一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，制备的猪瘟病毒感染报告细胞系含有CSFV特异识别的氨基酸序列、GFP荧光淬灭序列以及GFP蛋白。该细胞系只有在感染CSFV后才发出绿色荧光，不需要后续处理，可以在病毒感染后快速、直观地报告病毒感染情况；检测灵敏度高，而且可以一次分析多个样本。该报告细胞系既可以用于CSFV的诊断，也可以用于病毒分离培养、抗病毒药物筛选及疫苗生产，在临床检测、实验室研究上具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系
[0001]【技术领域】:
本发明提供了一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，可用于报告猪瘟病毒的感染以及猪瘟病毒分离培养、抗猪瘟病毒药物的相关研究，同时提供了相应的制备方法，属于细胞生物学【技术领域】。
[0002]【背景技术】:
病毒分离培养虽然是病原微生物检测的“金标准”，但还需用血清学或分子生物学方法进行进一步鉴定，此外整个诊断周期大约需要2-7天的时间。
[0003]免疫学方法一般检测待检样品中的猪瘟病毒抗体，而病毒的抗体产生一般需要在感染后7天左右，所以此法一般不用于CSF的早期诊断。且如需要获得病毒，还要进行病毒的分离培养实验。
[0004]分子生物学方法费用较高，同时易出现假阳性结果，且确诊CSFV感染后，如需要获得病毒，还要进行病毒的分离培养实验。
[0005]病毒感染报告细胞系既可用于病毒的检测，也可用于病毒的分离培养。目前公开发表的报告细胞系主要是基于激活LTR (长末端重复序列)及其下游报告基因的细胞系，且使用的报告蛋白 主要是氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β_半乳糖苷酶、萤火虫荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶等。这些细胞系在感染相关病毒后仍需要后续处理，才能最终得出检测结果，而不能快速、直观地报告病毒感染情况。另外，目前国内外关于猪瘟病毒报告细胞系的研究尚没有报道。
[0006]
【发明内容】
:
本发明公开了一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，该细胞感染猪瘟病毒后，可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光，可用于检测猪瘟病毒的感染以及猪瘟病毒分离培养、抗猪瘟病毒药物的相关研究。
[0007]本发明还提供了猪瘟病毒感染的报告细胞系的制备方法，适用于人工制备该细胞系O
[0008]本发明提供的用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，其特征在于:
该细胞含有CSFV特异识别的氨基酸序列、GFP荧光淬灭序列以及GFP蛋白。该细胞感染猪瘟病毒后，可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光；而未感染CSFV或感染其他病毒时，该细胞系不发出绿色荧光。
[0009]本发明公开了一种真核表达报告载体pEGFP-linker-quench,用于构建上述猪痕病毒感染的报告细胞系。
[0010]本发明构建的真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench是在pEGFP_Cl载体(Clontech)的基础上，插入人工合成的DNA片段而成。
[0011]本发明公开的pEGFP-1 inker-quench上插入的人工合成的DNA片段表达后形成突光淬灭蛋白和CSFV特异性识别并剪切的肽段，且与GFP融合表达。
[0012]本发明公开的可编码荧光淬灭蛋白和CSFV特异性识别并剪切的肽段的DNA序列为:Szagatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaac
gattcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatc
gtcttggatcc~3o
[0013]本发明所述猪瘟病毒感染的报告细胞系的制备方法，包括以下步骤:
1.人工合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaacgattc
aagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttMatcc-3，其中划线部分分别为Bgl II和BamHI酶切位点。
[0014]2.真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench的构建
将上述合成的DNA片段经Bgl II和BamHI双酶切后，连接到真核表达载体pEGFP-Cl的相应酶切位点上，构建成真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench。
[0015]3.猪瘟病毒感染的报告细胞系的建立
将上述构建的真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench用AseI酶切线性化,用脂质体法转染到PK-15细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行鉴定，对鉴定正确的阳性细胞进行冻存。
[0016]3.1载体线性化:提取pEGFP-1 inker-quench质粒,用AseI酶切,然后乙醇沉淀，用无菌ddH20溶解。
[0017]3.2脂质体转染:将线性化的载体按照脂质体Fugene HD (Roche)说明书转染PK-15 细胞，5 % CO2, 37 °C培养。
[0018]3.3报告细胞系的获得:上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8_10天后，获得抗性细胞；
4.猪瘟病毒感染的报告细胞的鉴定
采用PCR法及荧光显微镜观察进行鉴定，得到猪瘟病毒感染的报告细胞。
[0019]本发明所述报告细胞系的PCR鉴定方法所用引物序列为:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5-tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_30
[0020]本发明采用PCR法及荧光显微镜观察对所获得的细胞进行鉴定，已经成功获得了猪瘟病毒感染的报告细胞，鉴定结果证明该细胞只有感染猪瘟病毒后可发出绿色荧光，且灵敏性和特异性较强，可用于CSFV感染的相关研究。
[0021]本发明的积极效果在于:制备的猪瘟病毒感染报告细胞系含有CSFV特异识别的氨基酸序列、GFP荧光淬灭序列以及GFP蛋白。该细胞系只有在感染CSFV后才发出绿色荧光，不需要后续处理，可以在病毒感染后快速、直观地报告病毒感染情况；检测灵敏度高，而且可以一次分析多个样本。该报告细胞系既可以用于CSFV的诊断，也可以用于病毒分离培养、抗病毒药物筛选及疫苗生产，在临床检测、实验室研究上具有广阔的应用前景。
[0022]【专利附图】
【附图说明】:
图1.真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench结构图；
图2.报告细胞PCR鉴定结果图；图3.报告细胞荧光显微镜观察结果图；
图4.报告细胞感染CSFV结果图；
图5.报告细胞灵敏性分析图；
图6.报告细胞特异性分析图。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例证明本发明的效果，下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0024]实施例1
真核表达报告载体pEGFP-1 inker-quench的构建 I合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaacg
attcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3,其中划线部分分别为Bgl II和BamHI酶切位点。 [0025]2实验过程
1)pEGFP-1 inker-quench的构建:用Bgl II和BamHI双酶切pEGFP-Cl载体，回收载体片段；将上述人工合成的DNA片段与回收的pEGFP-Cl载体片段连接；
2)转化将上述连接后的载体转化大肠杆菌DH5a，获得阳性菌株；
3)结果测序鉴定,成功构建了pEGFP-1 inker-quench (图1);
4)结论成功构建了用于制备猪瘟病毒感染的报告细胞系的表达质粒pEGFP-1inker-quench。
[0026]实施例2
猪瘟病毒感染报告细胞系的制备
I质粒 pEGFP-1 inker-quench ；
2细胞PK-15细胞；
3实验过程
O载体线性化:提取pEGFP-1 inker-quench质粒,用限制性内切酶AseI酶切载体，回收载体，并用无菌ddH20溶解；
2)脂质体转染:将上述线性化的载体按照脂质体转染试剂FugeneHD说明书的方法转染PK-15细胞，DMEM培养液，5 % CO2, 37 °C培养；
3)报告细胞系的获得及鉴定:上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用PCR法及荧光显微镜观察进行鉴定，得到猪瘟病毒感染的报告细胞。命名为 PK15-CSFV-GFP 细胞；
其中，本发明所述报告细胞系的PCR鉴定方法所用引物序列为:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5_tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_3 ；
4)结果可以用鉴定引物扩增出大小约为720bp条带(图2)，且在荧光显微镜下观察到该细胞不发荧光，与正常细胞无显著差异(图3)，达到了预期效果；
5)结论获得猪瘟病毒感染的报告细胞系PK15-CSFV-GFP。
[0027]实施例3
猪瘟病毒感染的报告细胞系感染CSFV实验 I细胞猪瘟病毒感染的报告细胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒CSFV ；
2实验过程PK15-CSFV-GFP细胞密度达到50-70%时，感染CSFV(6TCID50)，继续培养，并在感染后24，48，72小时用荧光显微镜观察发光情况；
3结果在感染CSFV后24，48和72小时均可以观察到较强的绿色荧光，而在未感染的细胞中无绿色荧光(图4)。
[0028]4结论猪瘟病毒感染的报告细胞系在CSFV感染后可发出较强的绿色荧光。
[0029]实施例4
猪瘟病毒感染的报告细胞系的灵敏性 I细胞猪瘟病毒 感染的报告细胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒CSFV ；
2实验过程选取上述猪瘟病毒感染的报告细胞，接种不同浓度的CSFV，在感染后48小时用荧光显微镜观察；
3结果感染48小时后，接种不同浓度CSFV的细胞中均可以观察到显著的绿色荧光，而在对照细胞中没有绿色荧光；
4结论猪瘟病毒感染的报告细胞系灵敏性较好，可用于检测CSFV感染相关研究(图5)。
[0030]实施例5
猪瘟病毒感染报告细胞系的特异性 I细胞猪瘟病毒感染的报告细胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒 CSFV, PRRSV, PRV，PCV2, HEV ；
2实验过程选取上述猪瘟病毒感染的报告细胞，分别接种CSFV，PRRSV, PRV, PCV2，HEV病毒，在感染后48小时用荧光显微镜观察；
3结果感染CSFV的细胞中可以观察到显著的绿色荧光，而在感染其他病毒的细胞及对照细胞中均没有绿色荧光；
4结论猪瘟病毒感染的报告细胞系只在感染CSFV后才发出绿色荧光(图6)。
【权利要求】
1.一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，其特征在于:该细胞在PK-15细胞的基础上插入了 CSFV特异识别的氨基酸序列、GFP荧光淬灭序列以及GFP蛋白。
2.一种真核表达报告载体pEGFP-linker-quench,其特征在于: 在pEGFP-Cl载体的基础上，插入SEQ N0.1的人工合成的DNA片段而成。
3.权利要求1所述的用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系的制备方法，包括以下步骤: 1)人工合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagctttgcaac gattcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3, 其中，划线部分分别为Bgl II和BamHI酶切位点； 2)真核表达报告载体pEGFP-linker-quench的构建 将上述合成的DNA片段经Bgl II和BamHI双酶切后，连接到真核表达载体pEGFP-Cl的相应酶切位点上，构建成真核表达报告载体pEGFP-linker-quench ； 3)猪瘟病毒感染的报 告细胞系的建立及鉴定 将上述构建的真核表达报告载体pEGFP-linker-quench用AseI酶切线性化,用脂质体法转染到PK-15细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行PCR法及荧光显微镜鉴定，对鉴定正确的阳性细胞进行冻存。
4.权利要求1所述用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系的PCR鉴定方法，其特征在于: 所用引物序列为:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5-tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_30
【文档编号】C12N5/10GK104017904SQ201410273857
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】任林柱, 陈福旺, 杨鑫, 欧阳红生, 逢大欣 申请人:吉林大学