人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
【专利摘要】本发明公开了人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途。该细胞命名为人正常支气管上皮细胞HNBEC/HL-001，保藏编号为CCTCCNO：C201311。其原代分离培养的方法为：去除肺癌患者手术切除的癌旁组织样品中脂肪，经过消化后加入分散酶和DNaseI作用，通过过滤、离心收集细胞，再用HL培养基重悬细胞，接种培养。其传代培养的方法为：细胞增殖至70～90%丰度时，用胰酶-EDTA消化，再用DMEM中和；离心收集细胞，用HL培养基重悬细胞，接种培养。本发明的细胞可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，支气管和肺相关疾病包括支气管肺癌的发病机理研究。
【专利说明】人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于细胞生物学领域，涉及一种人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途。
【背景技术】
[0003]人体重要器官如肺、肾、肝、胰腺和皮肤都由器官特异性分化的上皮细胞为其组成成分。这些特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关，如肺的气体交换功能、肾的过滤功能、肝的解毒及中和功能、胰腺细胞产生胰岛素、皮肤具有保护机体免受外界环境的伤害。而 这些重要器官一旦发生病变或退化就会威胁人类的健康，因为这些重要器官是很难被替换的，不同器官的特异性细胞也不能相互取代其它器官的细胞。这些特异性分化的细胞都是很难再生的，更不要说在体外进行培养增殖了。这样大大限制了人们对机体正常细胞功能的认识，很多来自于科技文献甚至教科书的细胞生物学知识的描述是不准确甚至是错误的。真正的原因是多数正常细胞的生物学知识来源于体外培养的“癌细胞”研究结果。尽管各国科学家始终不断的尝试着培养和增殖人体重要器官的功能性的上皮细胞，但是，对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用目前的无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/支气管及前列腺等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝、结肠、前列腺等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。
[0004]为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如P53和pRB信号通路常常被抑制。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐。在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官。在癌症研究领域，它们还常常被用来作为“正常细胞”对照，而且它们的市场价格还非常昂贵。现阶段，国内外还从未有过“正常细胞”可以应用于基础和临床医学研究。
[0005]正常人支气管上皮细胞主要功能:(I)支气管表面的上皮细胞构成了基底柱状结构，清除粘液纤毛。(2)由纤毛、无纤毛和能分泌黏液的细胞等混合细胞群组成物理屏障，可有效防止多种有毒物质。(3)产生和分泌大量化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。人支气管上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如支气管肺癌(多简称为肺癌)、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄。如果能获得体外稳定传代的人正常支气管上皮细胞，将使人们可以更全面地研究细胞的正常功能，疾病发病机理，组织器官功能重建或再造，以及测定药物对正常细胞的毒性，这些都将对基础和临床医学研究与应用有重大意义。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人正常支气管上皮细胞。该细胞分离培养自中国人的正常肺组织，该细胞未导入任何外源基因，为正常二倍体细胞，基因分型鉴定为国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法。
[0008]本发明的再一目的在于提供上述人正常支气管上皮细胞的传代培养方法。
[0009]本发明的目的还在于提供上述人正常支气管上皮细胞的用途。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种人正常支气管上皮细胞，分类命名为人正常支气管上皮细胞HNBEC/HL-001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C201311。该细胞来源于中国人的正常肺上皮细胞，染色体为二倍体，STR (短串联重复序列)基因型以16个“STR基因座/等位基因长度”来表示:AMEL/X/Y，D3S1358/17，TH01/7/8，D21Sll/31/32，D18S51/20，Penta E/11,D5S818/11/12, D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13,vffA /17，D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
[0011]所述的人正常支气管上皮细胞的培养条件优选为用HL培养基于37°C、5% CO2培养；所述的HL培养基为:DMEM与无血清培养基SFM按体积比1: 3混合，同时添加5%(v/v)的 FBS (胎牛血清)，以及 0.4 μ g/mL 皮质醇(hydrocortisone), 5 Ug/mL 胰岛素(insulin),8.4 ng/mL 霍乱毒素(cholera toxin), 10 ng/mL 表皮生长因子(epithelialgrowth factor (EGF) ),24 μ g/mL 腺嘌呤(adenine), 100 U/mL 青霉素(penicillin), 100μ g/mL 链霉素(streptomycin), 0.25 Pg/mL 两性霉素 B (Fungizone), 30 μ M 法舒地尔(Fasudil)，上述培养基需经0.22 μ m孔径滤膜过滤。
[0012]上述人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤:
(I)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集肺癌患者手术切除的癌旁正常组织样品。
[0013](2)用95-100% (v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS (0.01M,pH 7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪。
[0014](3)将组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL
培养基。
[0015](4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25% (质量体积比)胰酶-EDTA中消化。
[0016](5)加入含10% (v/v) FBS的DMEM培养基，离心去上清。
[0017](6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。
[0018](7)再加入含10% (v/v) FBS的DMEM培养基，用40-70 μ m孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清。[0019](8)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常支气管上皮细胞。
[0020]步骤(2)中所述的预冷优选为在冰上预冷。
[0021]步骤(3)中所述的消化液的用量优选为10倍于组织样品体积。
[0022]步骤(3)中所述的消化的条件优选为37°C消化I-3小时。
[0023]步骤(3)中所述的胶原酶和分散酶的浓度优选为均为0.2 mg/mL。
[0024]步骤(4)中所述的消化优选为冰上消化I小时或室温消化10分钟。
[0025]步骤(6)中所述的温水浴优选为37°C的温水浴。
[0026]步骤(4)、(5)、(7)中所述的离心优选为1000 rpm离心5分钟。
[0027]步骤(8)中 所述的培养的条件优选为37°C、5% C02。
[0028]上述人正常支气管上皮细胞的传代培养方法，包括如下步骤:
(I)当人正常支气管上皮细胞增殖至70-90%丰度时，用IXPBS (0.01M,pH 7.4)洗涤细胞，再用0.05% (质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞。
[0029](2)加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培
养瓶培养。
[0030]步骤(I)中所述的消化的时间优选为2-5分钟。
[0031]步骤(2)中所述的离心优选为1000 rpm离心5分钟。
[0032]步骤(2)中所述的培养的条件优选为37°C、5% C02。
[0033]上述人正常支气管上皮细胞可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，支气管和肺相关疾病包括支气管肺癌的发病机理研究。
[0034]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
(I)本发明提供的人正常支气管上皮细胞，原代分离培养自人的正常肺组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞。
[0035](2)本发明提供的人正常支气管上皮细胞，原代分离培养自中国人的正常肺组织，经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
[0036](3)本发明提供的人正常支气管上皮细胞，可用于人正常细胞的生理学研究，体外正常细胞的药物毒性研究和检测，支气管和肺相关疾病包括支气管肺癌的发病机理研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是人正常支气管上皮细胞的细胞形态图。
[0038]图2是人正常支气管上皮细胞的生长曲线图。
[0039]图3是人正常支气管上皮细胞的染色体核型分析图。
[0040]图4是人正常支气管上皮细胞的STR基因分型图。
[0041]图5是人正常支气管上皮细胞的药敏检测结果图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]实施例1原代人正常支气管上皮细胞的原代分离培养(I)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集肺癌患者手术切除的癌旁正常组织样品。[0044](2)消化液的配制:含胶原酶和分散酶均0.2 mg/mL的HL培养基；其中，HL培养基为:DMEM (GIBC0 # 11965-092)与无血清培养基 SFM (GIBC0 # 10744-019)按体积比I: 3混合，同时添加5% (v/v)的胎牛血清，以及0.4 μ g/mL皮质醇(hydrocortisone),5 μ g/mL 胰岛素(insulin), 8.4 ng/mL 霍乱毒素(cholera toxin), 10 ng/mL 表皮生长因子(epithelial growth factor (EGF) ),24 μ g/mL 腺嘌呤(adenine), 100 U/mL 青霉素(penicillin), 100 μ g/mL 链霉素(streptomycin), 0.25 Kg/mL 两性霉素 B (Fungizone),30 μ M法舒地尔(Fasudil )，上述培养基需经0.22 μ m孔径滤膜过滤)。
[0045](3)用用95-100% (v/v)的乙醇洗分离的组织样品I次，再用PBS (0.01M, pH
7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。
[0046](4)将组织样品I-2 cm3放入(2)的10 mL消化液的14 mL或50 mL离心管中，37°C消化I-3小时。
[0047](5)将消化后的组织低速离心(1000 rpm) 5分钟，去除上清。
[0048](6)将细胞沉淀重悬于2-5 mL的0.25% (质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上I小时或室温10分钟。
[0049](7)然后加入10 mL含10% (v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000 rmp离心5分钟；
尽量将上清去除干净。
[0050](8)加入 2 mL 温水浴(37°C )的 5 mg/mL 分散酶和 200 μ L 的 I mg/mL DNase I,用无菌的Piooo —次性塑料枪头反复吹打样品I分钟。
[0051](9)加入10 mL含10% (v/v)FBS的DMEM，用40-70 μ m孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000 rmp离心5分钟，去除上清。
[0052](10)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37。。、5% CO2。
[0053]按照上述方法分离培养成功的原代人正常支气管上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1 (排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞)。该细胞分类命名为“人正常支气管上皮细胞HNBEC/HL-001”，已于2013年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:C201311。
[0054]实施例2人正常支气管上皮细胞的传代培养
(I)当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常支气管上皮细胞增殖至70-90%丰度时，用IXPBS (0.01M, pH 7.4)洗涤细胞两次，再用0.05% (质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞2-5分钟。
[0055](2)加入10 mL完全DMEM中和消化反应1-2分种。
[0056](3)1000 rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于10 mL HL培养基中接种培养。
[0057](4)必要时可将IX IO6上皮细胞重悬于I-2 mL的细胞冻存液(90%胎牛血清和10% DMSO, v/v)中，储存于液氮中备用。
[0058]按照上述方法传代培养人正常支气管上皮细胞，培养建系的细胞生长曲线如图2，连续传代培养55天，本发明的人正常支气管上皮细胞仍能保持增殖状态正常生长。[0059]实施例3人正常支气管上皮细胞的核型分析鉴定
(I)当人正常支气管上皮细胞(I X IO6)处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μ g/mL，继续培养3.5小时。
[0060](2)反复吹打细胞使其脱落，2000 rpm离心5分钟收获细胞。
[0061](3)弃上清液，加入37°C预温的0.075 mo I/L KCl溶液8 mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37 °C低渗处理25分钟。
[0062](4)加入I mL新配制的固定剂(甲醇:冰乙酸=3:1, v/v),小心吹打、混勻，2000 rpm离心5分钟。
[0063](5)弃上清液，加入8 mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。
[0064](6) 2000 rpm离心5分钟,弃上清液，重复固定一次。
[0065](7)弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2-3滴于冰水浸泡过的载玻片上。
[0066](8)将载玻片置70°C烤箱中干烤2小时，自然冷却。
[0067](9)2.5% (质量体积比)胰酶溶液(ρΗ6.8-7.2) 5 mL处理25-45秒钟。
[0068](10) 37°C预温的生理盐水漂洗，Giemsa染色5-10分钟,做G显带分析。
[0069](11)显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；至少观察分析20个以上有丝分裂中期细胞。代表性的细胞核型分析结果见图3，人正常支气管上皮细胞为正常二倍体，46条染色体未见异常排列。`
[0070]实施例4人正常支气管上皮细胞的基因分型分析鉴定
(I)贴壁生长的人正常支气管上皮细胞(I X 106)，用I XPBS洗涤细胞两次，0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞2-5分钟，10 mL完全DMEM中和消化反应。
[0071](2)10000 rpm离心I分钟，倒尽上清，加200 μ L缓冲液GA (细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。
[0072](3)加入 20 μ L Proteinase K 溶液，混勻。
[0073](4)加入200 μ L缓冲液GB (细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70°C放置10 min，简短离心。
[0074](5)加人200 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。
[0075](6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304,天根公司)，12000 rpm离心30秒，去废液。
[0076](7)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液⑶(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000 rpm离心30秒,去废液。
[0077](8)向吸附柱中加入600 μ L漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000 rpm离心30秒,去废液。
[0078](9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-200 μ L洗脱缓冲液TE (细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2-5 min, 12000rpm (-13400 Xg)离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。
[0079](10)利用 PowerPlex? 16 HS 系统(DC2101，promega 公司)进行 16 个基因座(15个STR位点和I个性别位点)的DNA复合扩增。
[0080](11)使用ABI PRISM? 3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。
[0081](12)使用Genotyper?和PowerTyperTM 16 Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果图4，检测16个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示:AMEL/X/Y, D3S1358/17, THO1/7/8, D21S11/31/32, D18S51/20, Penta E/11,D5S818/11/12, D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13,vffA/17, D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
[0082]本发明的人正常支气管上皮细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系。
[0083]实施例5人正常支气管上皮细胞的药敏检测
(I)将人正常支气管上皮细胞用0.05%胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100 μ L，每孔约为5000个细胞，于37°C、5% CO2培养箱培养。
[0084](2)第二天加药(5-Fu (5-氟尿嘧啶)、阿霉素、顺钼)处理，每孔加入10 yL不同浓度药物，药物浓度梯度(μ M)为0.25,0.5,2.5,5.0、25、50，每种药物的每个梯度设置三个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不加药处理)及只加HL培养基的空白对照组，每组设置三个复孔。
[0085](3)药物处理(37°C、5% CO2培养箱培养)24小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10UL CKK-8检测试剂(碧云天，上海)，即10 μ L CCK-8 + 90 μ L HL培养基。
[0086](4)在37°C、5% CO2细胞培养箱内继续孵育0.5-2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验确定(可根据液体颜色变化来初步确定)，吸光度范围控制在1.0-1.5之间最好。
[0087](5 )用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0088]人正常支气管上皮细胞对三种抗癌药物5-Fu、阿霉素、顺钼的敏感性(毒性)检测结果如图5，5-Fu在低浓度和高浓度对细胞存活率影响不明显，顺钼在5 μ M以下的浓度对细胞存活率影响不大，阿霉素在2.5 μ M浓度时细胞存活率已接近O值。表明人正常支气管上皮细胞对不同药物毒性检测的敏感性和区分度。
[0089]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种人正常支气管上皮细胞，其特征在于:分类命名为人正常支气管上皮细胞HNBEC/HL-001，保藏编号为 CCTCC NO:C201311。
2.根据权利要求1所述的人正常支气管上皮细胞，其特征在于:染色体为二倍体，短串联重复序列基因型以16个短串联重复序列基因座/等位基因长度来表示:AMEL/X/Y, D3S1358/17, TH01/7/8, D21S11/31/32， D18S51/20, Penta E/ll, D5S818/11/12，D13S317/8/11, D7S820/8/13, D16S539/11, CSF1P0/10/12, Penta D/7/13, WA /17，D8S1179/15/16，TPOX/8/11, FGA/20/24。
3.根据权利要求1所述的人正常支气管上皮细胞，其特征在于:用HL培养基于37°C、5% CO2培养；所述的HL培养基为:DMEM与无血清培养基SFM按体积比1: 3混合，同时添加 5%的胎牛血清，以及0.4 yg/mL皮质醇，5 μ g/mL胰岛素,8.4 ng/mL霍乱毒素，10 ng/mL表皮生长因子，24 μ g/mL腺嘌呤，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素，0.25 Pg/mL两性霉素B，30 μ M法舒地尔。
4.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于包括如下步骤: (O收集肺癌患者手术切除的癌旁正常组织样品； (2)用95-100%的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪； (3)将组织样品用消化液消化；所述的消化液为含胶原酶和分散酶的HL培养基； (4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%胰酶-EDTA中消化； (5)加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，离心去上清； (6)加入温水浴的分散酶和DNaseI，用枪头反复吹打样品； (7)再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，用40-70μπι孔径的过滤器过滤细胞悬液,收集过滤后的细胞悬液,离心去上清； (8)重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常支气管上皮细胞。
5.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的预冷为在冰上预冷； 步骤(3)中所述的消化液的用量为10倍于组织样品体积，所述的的消化的条件为37°C消化I-3小时； 步骤(3)中所述的胶原酶和分散酶的浓度均为0.2 mg/mL。
6.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于: 步骤(4)中所述的消化为冰上消化I小时或室温消化10分钟； 步骤(6)中所述的温水浴为37°C的温水浴； 步骤(8)中所述的培养的条件为37°C、5% C02。
7.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于: 步骤(4)、(5)、(7)中所述的离心为1000 rpm离心5分钟。
8.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞的传代培养方法，其特征在于包括如下步骤: (I)当人正常支气管上皮细胞增殖至70-90%丰度时，用PBS洗涤细胞，再用0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞；(2)加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。
9.根据权利要求8所述的人正常支气管上皮细胞的传代培养方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的消化的时间为2-5分钟； 步骤(2)中所述的离心为1000 rpm离心5分钟，所述的培养的条件为37°C、5% C02。
10.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞在人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞的药物毒性研究和检测、支气管和肺相关疾病包括支气管肺癌的发病机理研究中的应用。`
【文档编号】C12Q1/02GK103451148SQ201310431352
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】李晖, 刘红亚, 冯文强, 王孝力, 陈凯 申请人:武汉大学