利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据HRM分析技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于为华法林的临床用药剂量提供参考，从而达到合理有效地个体化用药。
【专利说明】利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及华法林个体化用药相关基因多态性的检测方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]华法林是临床上常用的抗凝药物，通过抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的扩大和延展，抑制血栓脱落和栓塞的发生，有利于血栓的清除。临床上主要用于治疗房颤、心瓣膜修复术、再发性的中风、深静脉血栓以及肺动脉栓塞。华法林药理学作用比较复杂，即使很小的剂量-反应变化也可能导致血栓或出血。临床用药剂量可以相差20倍左右，如何正确使用华法林，合理监测调整剂量，已成为困扰临床医生的难题。华法林主要由肝细胞微粒体细胞色素P450 2C9酶羟基化后，由肾脏排出体外。另一方面华法林通过抑制维生素K环氧化物还原酶，阻止维生素K还原形式KH2的形成。KH2通过对维生素K依赖性凝血因子I1、Vn、IX、X氨基末端谷氨酸残基的Y -羧化作用，使其具有生物活性，促进凝血因子结合于磷脂表面，加速凝血过程。研究发现CYP2C9和VKORCl是华法林代谢个体差异最主要的两个遗传学方面的影响因素，其基因多态性变量约占香豆素类药初始剂量和维持剂量的35%~50%。
[0003]细胞色素氧化酶Ρ450是一类参与内源性和外源性化合物代谢的单加氧酶，与大部分药物及毒物的代谢有关。甲CYP2C9在人肝脏微粒体中含量丰富，约占总CYP蛋白量的20%，有多种突变等位基因，构成了药物代谢个体差异的基础。影响CYP2C9酶催化功能的突变体主要有两种:CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究发现携带CYP2C9*2等位基因的个体与野生型个体华法林的临床用药剂量相比要降低14%~20%，携带CYP2C9*3等位基因的个体与野生型个体华法林的临床用药剂 量相比要降低21%~49%。突变型可以使华法林的代谢减慢，血药浓度增高，引起出血等不良反应的发生。
[0004]维生素K环氧化物还原酶l(vitamin K epoxide reductase I, VK0RC1)可激活维生素K环氧化物还原酶复合体，主导维生素K依赖性凝血因子的生成，是华法林主要作用靶点。VKORCl基因位于内含子区的1173 C>T多态性能更多显示华法林个体剂量的差异。一项研究发现携带VK0RC1(1173CC+CT)基因型的病人每天华法林的用药剂量(3.33±1.04mg/d)比携带1173TT基因型所需要的华法林的用药剂量(1.81 ±0.63 mg/d )高(P< 0.001)。
[0005]目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。
[0006]本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线(High resolution melting, HRM)分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA突光染料与PCR产物的结合情况，SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的熔解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种简单易行的华法林个体化用药相关基因多态性的检测方法。
[0008]为了达到上述目的，本发明提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因(细胞色素P450 2C9酶、维生素K环氧化物还原酶I)多态性的方法，其特征在于，具体步骤为:
第一步:采用硅胶吸附法抽 提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul。
[0009]第二步:采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18_25bp大小，PCR产物长度80-150bp。相关引物信息如下:
CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG
第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul(10umol/L)，检测样品2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97°C变性5-15分钟，92_97°C变性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92_97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
[0010]第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
[0011]本发明对细胞色素P450 2C9酶及维生素K环氧化物还原酶I的三个位点的基因型进行检测，为华法林的临床用药剂量提供参考，从而达到合理有效地个体化用药。
[0012]本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例大样本的HRM标准曲线图；
图2为本发明实施例大样本的HRM差异曲线图。
【具体实施方式】
[0014]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
[0015]1、采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ；
阴性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位点基因型为CC ;
阳性对照I DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位点基因型为CT ；
阳性对照2 DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位点基因型为TT。
[0016]2、采用在线软件Primer 3设计引物，确定最佳引物为18_24bp大小，PCR产物长度70-150bp，目标位点周边位置避免其他SNP位点(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)正向引物溶液以及浓度为10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)反向引物溶液；正向引物的序列为:5' - AATTTTGGGATGGGGAAGAG -3'，反向引物的序列为:5' - CCACCCTTGGTTTTTCTCAA_3' ο
[0017]3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生产，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?缓冲液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步骤2所得的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)基因正向引物溶液0.5ul、反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤I得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul,用灭菌重蒸懼水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应,PCR反应条件为95°C变性10分钟，95°C变性10秒，57°C退火10秒，72°C延伸10秒，40个循环；HRM反应条件:95°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。
[0018]4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图1、图2所示，在8例口腔粘膜上皮细胞提取的DNA检测中，有6例CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位点基因型为CC，I例基因型为CT，I例基因型为TT。
【权利要求】
1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测华法林个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为: 第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul; 第二步:采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18_25bp大小，PCR产物长度80-150bp，相关引物信息如下: CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG 第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0. 5ul(10umol/L)，检测样品2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97°C变性5-15分钟，92_97°C变性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92_97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65 °C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒； 第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型；定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
【文档编号】C12Q1/68GK103525911SQ201310431123
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】吴迪, 傅咏南, 张奕, 王校, 毛丹丹, 卞雪莲 申请人:上海中优医药高科技有限公司