本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及猪支气管上皮细胞系、制备方法及其应用。
背景技术：
：：猪传染性疾病在世界范围内对养殖业及人类都是一主要的健康威胁，目前对猪的疾病研究早已成为兽医学研究的一个重点。对猪而言，传染性疾病多发于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常发病，对猪的危害最大。目前多种病毒、细菌、寄生虫等微生物被认为是可引起猪呼吸系统疾病的病原，如猪场常见的猪肺炎支原体、猪蓝耳病、2型圆环病毒、猪流感病毒等。然而相较于人类和禽类，猪类病原的研究还相对比较薄弱，特别是这些病原在猪呼吸系统疾病的产生中如何产生作用，致病机理如何，尚不明确。目前，对猪类呼吸道病原的研究主要集中在猪体内感染，尚缺乏合适的宿主细胞模型，例如支气管上皮细胞系。由于原代支气管上皮细胞在体外培养难以长期传代生存，在当前的细胞培养条件下，原代上皮细胞在医学领域上的应用受限主要由于其有限的增殖特性，既在于其上皮相关特性在几代内就会消失也在于分离组织的量的有限性。和大多数哺乳动物体细胞一样，这些原代细胞生命有限并且将停止分裂，在一定数目的细胞分裂后随即开始衰老。所有的这些固有的缺点都急需制备获得可延长寿命的永生化的细胞系，因此制备永生化的猪支气管上皮细胞具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供猪支气管上皮细胞系，能够稳定传代至60代以上，且保留有原代细胞的特性。本发明的另一目的是提供该猪支气管上皮细胞系的制备方法，该方法巧妙、显著提高了筛选效率。本发明的再一目的是提供所述猪支气管上皮细胞系htert-pbec在研究猪呼吸道病原感染致病机理中的应用。本发明的目的采用如下技术方案实现：猪支气管上皮细胞系htert-pbec，保藏编号为cctccno：c201749。本发明还提供猪支气管上皮细胞系htert-pbec的制备方法，包括如下步骤：(1)构建携带绿色荧光蛋白基因和人端粒酶逆转录酶基因的真核表达载体pegfp-htert；(2)利用lipofectamin3000将真核表达载体pegfp-htert转染猪原代支气管上皮细胞，通过g418筛选得到猪支气管上皮细胞系htert-pbec。在本发明中，所述真核表达载体pegfp-htert是将人端粒酶逆转录酶基因插入荧光真核表达载体pires2-egfp后获得的。本发明还提供所述猪支气管上皮细胞系htert-pbec在研究猪呼吸道病原感染致病机理中的应用。在本发明中，术语细胞“永生化”是指细胞经体外培养后自发或在外界因素的影响下脱离增殖衰老，最终获得无限增殖能力的过程。本发明成功尝试从幼龄雄性二元猪活体动物中取得完整的气管组织和肺脏，并通过解剖镜及显微器械成功剥离得到支气管后，用差速贴壁及胶原酶混合胰酶消化的方法首次得到纯度很高的猪原代支气管上皮细胞，并成功得以传代。对已有的链蛋白酶消化法进行了改进，大大节省了消化时间，同时也减轻了组织的损伤，最大程度地保持了组织原始状态。首次成功构建含有人端粒酶逆转录酶基因并携带绿色荧光蛋白的真核表达载体pegfp-htert，并将该真核表达载体利用lipofectamin3000转染猪原代支气管上皮细胞，可以直观地通过在转染24小时后观察荧光的方法得知是否转染成功，为后续g418筛选单克隆提供基础，显著提高了筛选效率，并成功获得能够稳定传代至60代以上的永生化的猪支气管上皮细胞系htert-pbec。通过对角蛋白18的间接免疫荧光试验及后续猪原代支气管上皮细胞和猪支气管上皮细胞系htert-pbec特性分析，证实支气管上皮细胞系htert-pbec保持了原代支气管上皮细胞的特性，为研究猪肺炎支原体等猪呼吸道病原感染的致病机理提供了重要的实验材料和实践基础，具有重要的应用价值。附图说明图1：猪原代支气管上皮细胞的分离、培养及鉴定。a：麻醉后腹部切口放血以防喉部大量的血细胞污染气管，喉部切口获得整个喉头连接的气管及猪肺组织；b：解剖镜及显微镊子、显微剪刀剥离气管周围的肺组织后获得的猪支气管组织；c：猪支气管组织差速贴壁后的初代集落的猪支气管上皮细胞形态；d：传代后的第三代猪原代支气管上皮细胞角蛋白18间接免疫荧光鉴定图。图2：真核表达载体pegfp-htert双酶切鉴定电泳图。泳道1为dl15000的marker；泳道2为真核表达质粒pegfp-htert经ecorⅰ和salⅰ双酶切鉴定，上面的条带为载体pires2-egfp，大小为5.3kb，下面的条带为插入的人端粒酶逆转录酶基因片段，大小为3.45kb。图3：永生化的猪支气管上皮细胞系的鉴定。a：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的荧光数量和强度图(100倍视野下)；b：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的角蛋白18的间接免疫荧光鉴定。图4：猪支气管上皮细胞系htert-pbec与猪原代支气管上皮细胞增殖情况比较。a：猪支气管上皮细胞系htert-pbec与猪原代支气管上皮细胞的生长曲线测定比较；b：第4代的猪原代支气管上皮细胞形态；c：第60代猪支气管上皮细胞系htert-pbec的细胞形态；d：猪原代支气管上皮细胞细胞周期检测分布情况；e：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec细胞周期检测分布情况。其中图d、e的横坐标为cellnumber，即计数到的有效细胞数，纵坐标为dna量。图5：猪支气管上皮细胞系htert-pbec与猪原代支气管上皮细胞的特性分析。a：端粒酶逆转录酶htert基因的rt-pcr检测，m为dl2000的marker，1-3泳道分别为第四代猪原代支气管上皮细胞、阳性对照人喉癌细胞hep-2和第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec；b：htert基因的westernblot检测；m为蛋白预染marker(最上面最大的条带为170kda)，1-3泳道分别为第四代猪原代支气管上皮细胞、阳性对照人喉癌细胞hep-2和第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec；c：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的体外琼脂依赖性试验显微镜100倍视野下示意图；d：阳性对照hep-2细胞的体外琼脂依赖性试验显微镜100倍视野下示意图；e：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的染色体核型分析示意图；f：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的染色体核型重排示意图。图6：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec和猪原代支气管上皮细胞的基因表达水平的相对荧光定量qpcr检测。纵坐标是log2(mrna在猪支气管上皮细胞系htert-pbec中的表达水平/mrna在猪原代支气管上皮细胞中的表达水平)。图7：第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的体内裸鼠致瘤性检测示意图，其中a-c分别为阳性对照hep-2细胞腋下皮下注射裸鼠后肿瘤形成示意图，100倍he染色病理切片示意图，200倍he染色病理切片示意图。d-e分别为第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的体内裸鼠致瘤性检测示意图，100倍he染色病理切片示意图和200倍he染色病理切片示意图。生物保藏猪支气管上皮细胞系htert-pbec于2017年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：c201749，分类命名：猪支气管上皮细胞系htert-pbec。具体实施方式下面结合具体实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，例如《分子克隆实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)(sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商建议的方法。实施例1猪支气管组织的分离、原代细胞的培养及鉴定1.猪支气管组织的分离(1)速眠新(购自佛山市双平宠物用品有限公司)，前肢静脉麻醉致死50日龄的清洁级雄性杜长大二元杂交猪(购自南京洲邦生物科技有限公司)并四肢固定后，酒精消毒待处理表皮组织后使用一套手术器械(剪刀、镊子各两把，眼科剪、眼科镊各一把)腹部切口放血。(2)手术剪自喉部至胸部最后一根肋骨为止纵向剪开皮肤，沿两侧肋骨横向剪开皮肤，分离皮肤。(3)另一套手术器械(剪刀、镊子各两把，眼科剪、眼科镊各一把)，分离喉部肌肉，暴露气管，用剪刀沿分离好的皮肤边缘，去除肋骨，暴露胸腔。(4)纵向剪断气管，提起气管，自上而下，逐步分离气管及肺组织，止血钳夹紧气管上端后剪断气管，将整个喉头连接的气管及完整肺脏组织采用pbs清洗后(见图1a)，移入超净台待进行支气管组织的分离。(5)将获取的肺组织用平头镊子分成单个肺叶后，借助解剖镜，使用显微器械即显微镊子及显微剪刀去除支气管周围的肺组织，分离出支气管组织，注意勿用力撕扯。分离出来的支气管形态见图1b。2.猪原代支气管上皮细胞的培养(1)支气管组织的消化将分离好的支气管组织用pbs缓冲液洗净，剪碎成约1mm3大小后加入0.5mmol/l的edta溶液2ml，胶原酶ⅰ溶液(worthington)2ml和0.25％胰酶溶液1ml，37℃消化作用45min，每15min超净台内取出10μl显微镜下观察消化情况。(2)培养液和培养条件①基础培养基：dmem/f12培养基(gibico)。②细胞培养液：初代细胞刚贴壁使用dmem/f12+10％胎牛血清，配制方法：在dmem/f12培养基中添加终浓度为10％胎牛血清；贴壁后12小时更换含有低浓度血清的培养基即dmem/f12+2％胎牛血清+调节因子，配制方法：在dmem/f12培养基中添加终浓度为2％胎牛血清、10ng/ml人上皮生长因子、0.1ng/ml视黄酸(sigma)和begm套装里的全套上皮细胞调节因子(lonza,cat.no.cc-4175)。begm套装里的全套上皮细胞调节因子中各物质在该培养基中的浓度如下：26μg/mlbpe(牛垂体提取物)，15.5ng/mlhegf(人上皮生长因子)，5μg/ml人胰岛素，1.4μm氢化可的松，2.7μm肾上腺素，9.7nm碘甲状腺原氨酸，0.3nm维甲酸，10μg/ml转铁蛋白。每隔一天更换培养基一次。③终止液：dmem/f12+10％胎牛血清，配制方法是在dmem/f12培养基中添加终浓度为10％的胎牛血清。④0.125％胰酶：采用dhanks液(购自北京鼎国生物技术有限公司)将购自gibico的0.25％浓度的商品化胰酶稀释一倍，调ph至7.5-8.0。(3)猪原代支气管上皮细胞的培养与传代方法①初代支气管上皮细胞的培养支气管组织消化45min后，加入终止液终止消化。200目滤网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀用dmem/f12+10％胎牛血清重悬后接种在4个10cmdish(细胞培养皿)中放入细胞培养箱，贴壁后12h换液为dmem/f12+2％胎牛血清+调节因子，目的使分离的原代支气管上皮细胞中极少量的平滑肌细胞无法生存，避免平滑肌细胞成为优势细胞。初代支气管上皮细胞单个细胞集落形态见图1c。②原代支气管上皮细胞的传代初代支气管上皮细胞采用标题①中方法培养3-4天后，由于每个dish中细胞生长情况不一，将两个细胞密度长至80％的10cmdish的细胞一传二传代，另两个细胞较少的dish合并为一个dish。传代前的消化方法：首先弃去营养液，用dhanks液清洗一遍，用800μl0.125％胰酶消化后放入37℃培养箱，每1min观察一次细胞状态，待细胞开始变圆成单个时立即加入终止液，轻轻吹打后移入15ml离心管，尚有部分细胞未消化完全，再加胰酶消化，然后1000rpm离心，弃上清，沉淀用dmem/f12+2％胎牛血清+调节因子一传二至6cmdish中静置培养。5个dish的第二代的原代支气管上皮细胞一半用于接种至24孔细胞板进行后续试验，一半接着传代至第三代，经传代后的第三代猪原代猪支气管上皮细胞形态同图4b。3.猪原代支气管上皮细胞的鉴定由于从猪活体内分离组织进行上皮细胞培养不可避免会有一些其他组织的残留，分离的支气管上皮细胞里易于混有极少量的平滑肌细胞。本发明通过在培养过程中降低血清浓度、添加上皮细胞调节因子，同时通过额外加入视黄酸和人上皮生长因子的方法使平滑肌细胞不能生存。为确定原代支气管上皮细胞的纯度，我们对分离的上皮细胞进行了鉴定。(1)形态学鉴定体外传代培养时，细胞由一个中心向外延伸突触，呈典型的柱状上皮细胞形态。胰酶消化后，细胞开始变成一个个独立的圆形细胞形态。(2)间接免疫荧光试验鉴定①间接免疫荧光试验所需试剂:抗体稀释液：吸取3ml胎牛血清(fbs)溶于27mlpbs缓冲液中，配成含有10％fbs的pbs，备用。pbst：吸取50μltween-20溶于100mlpbs缓冲液中，配成0.05％tween-20，备用。封闭液：称取bsa0.1g溶于10mlpbs缓冲液中，配成1％bsa溶液，备用。通透液：吸取0.5mltritonx-100溶于100mlpbs缓冲液，配成0.5％tritonx-100溶液，备用。抗体：一抗为鼠源的抗细胞角蛋白18单抗(即anti-cytokeratin18单抗，abcam)，用于对上皮细胞进行鉴定。二抗为fitc标记的羊抗鼠igg抗体(购自北京鼎国生物技术有限公司)。②具体试验步骤：取生长良好且传至第3代的猪原代支气管上皮细胞，用pbs缓冲液清洗2-3次后加入固定液(4％多聚甲醛)固定15min；弃去固定液，用pbs缓冲液清洗3次，然后加入封闭液封闭2h；弃去封闭液，pbst清洗3次，每次5min，每孔加入100μlanti-cytokeratin18单抗，4℃过夜；弃去一抗，pbst漂洗3次，每次5min，每孔加入200μl的fitc标记的羊抗鼠igg抗体，于37℃避光孵育1h；pbst清洗，dapi染色15min，甘油封片，镜检。③间接免疫荧光试验结果第3代的猪原代支气管上皮细胞的间接免疫荧光双染法鉴定图见图1d，其中支气管上皮细胞被染成绿色，所有细胞的细胞核被染成蓝色(包括杂细胞即平滑肌细胞的细胞核)，结果可见所获原代支气管上皮细胞的纯度很高，达95％以上。实施例2建立猪支气管上皮细胞系htert-pbec1.试验材料人端粒酶质粒pci-neo-htert(携带人端粒酶逆转录酶基因片段)及荧光真核表达载体pires2-egfp，购自biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。2.人端粒酶真核表达载体pegfp-htert的构建人端粒酶重组质粒pci-neo-htert携带人端粒酶逆转录酶基因，由于该质粒仅具有新霉素g418抗性，直接将pci-neo-htert转染猪原代支气管上皮细胞，只能盲目地通过g418筛选且极易形成对g418的抗药性，因此本发明进行了如下改进。人端粒酶重组质粒pci-neo-htert及空白质粒pires2-egfp本实验室购买保存。首先按照质粒dna小提纯化试剂盒(takara)步骤提取质粒pci-neo-htert，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后用ecorⅰ和salⅰ(takara)双酶切重组质粒，利用胶回收试剂盒(takara)纯化回收3.5kb的htert片段(genbank序列号:aac40212.1)。用ecorⅰ和salⅰ(takara)双酶切荧光真核表达载体pires2-egfp，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收。按摩尔比4:1将目的片段(htert片段)和载体(的比例)混合，加入1μlt4dnaligase(takara)，配制10μl连接体系，混匀后置于16℃连接仪过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，pcr、酶切鉴定。送该阳性克隆交南京genescript公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pegfp-htert，进而将其转化感受态大肠杆菌dh5α，涂于含卡那霉素的固体培养基平板上培养，随机挑取白色单菌落接种于含卡那霉素的lb液体培养基中，摇床培养14-16h，小量提取质粒pegfp-htert。3.重组质粒pegfp-htert的双酶切鉴定验证小量提取的重组质粒pegfp-htert，经内切酶ecori和salⅰ双酶切后得到与目的基因约3.5kb、载体约5.3kb大小一致的两个片段，结果显示重组质粒构建正确(如图2所示)。采用去内毒素质粒提取试剂盒(omega)提取重组质粒pegfp-htert和空白质粒pires2-egfp，测浓度后置于-20℃备用。4.重组质粒pegfp-htert转染猪原代支气管上皮细胞将重组质粒pegfp-htert转染猪原代支气管上皮细胞，可实现瞬时表达，可以直观地通过egfp绿色荧光蛋白为标签来分析端粒酶逆转录酶htert基因在细胞中的定位情况。(1)选取生长状态良好、传至第三代的猪原代支气管上皮细胞，在24孔板中以1×105cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80％后立即进行转染，转染前将细胞更换新鲜的含有2％澳洲胎牛血清及抗生素的培养基。(2)配置如下两组溶液a组溶液：将重组质粒pegfp-htert采用opti-mem(gibico)稀释到25μl，使质粒终浓度分别为0.5μg/25μl，1μg/25μl，1.5μg/25μl，2μg/25μl和2.5μg/25μl，依次标记为a1、a2、a3、a4、a5；将1μg质粒pires2-egfp(阴性对照)以及1μl转染试剂(空白对照)分别采用opti-mem(gibico)稀释到25μl，依次标记为a6、a7。b组溶液：另取7个ep管，试验组以2μl/μgdna的量各取lipofectamin3000转染试剂1μl，2μl，3μl，4μl，5μl采用opti-mem(gibico)稀释到25μl，依次标记为b1、b2、b3、b4、b5；各取p3000tm试剂2μl采用opti-mem(gibico)稀释到25μl，依次标记为b6、b7。(3)将a组溶液与b组溶液中编号对应的ep管进行混合(例如a1与b1)，将a组溶液用200μl移液枪轻轻吹打混匀后加入溶液b中，使质粒dna与lipofectamin3000转染试剂分别按0.5：1，1：1，1.5：1，2：1以及2.5：1比例(质粒dna质量与lipofectamin3000体积之比)混合，切忌震荡、剧烈晃动或产生大量气泡。室温静置5min。(4)小心吸取混合液，一滴滴加入步骤(1)中已换液的含有2％澳洲胎牛血清及抗生素的培养基的24孔细胞板中，放入37℃细胞培养箱，静置培养24小时后，于荧光倒置显微镜下观测质粒表达情况，并拍照，筛选单克隆。筛选单克隆的方法如下：在荧光显微镜下观察，寻找转染成功的带绿色荧光的细胞，将这些细胞挑出来使用0.125％胰酶消化后单独培养后，然后将各细胞通过有限稀释法并且在含不同浓度的g418抗性筛选作用下进行三次亚克隆，筛选得到可稳定传代的单克隆。将该单克隆命名为猪支气管上皮细胞系htert-pbec。从转染结果可见，利用lipofectamin3000转染试剂转染猪原代支气管上皮细胞时，pegfp-htert与lipofectamin3000的最佳比例为2.5：1。5.猪支气管上皮细胞系htert-pbec的传代猪支气管上皮细胞系htert-pbec的传代方法如下：在6cmdish或细胞培养板中培养的猪支气管上皮细胞系htert-pbec，首先弃去上清，通过pbs或dhanks液清洗细胞两遍后，加入0.125％的胰酶消化，放入37℃co2培养箱，每一分钟显微镜下观察一次，一般需要消化三分钟左右，待细胞突触消失细胞变圆，周边呈现白色毛刷状时加入终止液停止消化，收集液体至15ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用不添加10ng/ml人上皮生长因子和0.1ng/ml视黄酸的dmem/f12+2％胎牛血清+调节因子重悬后进行下一代的培养。猪支气管上皮细胞系htert-pbec按照上述方法传代至第60代。将猪支气管上皮细胞系htert-pbec的第60代细胞在荧光显微镜下进行观察，结果如图3a，发现猪支气管上皮细胞系htert-pbec传代至第60代仍然在荧光强度和数量上呈现明显的绿色荧光，因此本发明通过转染端粒酶基因成功获得了永生化的猪支气管上皮细胞系。对猪支气管上皮细胞系htert-pbec的第60代细胞进行上皮细胞标志物角蛋白18的间接免疫荧光试验(具体方法同实施例1标题3中(2))，结果见图3b。对比发现猪支气管上皮细胞系htert-pbec的第60代细胞纯度很高，达95％以上，与猪原代支气管上皮细胞(图1d)一致。因此，猪支气管上皮细胞系htert-pbec是永生化的细胞系。实施例3猪支气管上皮细胞系htert-pbec的检测1.细胞增长曲线的测定猪支气管上皮细胞系htert-pbec的第60代细胞和猪原代支气管上皮细胞第4代细胞以每孔250μl培养液中包含2×104个细胞的密度接种24孔细胞培养板，每天同一时间点用胰酶消化收集三个孔的细胞，进行细胞生长曲线的测定，参照文献报道的方法(honghx,zhangym,xuh,suzy,sunp.immortalizationofswineumbilicalveinendothelialcellswithhumantelomerasereversetranscriptase.molcells,2007,24(3):358-63)进行细胞计数，一直持续9天。结果如图4a所示，猪原代支气管上皮细胞和猪支气管上皮细胞系htert-pbec均呈现出先升高后下降的趋势，猪原代支气管上皮细胞生长到第5天达到峰值后下降，猪支气管上皮细胞系htert-pbec在前五天的生长慢于猪原代支气管上皮细胞，但从第6天开始猪支气管上皮细胞系htert-pbec的生长明显快于猪原代支气管上皮细胞，第7-9天两种细胞相比差异极显著(p<0.01)。2.猪原代支气管上皮细胞和猪支气管上皮细胞系htert-pbec的形态学比较猪原代支气管上皮细胞的传代不能超过6代，而将本发明构建的带有绿色荧光蛋白和端粒酶逆转录酶基因的真核表达载体pegfp-htert转染第3代猪原代支气管上皮细胞后获得的猪支气管上皮细胞系htert-pbec可传代至60代以上。图4b和图4c分别表示第4代猪原代支气管上皮细胞形态和猪支气管上皮细胞系htert-pbec第60代细胞的形态，可见猪支气管上皮细胞系htert-pbec保持了猪原代支气管上皮细胞的生长形态，未发生改变，保留了猪原代支气管上皮细胞的特性。3.细胞周期的分析收集猪支气管上皮细胞系htert-pbec第60代细胞和对照(第4代的猪原代支气管上皮细胞)，采用预冷pbs缓冲液清洗两次后，用8ml70％-80％的冰乙醇4℃固定过夜。次日取出4℃离心后，弃去上清，细胞用预冷的pbs缓冲液清洗两次后用0.3ml碘化丙啶(pi，bd生物技术有限公司)室温避光处理15min。猪支气管上皮细胞系htert-pbec样本以及对照组细胞量不少于1×106个，用于细胞周期检测。计算细胞周期中的g1/g0，g2/m或s期的细胞所占比例，利用流式细胞仪(bd生物技术有限公司)检测，结合使用flowjo软件来分析细胞周期各时期细胞分布情况，结果可见猪支气管上皮细胞系htert-pbec(图4e)s期明显高于猪原代支气管上皮细胞(图4d)，猪原代支气管上皮细胞和猪支气管上皮细胞系htert-pbec的s期所占比例分别为3.46％和15.01％，猪支气管上皮细胞系htert-pbec的s期所占比例与猪原代支气管上皮细胞相比上升了11.55％，相对应的猪支气管上皮细胞系htert-pbec的g0/g1期所占比例则低于猪原代支气管上皮细胞。上述结果表明，猪支气管上皮细胞系htert-pbec与猪原代支气管上皮细胞相比表现出了更强的增殖活性并且延长了复制周期。4.逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)(1)猪支气管上皮细胞系htert-pbec及猪原代支气管上皮细胞rna的提取用trizol试剂(invitrogen)提取猪支气管上皮细胞系htert-pbec第60代细胞、阴性对照(第4代的猪原代支气管上皮细胞)和阳性对照(人喉癌细胞hep-2)的rna，具体方法如下：将上述三种细胞置于6孔细胞板中，用pbs漂洗三次后，每个细胞孔中加入1mltrizol试剂。15-25℃(常温)静置5min，使细胞中的蛋白质完全解离后将含有细胞的液体收集到无rna酶的1.5mlep管(axygen)。加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，用漩涡振荡器充分剧烈震荡15s后在15-25℃静置2～3min。于4℃离心机中10000g离心15min，上层为水和rna，下层为蛋白质和dna。吸取上层清液，按上层清液与异丙醇的比例为1:1加入异丙醇，混匀后静置于-20℃条件下30min，取出4℃离心机中10000g离心15min，弃掉上清，沉淀即为rna。向沉淀中加入1ml75％的乙醇溶液，轻轻混匀后4℃离心机上以10000g离心5min后弃掉上清；将获得的rna样品晾干，加入适量的depc处理水溶解，采用nanodrop2000超微量分光光度计测浓度，-70℃保存备用。(2)细胞rna的反转录将上述三种细胞的rna采用反转录试剂盒hiscriptqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)(南京诺唯赞生物技术有限公司)进行反转录，具体步骤如下：①基因组dna去除：将模板rna、4×gdnawipermix以及rnase-freeddh2o放置冰上解冻，使用前将每种溶液完全混匀，瞬时离心来收集残留在管壁的液体。按照表1所示基因组dna去除体系配制混合液，彻底混匀。瞬时离心，并于42℃下孵育2min，而后置于冰上放置。②接着将反应完的pcr管取出加入5×qrtsupermixⅱ2.5μl。在42℃反应15min，85℃反应2min，获得各细胞的cdna。表1gdna去除反应体系(3)端粒酶逆转录酶htert基因的rt-pcr检测为了检测端粒酶逆转录酶htert基因在猪支气管上皮细胞系htert-pbec中的表达情况，对其进行了rt-pcr检测，以β-actin作为内参。针对人和猪mrna序列的保守区域对htert基因片段和β-actin进行引物设计，见表2。结果如图5a所示，猪原代支气管上皮细胞在661bp处未出现目的条带，而第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec和阳性对照均在661bp处出现了目的基因的条带，说明猪支气管上皮细胞系htert-pbec具有很强的端粒酶活性。表2htert基因和β-actin的rt-pcr引物序列以及扩增片段的大小5.westernblot检测具体方法参考已有报道[suf,liux,liug,yuy,wangy,jiny,hug,huas,zhangy.establishmentandevaluationofastablecattletypeiialveolarepithelialcellline.plosone,2013,8(9):e76036.]，取约6×105个第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec，第4代猪原代支气管上皮细胞(阴性对照)以及人喉癌细胞hep-2(阳性对照)，用总蛋白提取试剂盒提取细胞的总蛋白(南京凯基生物科技有限公司)。将得到的总蛋白采用nanodrop2000超微量分光光度计检测蛋白浓度，然后在液氮内放置5min，取出后进行sds-page电泳，最后进行westernblot检测。结果如图5b所示，阳性对照和第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec均在约123kda处(端粒酶逆转录酶htert)有一明显的条带，而猪原代支气管上皮细胞则未见蛋白表达。6.细胞染色体核型分析取第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec进行染色体核型的检测，参照文献(parikhn,nagarajanp,sei-ichim,sinhas,garrett-sinhala.isolationandcharacterizationofanimmortalizedoralkeratinocytecelllineofmouseorigin.archoralbiol,2008,53(11):1091-100.)中方法。具体步骤如下：(1)从培养箱中取出已培养24-36h的第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec培养皿，在培养液中，加入终浓度为0.05μg/ml的秋水仙素，在37℃细胞培养箱内放置3h，使细胞维持在分裂中期，用直头巴氏吸管将细胞用0.125％胰酶消化后，加终止液(dmem/f12+10％血清)终止，轻轻吹打混匀，然后移至15ml离心管；(2)以1000g离心10min，而后弃掉上清；(3)离心管管底的细胞沉淀放入37℃预热过的0.075mol/l的kcl，于37℃水浴锅中低渗处理20min；(4)细胞随后加入3-4ml新配置的固定液(甲醇：冰醋酸体积比＝3:1)预固定，将细胞轻轻用滴管吹匀后以1000g离心10min；(5)弃掉上清以及沉淀上层较透明的部分；(6)加入7ml新配置的固定液(甲醇：冰醋酸体积比＝3:1)，将细胞团块吹打均匀后固定30min，然后以1000g离心10min，弃掉上清，重复此步骤2次；(7)根据离心管底部细胞的多少，加入适量新鲜固定液，用滴管将细胞轻轻吹打为细胞悬液；(8)从事先准备的冰水混合物中取出载玻片，用纸轻轻擦拭注意不要使载玻片上有纸屑或起毛，用滴管将吹匀的细胞悬液在每片载玻片上滴1-3滴，注意此处细胞悬液一定要从高处迅速滴下，滴管与载玻片的距离大约有40-50cm，轻轻吹散后自然晾干；(9)用pbs缓冲液配制4％的giemsa溶液，将载玻片上的细胞染色15min，自来水冲洗，自然晾干；(10)先用低倍镜寻找良好的分裂相，再用高倍镜观察拍照；(11)用中性树胶封片，选择染色体清晰分散度好的分裂相摄影，进行核型分析。结果如图5e所示，将染色体重排，如图5f所示。从这两幅图可以看出，第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec表现出猪物种的二倍体特征，共18对常染色体和一对性染色体，证实了我们分离得到的猪支气管上皮细胞系htert-pbec具有与猪原代支气管上皮细胞一致的二倍体染色体特征，并未发生突变成为多倍体，且性染色体为雄性，也与分离采用的雄性幼龄猪的性别相一致。7.qrt-pcr检测猪原代支气管上皮细胞和猪支气管上皮细胞系htert-pbec基因的表达水平荧光定量pcr检测的目的是为了确认htert基因的导入是否对支气管上皮细胞基因的表达量有影响。首先将第4代的猪原代支气管上皮细胞和第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec用trizol试剂裂解后进行细胞rna的提取。将1μg的rna进行反转录后，使用sybr1premixextaqtm(perfectrealtime)试剂盒(takara)进行qrt-qpcr检测。一共检测了包括细胞周期(sox2、sox17、ccna1、ccna2、ccnb1和ccnb2)，先天性免疫应答(il-6、il-8、csf2、jnk1、cxcl2和stat3)以及氧胁迫应答(duox1,duox2,sod1和gpx1)在内的16个基因，而β-actin和gapdh则作为内参基因，参与qrt-qpcr的引物名称及其序列见表3。猪支气管上皮细胞系htert-pbec和猪原代支气管上皮细胞的mrna表达水平的倍数变化用2-δδct来表示。结果如图6所示，涉及细胞周期的基因，分别为sox2、sox17、ccna1、ccna2、ccnb1和ccnb2，这些基因的表达水平除了sox17外，猪支气管上皮细胞系htert-pbec相比于猪原代支气管上皮细胞而言，上调表达十分明显。与之相对的是，而涉及免疫应答和氧化应激应答的基因大部分没有变化，并且猪支气管上皮细胞系htert-pbec相对于猪原代支气管上皮细胞的相对mrna水平变化范围在基因表达水平差异显著的2倍范围以内，以上结果表明猪支气管上皮细胞系htert-pbec较猪原代支气管上皮细胞具有更强的细胞增殖能力。表3荧光定量pcr用的引物列表8.软琼脂试验和裸鼠致瘤性试验软琼脂上的是否生长是证实细胞是否具有体外致瘤性转化的最低标准。24孔细胞培养板中每个孔加入500μl含有0.5％的琼脂单层后置于4℃。第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec以及阳性细胞对照(hep-2)用胰酶消化处理后，用含有2％fbs的dmem/f12培养液以5×103、1×104和2.5×104个细胞/ml将细胞悬浮起来。紧接着，将2ml0.5％琼脂加入到1ml细胞悬浮液中，细胞悬浮液(1ml)随后覆盖于固体层的下层，然后将细胞板放置于37℃5％co2细胞培养箱下温育4周，4周后取出在显微镜下进行集落分析。结果如图5c和5d所示，阳性对照出现了细胞集落团块，而猪支气管上皮细胞系htert-pbec则无细胞集落形成，表明猪支气管上皮细胞系htert-pbec不具有体外致瘤性。为了评估猪支气管上皮细胞系htert-pbec是否具有体内致瘤性，对每只4周龄的雌性裸鼠腋下皮下注射第60代的猪支气管上皮细胞系htert-pbec约2×106个细胞，注射3只裸鼠。相同浓度的hep-2细胞作为阳性对照同样腋下皮下注射3只裸鼠。裸鼠饲养于无特定病原体环境下，并且在注射后两个月内观察裸鼠腋下是否产生肿瘤。结果如图7所示，阳性对照攻毒的裸鼠腋下出现了肿瘤(图7a)，而猪支气管上皮细胞系htert-pbec攻毒的小鼠腋下未出现肿瘤(图7d)，病理切片结果同样表明阳性对照攻毒的裸鼠表现出大量的炎性细胞浸润(图7b和图7c)，而猪支气管上皮细胞系htert-pbec攻毒的裸鼠的病理切片结果则表现出正常的结缔组织形态(图7e和图7f)。上述实验结果证明猪支气管上皮细胞系htert-pbec保持了猪原代支气管上皮细胞上皮细胞的特性，为后续研究猪肺炎支原体等猪呼吸道病原的感染机制提供了重要的实验材料和实践基础，具有重要的应用价值。当前第1页12当前第1页12