 (uncharacterized protein L0C101891119 [Musca domestica]) 一致性为 92%〇
[0019] 实施例3抗牛支原体蛋白IUFl表达纯化 1) 将质粒 #0^υΡ1-ρ]\ω?8-Τ，ρΕΤ-32Β(+)，经 1、通〇 I 双酶切，将 MUFl 基因插入 pET-32a(+)中，构建出重组表达质粒Md-UFl-pET-32a ; 2) 转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，经IPTG诱导表达； 3) 利用镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA Agarose)对蛋白进行纯化。
[0020] 用含有500mM咪唑的洗脱液分步洗脱目的蛋白，使蛋白从柱子上脱离下来， SDS-PAGE分析结果见图4。
[0021] 利用微量紫外分光光度计NANO DROP 2000测Ni-NTA Agarose柱纯化后的蛋白浓 度如下：Md-UFl-pET-32a蛋白浓度为2. 5mg/mL。
[0022] 实施例4抗牛支原体蛋白Md-UFl 以本实验室在临床分离的多株牛支原体为试验菌，采用微量稀释法分别测定。
[0023] 不同浓度的抗牛支原体蛋白Md-UFl对牛支原体的抑菌活性结果如表4,结果重复 三次。
[0024] 表4 Md-UFl蛋白对牛支原体的抑菌活性结果
+无菌· -有菌· a最低抑菌浓度. ε阴性对照：生理盐水. 结果表明，#+υΡ1-ρΕΤ-32&表达的融合蛋白对牛支原体具有抑制作用。
【主权项】
1. 抗菌蛋白Md-UFl基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。2. 抗菌蛋白Md-UFl，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。3. 抗菌蛋白Md-UFl基因的制备方法，它包括： 1) 提取家蝇幼虫总RNA，分离提纯mRNA，反转录合成cDNA ; 2) 以cDNA为模板，用引物： Pl 5' -GCGAATTCATGGGAGTCTTCA~3,； P2 5'-CGCAGCTCGAGTTACTGAATATAAA-3' ； 扩增。4. 抗菌蛋白Md-UFl表达载体，它是在表达载体上插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的 基因。5. 所述的表达载体为pET-32a。6. 表达抗菌蛋白Md-UFl的工程菌，它转染了权利要求3所述的抗菌蛋白Md-UFl表达 载体的大肠杆菌。7. 抗菌蛋白Md-UFl在制备治疗牛支原体引起的疾病药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗牛支原体蛋白Md-UF1，它是用肺炎支原体诱导家蝇幼虫，构建了抑制性消减文库，在抑制性消减文库中筛选，得到了抗牛支原体蛋白基因Md-UF1，表达了抗牛支原体蛋白Md-UF1，经实验证明，对抗牛支原体蛋白Md-UF1牛支原体有较强的抑制作用。
【IPC分类】A61P31/04, C07K14/435, C12R1/19, A61K38/17, C12N1/21, C12N15/70, C12N15/12
【公开号】CN104946658
【申请号】CN201510436142
【发明人】马红霞, 万玲, 孔令聪, 刘树明, 高铎
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月23日