利用高分辨熔解曲线分析技术检测mthfr基因多态性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于预测甲氨蝶呤的药物敏感性和耐受性。
【专利说明】利用高分辨熔解曲线分析技术检测MTHFR基因多态性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的检测方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)定位于染色体lp36，cDNA全长2220bp，基因包括 11 个外显子和 10 个内含子，为 5，10-methy Ienetetrahydrof ο late reductase(NADPH)(亚甲基四氢叶酸还原酶)蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接得为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。MTHFR基因对DNA的合成、活化、修复等起调控作用，其多态性是目前疾病尤其是癌症以及遗传药理学方面研究较多的基因之一。研究发现突变频率较高的多态位点之一是C677T，存在CC、TC、TT三个基因型，CC型(野生型)最多见，其次为CT型(杂合子型)，TT型(纯合子型)最少。研究表明MTHFR基因C677T的突变频率在不同国家、同一国家不同地区及同一地区不同民族的分布有显著差异。
[0003]人类MTHFR基因C677T位于MTHFR催化区域，该位点突变直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性 ，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低。37°C时，TT型突变酶的活性为CC型酶活性的40%-50%，46°C时为35%，杂合子突变酶活性的下降程度居CC型与TT型之间。有研究发现，TT基因型的血Hcy水平明显高于CC型和CT型(P〈
0.05)，而CT型又显著高于CC型(P〈 0.05)，说明TT型和CT型患者的MTHFR酶活力有一定程度的下降，导致了高Hcy血症。McQuillan等研究了 1111例中位年龄为52岁者，发现MTHFR基因TT型突变者的血浆Hcy水平显著高于CT型和CC型。同型半胱氨酸水平升高增加了叶酸拮抗剂的毒性，而甲氨喋呤在体内正以竞争方式与二氢叶酸还原酶结合，降低叶酸的血浆浓度，导致血浆Hcy升高，严重时能引起白细胞和血小板减少，巨幼红细胞性贫血等毒副作用。由于不同患者对甲氨蝶呤的敏感性和耐受程度不同，临床用药过程中可出现不同毒副反应。遗传药理学认为人类基因组存在的基因多态性(SNPs)是造成不同个体对药物反应和耐受不同的主要遗传因素。有研究显示MTHFR基因多态性与大剂量甲氨蝶呤化疗后毒副作用存在相关性，携带C677T T等位基因患者的毒副作用高于携带C677T C等位基因的野生型基因型。对儿童急性淋巴细胞白血病患者的研究中发现:MTHFR 677位突变的白血病患儿发生甲氨蝶呤毒副反应的风险为未突变者的11.3倍。由此可见，通过对个体MTHFR基因C677T位点的基因型进行检测可以预测甲氨喋呤药物的敏感性和耐受性，为个体化用药提供依据。
[0004]目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。
[0005]本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线(High resolution melting, HRM)分析技术。其原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，饱和性荧光染料高浓度占据双链DNA所有碱基对，当双链DNA局部解链时，荧光染料释放，荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种简单易行的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的检测方法。
[0007]为了达到上述目的，本发明提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的方法，其特征在于，具体步骤为:
第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA 的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ;已知MTHFR C677T位点基因型为CC的样本DNA为阴性对照，基因型为CT的样本DNA为阳性对照1，基因型为TT的为阳性对照2。
[0008]第二步:用无菌水配制浓度为lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列为:5’ -TATTGGCAGGTTACCCCAAA-3’，MTHFR基因反向引物的序列为:5’ -TCACAAAGCGGAAGAATGTG-3’。
[0009]第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5_15分钟，92-97°C变性 10-30 秒，57-65°C退火 10-30 秒，70-75°C 延伸 10-30 秒，30-50 个循环；HRM 反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95 0C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
[0010]第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果,通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
[0011]本发明对MTHFR基因C677T位点的基因型进行检测，可用于预测甲氨蝶呤药物的敏感性和耐受性。
[0012]本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例大样本的HRM标准曲线图；
图3为本发明实施例大样本的HRM差异曲线图。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
[0016]1、采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ；
阴性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定MTHFR C677T位点基因型为CC ；
阳性对照I DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定MTHFR C677T位点基因型为CT ；
阳性对照2 DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定MTHFRC677T位点基因型为TT。
[0017]2、根据MTHFR基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计引物，确定最佳引物为18-24bp大小，PCR产物长度70-150bp，目标位点周边位置避免其他SNP位点(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列为:5’_TATTGGCAGGTTACCCCAAA -3’，MTHFR 基因反向引物的序列为:5’ - TCACAAAGCGGAAGAATGTG-3，。
[0018]3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生产，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?缓冲液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步骤2所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液
0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤I得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在1?於01-66116 Q上进行反应，PCR反应条件为95°C变性10分钟，95 °C变性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40个循环；HRM反应条件:95°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。
[0019]4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图2、图3所示，在10例口腔粘膜上皮细胞提取的DNA检测中，有5例MTHFRC677T位点基因型为CC，4例基因型为CT，I例基因型为TT。
【权利要求】
1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为: 第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA,电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul ;已知MTHFRC677T位点基因型为CC的样本DNA为阴性对照，基因型为CT的样本DNA为阳性对照1，基因型为TT的为阳性对照2; 第二步:用无菌水配制浓度为lOumol/L的MTHFR基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的MTHFR基因反向引物溶液；MTHFR基因正向引物的序列为:5’ -TATTGGCAGGTTACCCCAAA -3，，MTHFR 基因反向引物的序列为:5’- TCACAAAGCGGAAGAATGTG_3，； 第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的MTHFR基因正向引物溶液0.5ul、MTHFR基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5-15分钟，92_97°C变性10-30秒，57-65 °C退火10-30秒，70-75 °C延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒； 第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型；定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。`
【文档编号】C12Q1/68GK103525912SQ201310431133
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】吴颖臻, 张奕, 傅咏南, 王校, 毛丹丹, 卞雪莲 申请人:上海中优医药高科技有限公司