专利名称：一株人支气管上皮细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株人支气管上皮细胞，特别涉及一种通过α粒子辐射诱发人支气 管上皮细胞恶性转化得到的人支气管上皮成瘤细胞。
背景技术：
据估计，人类所受天然辐射中50%的剂量来自于氡及子体衰变时发出的α粒子， 流行病学研究表明暴露于高水平的氡及子体可导致肺癌的发病率增高，因此，研究氡或者 说α粒子与人类肺癌的关系是辐射致癌研究领域的热点。目前研究辐射致癌的主要途径有1.流行病学调查，包括病例-对照研究、定群研 究等，即对不同剂量受照人群长时间健康的调查，确定接触放射线以及辐射剂量与癌症发 生的关系。2.动物实验研究。这是确定某种因素是否具有致癌性所必须做的实验研究，同 时可用于癌变的相关机理研究。3.体外细胞及分子生物学研究。是体外模拟细胞癌变并观 察癌变过程中细胞学行为、分子学变化和发生机理的重要的手段和技术途径，具有不可替 代的优势。体外细胞转化实验是指在体外培养的条件下，细胞自发或在处理因素的作用下发 生生长、增殖和分化等方面的失控性变化，进而表现出一系列恶性转化表型并最终表现在 动物体内的致瘤性，是一项有效的研究致癌过程的方法，能模拟体内靶细胞向肿瘤细胞演 变的多阶段过程。另外，在离体细胞培养条件下进行癌变观察，可以在没有其它因素的干扰 情况下研究癌变的过程与影响条件。因此，为了阐明辐射致癌的细胞和分子机理，采用体外 细胞恶性转化的方法建立辐射诱发的体外癌变模型具有重要意义。体外细胞的转化研究始于1963年，此后这方面的研究得到了迅速发展。多家实验 室先后建立了 α粒子体外照射诱发的SHE、C3H10T1/2、BALB/3T3、大鼠肺成纤维细胞的恶 性转化模型，上述细胞皆为啮齿类动物的成纤维细胞。八十年代后期以来，细胞转化体系 出现了从啮齿类动物细胞向人类细胞、从成纤维细胞向上皮细胞转变的趋势，特别是运用 无血清培养技术建立的数株永生化人上皮细胞株，为体外癌变研究提供了更贴近人类的模 型。与啮齿类动物细胞相比，人类细胞具有更好的基因稳定性，较少的自发转化和对致癌原 较强的抗性。人类肿瘤的80%邹游起源于上皮组织，上皮组织的代谢、修复、分化等与成纤 维细胞明显不同。因此，采用人的上皮细胞所建立的恶性转化实验模型更接近于人类肿瘤 的演进过程。BEP2D为永生化的人支气管上皮细胞株，是由Harris CC及同事转染人乳头瘤病 毒18 (Human Papillomaviruses 18，HPV18)于正常人支气管上皮细胞(NHBE)后永生化建 系，染色体核型为近二倍体，体外连续传代100次以上未发生衰老和死亡，接种裸鼠饲养12 个月以上未观察到具有成瘤性。
发明内容
本发明的目的是提供一株人支气管上皮细胞及其应用。
本发明所提供的人支气管上皮细胞，是通过α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞 BEP2D恶性转化得到的人支气管上皮成瘤细胞系，名称为人支气管上皮细胞BERP35T4-Ta。人支气管上皮细胞BERP35T4_Ta已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为=CGMCC No . 3748。本发明采用1.5Gy的238Pu α粒子照射永生化的人支气管上皮细胞BEP2D，照后细 胞体外传至35代建立细胞系BERP35，该细胞出现恶性转化表型特征，接种裸鼠体内形成高 分化鳞状上皮癌。分离培养BERP35在裸鼠体内所形成肿瘤的瘤组织细胞，体外连续传代后 建立细胞系BERP35T4。将该细胞再次接种裸鼠，成瘤后将瘤组织在裸鼠体内连续传代三次， 采用组织块培养法，再次从裸鼠肿瘤组织中分离、培养、并建立细胞系BERP35T4-Ta。人支气 管上皮细胞BERP35T4-Ta生长速度快，软琼脂克隆形成率高，对血清分化产生的抗性强，染 色体的多倍体发生率高，迁移能力强，认为该细胞具有较为典型的恶性肿瘤细胞的表型，并 且还具有较高的转移潜能。细胞系BERP35T4-Ta与其亲本细胞系BERP35、BERP35T4的对比分析，在一定 程度上可以从体外模拟的方式反映辐射致癌过程的三个阶段启动、促进及恶性进展。 BERP35T4-Ta，是研究辐射因素诱发细胞癌变过程中的分子变化事件、癌细胞转移机制、寻 找肿瘤标记物和恶性肿瘤实验治疗的理想细胞模型系，具有十分重要的价值。
图1为BERP35T4_Ta细胞角蛋白免疫组化分析(DAB显色，X 100)图 2 为 BEP2D、BERP35T4、BERP35T4_Ta 生长曲线图3为光镜观察Transwell膜上从BERP35T4_Ta中分离的转移细胞(X 100)
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、人支气管上皮细胞BERP35T4_Ta的建立1、α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮恶性转化细胞BERP35T4的致瘤性采用BALB/c无胸腺裸鼠，鼠龄为5_6周，体重ll_15g，由中国医学科学院实验动物 研究所提供(许可证编号为京动许字017号)。第25代BEP2D细胞BEP2D为永生化的人支气管上皮细胞株，是由Harris CC及 同事转染人乳头瘤病毒18 (Human Papillomaviruse 18，HPV18)于正常人支气管上皮细 胞(NHBE)后永生化建系，染色体核型为近二倍体，体外连续传代100次以上未发生衰老 和死亡，接种裸鼠饲养12个月以上未观察到具有成瘤性。Harris教授将该细胞馈赠于 本实验室，文献 Willey JC, Broussoud A，Sleemi A，et al. Immortalization of normal human bronchial epithelial cells by human papillomavirus 16 or 18. Cancer Res., 1991,51 (19) :5370-77已公开该细胞，申请人已经保存该细胞。实验室将该细胞培养在底 面积为75cm2的培养瓶中，三天换一次液(培养液为LHC-8，购自Biosource公司，货号为 P141-500)，待细胞长至80%融合(大约一周时间)传代，传代比例为1 3，该细胞称为第2代BEP2D细胞。如此传25代，即为第25代BEP2D细胞。第15代BERP35T4细胞用1. 5Gy的238Pu α粒子照射BEP2D细胞，照后细胞正常 培养、传代，将照后35代细胞接种裸鼠，将成瘤裸鼠的瘤组织无菌分离后，培养得到瘤组织 细胞BERP35T4。该细胞连续传代15次即为第15代BERP35T4。该过程中所用的培养液均 为 LHC-8。将该裸鼠分为2组，每组9只，雌雄兼半实验组接种第15代BERP35T4细胞；对 照组接种第25代BEP2D细胞。每只裸鼠接种约2-3Χ106细胞。经过三周潜伏期，接种 BERP35T4细胞的9只裸鼠中，1只出现肿瘤，随后陆续有3只出现肿瘤，而接种BEP2D细 胞的9只裸鼠无一出现肿瘤。选取一只带瘤裸鼠，拉断脊髓处死，摘除皮下移植瘤，切成 0.2X0.2X0. 2cm3的小块，置于套管针内接种于新裸鼠皮下，继续传代，共连续传代3次，接 种裸鼠14只，移植瘤均能成活并生长，鼠间肿瘤传代成瘤率达到100%，成瘤潜伏期明显缩 短，约为7-14天，传代间隔时间约为3. 5周(表1)。表1BERP35T4裸鼠原代接种及鼠间传代 2、α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮成瘤细胞BERP35T4_Ta的建立采用组织块培养法在无菌条件下，取新鲜肿瘤组织仔细剥除膜和血管成分，避开 肿瘤组织中心退变和坏死区，挑取活力较好部位，以无菌PBS缓冲液(PH 7. 2)冲洗三次，移 至小培养皿中，滴加数滴LHC-8培养基(Gibco公司)润湿组织块，用眼科剪剪成2-3mm3小 块，用眼科镊将小块移置到25cm2培养瓶瓶底上，小块间距离为0. 5cm左右，将培养瓶轻轻 翻转过来，令瓶底朝上，加入LHC-8培养基5ml，拧上瓶盖，于37°C、5% CO2培养箱中放置2 小时。缓慢翻转培养瓶，让培养基覆盖瓶底组织块，注意避免组织块被培养基冲起。往后几 周内观察细胞爬出情况，每三天换LHC-8培养基一次。待爬出细胞生长至70-80%融合后， 用0.25%胰酶消化传代培养向细胞上加入2ml 0.25%胰酶(购自Gibco公司，货号为 25200-056)，37°C消化5_7分钟，待细胞全部变圆并从瓶壁上脱落后，加入2ml终止液(含 有10% (体积百分含量)血清(购自PAA公司，货号为A15-101)的DMEM培养基(购自 Gibco公司，货号为12800-017)，用吸管将细胞悬液转移至离心管中，1500转/分钟离心5 分钟，将上清吸走，再向细胞沉淀中加入5ml PBS缓冲液(pH 7. 2)，用吸管轻轻地将细胞沉 淀吹散，再次离心，1500转/分钟离心5分钟，将上清吸走，加入2ml LHC-8培养基将细胞 沉淀吹散，均勻分到三个25cm2培养瓶中，再向每个培养瓶中加入5ml LHC-8培养基，即完 成传代，完成传代的肿瘤细胞即为BERP35T4-T。当该细胞在体外连续传代培养(培养基为 LHC-8培养基，培养条件37°C、5% CO2培养箱，每代的培养时间为72小时)20代后，将此细 胞以1 X IO3/皿的密度接种于60mm培养皿中使之为单细胞生长，当单细胞分裂成上千个细
5胞成为克隆时，挑选生长状态良好的单克隆，用去头的枪尖挑取单克隆并培养建立α粒子 辐射诱发永生化人支气管上皮成瘤细胞BERP35T4-Ta。人支气管上皮细胞BERP35T4_Ta已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为=CGMCC No . 3748。3、肿瘤细胞BERP35T4_Ta生物学特性的研究3. 1BERP35T4-Ta细胞免疫化学分析盖玻片培养细胞BERP34T4_Ta，用预冷的甲醇固定10分钟，丙酮固定5分钟后，用 0. 3%过氧化氢作用20分钟以消除内源性过氧化物酶；10%胎牛血清作用20分钟，封闭非 特异结合位点；加入兔抗人角蛋白多抗(购自北京中山生物技术公司)(1 50)，4°C孵育 过夜；PBS(pH 7.2)冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购自北京中山生物 技术公司)(1 50)，4°C孵育4小时；PBS缓冲液(pH 7. 2)冲洗3次，DAB显色液(0. 1% H2O2)显色5-10分钟，结果显示，胞浆深染(图1)，证实了肿瘤细胞BERP35T4-Ta的上皮来 源。3. 2BERP35T4-Ta细胞生长曲线的测定分别将BERP35T4、BERP35T4-Ta和BEP2D细胞以1 X IO4/孔的密度接种于12孔细 胞培养板上(培养基LHC-8 ；培养条件37°C、5% CO2)，24小时后每天消化3孔细胞并计 数，持续8天，根据测定结果绘制细胞生长曲线(图2)，并计算细胞生长指数(η)，从而进一 步计算细胞倍增时间(PDT)。计算公式如下η = (InN1-InN0)/(t-t0)PDT (h) = 0. 693/nN为细胞计数；t为测定时间计算出细胞倍增时间依次为BEP2D 66小时、BERP35T430小时、BERP35T4_Tal8小 时。可见，肿瘤细胞BERP35T4-Ta的生长速度明显增快。3. 3软琼脂克隆实验细胞在琼脂中的集落形成率(colony forming efficiency，CFE)是细胞恶性程度 高低的重要标志。用PBS缓冲液配制浓度为3. 5%的琼脂，高压灭菌10分钟。用LHC-8培 养基将3. 5%琼脂稀释5倍至0. 7%作为下层琼脂，在6孔板中以3ml/孔铺制底层琼脂，凝 固后备用。再用LHC-8培养基将0. 7%琼脂稀释一倍至0. 35%作为上层琼脂，放在40°C水 浴中备用。将BERP35T4、BERP35T4-Ta和BEP2D细胞按常规方法消化并计数后，与0. 35% 上层琼脂混勻，3ml/孔铺于0.7%的下层琼脂上，细胞的接种量为IXlO4/孔。待上层琼脂 凝固后，表面加上2ml LHC-8培养基，37°C、5% CO2培养箱中培养，每三天换液一次。表2列 出了各类细胞的CFE，可以看出，BERP35T4、BERP35T4_Ta细胞的CFE均明显高于对照细胞 BEP2D (ρ < 0. 05)，而 BERP35T4-Ta 的 CFE 也高于 BERP35T4。表明，BERP35T4_Ta 细胞的恶 性程度较BERP35T4有很大的提高。表2.BEP2D、BERP35T4及BERP35T4-Ta细胞的软琼脂克隆形成率(x 土 s) “ * ” 表示 ρ < 0. 053. 4血清抗性检测在血清的诱导分化作用下，正常的上皮细胞会发生鳞状分化，而恶性转化细胞和 肿瘤细胞则具有抵抗能力。接种1000个指数生长期的细胞于6孔板中，加入3ml含10% (体积百分含量)胎牛血清的LHC-8培养基，培养4天后，对照组BEP2D细胞出现鳞状分化， 生长迅速减慢，细胞变扁大并逐渐死亡。而BERP35T4和BERP35T4_Ta细胞培养14天后逐 渐形成集落(表3)，由表中可见，肿瘤细胞BERP35T4-Ta对血清诱导的终末分化的抵抗力明 显增强(P < 0. 05)。表3. BEP2D、BERP35T4及BERP35T4_Ta细胞对血清促分化能力的抗性( 士 s) “ * ” 表示 ρ < 0. 053. 5Transwell技术测定细胞的迁移率在Transwell装置中下层加入LHC-8培养基2. 6ml，上层加入培养基1. 2ml，置于 37°C孵箱中过夜。第二天，将BEP2D、BERP35T4和BERP35T4_Ta细胞以3 X IO4/孔的密度接 种于Transwell装置的膜上，该装置的参数如下聚碳酯膜直径为24mm，厚为10 μ m,孔径为 0. 8 μ m，孔的密度为lX105/cm3。置于37°C、5% CO2孵箱中孵育约6小时，将膜取出进行常 规Giemsa染色。染色结果显示BEP2D细胞没有发生迁移，而BERP35T4_Ta的迁移率高于 BERP35T4细胞(如图3)。
权利要求
人支气管上皮细胞，其名称为BERP35T4 Ta，保藏登记号为CGMCC №.3748。
全文摘要
本发明公开了一株人支气管上皮细胞。该人支气管上皮细胞，其名称为BERP35T4-Ta，保藏登记号为CGMCC №.3748。人支气管上皮细胞BERP35T4-Ta生长速度快，软琼脂克隆形成率高，对血清分化产生的抗性强，染色体的多倍体发生率高，迁移能力强，认为该细胞具有较为典型的恶性肿瘤细胞的表型，并且还具有较高的转移潜能。该细胞研究辐射因素诱发细胞癌变过程中的分子变化事件、癌细胞转移机制、寻找肿瘤标记物和恶性肿瘤实验治疗的理想细胞模型系，具有十分重要的价值。
文档编号C12R1/91GK101892197SQ201010233630
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者吴德昌, 周平坤, 胡迎春, 陈忠民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所