鱼腥草多糖在制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属中药领域，涉及中药鱼腥草多糖新的药物用途。具体涉及鱼腥草多糖在 制备防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 研究报道，病毒性肺炎（viralpneumonia)是由多种病毒感染而引起的肺部炎症， 通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。引起肺炎的病毒以流感病毒为常见，还包括副 流感病毒，巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒和某些肠道病毒等也可导致病毒性肺炎。 甲型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。流感病毒侵入细支气管上皮引起 细支气管炎，感染波及肺间质与肺泡而致肺炎。流感病毒一方面在呼吸道上皮细胞和血管 内皮细胞内复制，损伤肺组织，破坏气体交换屏障；另一方面，通过巨噬细胞、分叶核中性粒 细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等释放大量细胞因子，宿主免疫机制被过度激活并失控，导致 急性肺损伤（孙婉容，吴琦，邵世峰.国际呼吸杂志，2011，14:1094-1096)。在机体抗病毒 感染免疫的过程中，早期起作用的是以巨噬细胞、干扰素和NK细胞为主的非特异性免疫， 后期则是特异性的细胞免疫和体液免疫起作用。在流感病毒感染的过程中，单核/巨噬细 胞活化产生多种细胞因子，以网络的形式在调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要作 用（侯佩莉，张茂林，李影，关振宏.动物医学进展，2010,10:108-112)。
[0003] 病毒性肺炎主要病理改变是肺泡水平的气体交换障碍，病毒感染后所致的急性肺 损伤（acutelunginjury,ALI)可引发患者出现呼吸窘迫和严重的低氧血症。研究表明单 核细胞浸润、肺泡水肿是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础，病毒感染诱发 的肺损伤，临床表现为呼吸困难，严重的可以导致急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。本发明 证实了鱼腥草多糖对甲型流感病毒诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。
[0004] 鱼腥草是我国的常用中药，临床应用十分广泛。鱼腥草（HerbaHouttuyniae)为 三白科植物蕺茶属蕺菜（Houttuyniacordata)的全草。性味辛、寒，具有清热解毒、消肿 排脓、利尿通淋之功效，主要应用于肿痈化脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒等（中国药典 一部。北京：中国医药科技出版社，2010)。文献报道，鱼腥草全株均有一定的抑菌作用， 包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌（王健，史玉，张永泽等.河北工程大学学报（自 然科学版），2010,2 :104-106);鱼腥草挥发油对流感病毒有抑制作用（杨慧，李剑琦，杨 斌等.江西医药，2006,12 :960-961);鱼腥草注射液（全草水提物）肌注能明显降低甲型 流感病毒H1N1感染小鼠死亡率，降低肺指数和抑制肺内增殖作用（刘方舟，时瀚，时宇静 等.药学学报，2010, 3 :399-402);鱼腥草全草也可以抗单纯疱疹病毒（HSV)、SARS病毒 (ChenX,WangZ,YangZetal.AntiviralRes. 2011, 2:341-345 ；LauKM,LeeKM,KoonCMetal. JEthnopharmacol. 2008,118(1) :79-85.)。以上研究均未涉及鱼腥草多糖对病毒诱导急性 肺损伤的防治作用。
[0005] 综观国内外的研究，均未见报道鱼腥草多糖治疗病毒诱导急性肺损伤的药效及其 药物研究。
[0006] 本申请的发明人拟提供中药鱼腥草多糖新的药物用途，尤其是鱼腥草多糖在制备 防治甲型流感与病毒性肺炎的药物中的用途。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供鱼腥草总多糖在制备抗流感和病毒性肺炎药物中新的药物 用途。
[0008] 本发明从中药鱼腥草中分离提取得到总多糖提取物。所述总多糖提取物经整体动 物模型试验证实，其针对H1N1、H3N2两种甲型流感病毒毒株，具有显著治疗流感病毒诱导 的急性肺损伤作用。
[0009] 本发明的鱼腥草总多糖通过下述方法制备：
[0010] 取鱼腥草（HouttuyniacordataThunb.)药材，粉碎，以95%乙醇冷浸提取3次， 药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，过滤，合并提取液，浓缩，离心，上清液 以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量 80%，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖，产物收率达3%以上；采用硫酸-苯酚法测得鱼腥草 总多糖的糖含量超过70% ;采用间羟联苯法测得鱼腥草总多糖的糖醛酸含量超过25% ;采 用考马斯亮蓝法测得鱼腥草总多糖的蛋白质含量不超过10% ;
[0011] 本发明的鱼腥草总多糖进行了如下整体动物模型试验，尤其是针对H1N1、H3N2两 种甲型流感病毒毒株的试验：
[0012] 1、鱼腥草多糖用于治疗H3N2甲型流感病毒诱导急性肺损伤试验：
[0013] 选用KM小鼠，以H3N2甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导的急性肺损伤模 型。鱼腥草多糖灌胃给药，96h后观察动物肺炎性病变程度及炎性细胞因子指标。结果证实 口服鱼腥草总多糖后，对H3N2流感病毒诱导急性小鼠肺损伤有显著的保护作用。
[0014] 2、鱼腥草多糖对重症H1N1甲型流感病毒感染鼠的生存保护试验：
[0015] 选用BALB/C小鼠，以H1N1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导重症肺损伤 模型，给药7天，停药观察7天，观察本发明药物对重症流感感染鼠的14天观察期的生命保 护作用。结果证实口服鱼腥草总多糖后，能提高重症流感病毒感染鼠的生命率，具有生命保 护作用。
[0016] 3、鱼腥草多糖用于治疗H1N1甲型流感病毒诱导急性肺损伤试验：
[0017] 选用BALB/C小鼠，以H1N1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导的急性肺损 伤模型。鱼腥草多糖灌胃给药，96h后观察动物肺炎性损伤程度及干扰素、炎性细胞因子、趋 化因子，NFkB蛋白表达等指标。结果证实口服鱼腥草总多糖后，对H1N1流感病毒诱导急 性小鼠肺损伤有显著的保护作用。
[0018] 4、鱼腥草多糖对病毒诱导鼠肺急性损伤的抗炎相关研究指标检测方法
[0019]1)肺指数
[0020] 病毒感染第四天，动物称重，充分取血，解剖完整取下肺脏，将整个肺页置于滤 纸，待滤纸吸干表面水分后称重，以此为肺湿重；计算肺指数，肺指数=肺湿重（mg) /体重 (g)。实验结果显示，与模型组相比，鱼腥草多糖40mg/kg可显著抑制小鼠肺指数的增高 (Ρ〈0· 01) 〇
[0021] 2)肺总蛋白测定
[0022] 整个全肺留取用于病理切片的肺叶后，其余部分的肺叶盐水漂洗，用适量冰浴的 PBS匀浆，肺匀浆液分装，100ul肺匀浆液使用RIPA裂解法提取肺总蛋白，裂解液低温高 速离心，收获上清分装，应用BCA法检测蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白溶液，制作 标准曲线。BCA工作液加入待测样品后，于自动酶标仪（Epoch，Bi〇-Tek)A562nm处读取吸 收度（A)值。结果显示，与模型组相比，鱼腥草多糖可显著抑制小鼠肺总蛋白水平的升高 (P〈0. 01)，抑制病毒诱导后肺部对炎性蛋白的募集。
[0023] 3)肺匀浆血凝效价测定
[0024] 根据流感病毒上的血凝素HA能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，来评价病毒毒 力的强弱。取肺匀浆液，高速离心获得上清液，将等倍系列稀释的匀浆液与U型96孔板内 1 %鸡红血球混合，静置观察，记录发生鸡红细胞发生凝集的稀释度即该肺组织匀浆的血凝 效价。实验结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg鱼腥草总多糖可显著抑制病毒感 染鼠肺中血凝素的效价升高（P〈〇. 05,P〈0. 01)，即能有效抑制病毒在鼠肺中的复制。
[0025] 4)小鼠血清TNF-a、RANTETS测定
[0026]小鼠全血离心获得血清，分装，冻存。应用ELISA法，将上清按TNF-a、RANTETS试 剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg鱼腥草总多糖可显著抑制 小鼠血清中TNF-α、RANTETS炎性细胞因子的分泌（P〈0. 05)。
[0027] 5)肺匀浆IFN-a、IL-l、TNF-a、RANTETS、MCP-1、MIP_1a、IL-6、IL-10 测定
[0028] 小鼠肺匀浆液，高速离心收获上清，分装，冻存。应用ELISA法，将匀浆上清按 IFN-a、IL-l、TNF_a、RANTETS、MCP-l、MIP_la、IL-6、IL_10试剂盒说明书测定。结果显示， 与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg柴胡总多糖可显著降低小鼠肺中干扰素/促炎因子/趋 化因子IFN-a、IL-l、TNF_a、RANTETS、MCP-1、MIP_1a、IL-6、IL_10 水平的升高（Ρ〈0· 05， Ρ〈〇. 01);与模型组相比，40mg/kg鱼腥草总多糖可显著增高小鼠肺中抑炎因子IL-10水平 的升高（P〈〇. 05)。
[0029] 6)肺组织NFkB蛋白表达的检测
[0030] 将切好的4um厚的肺组织白片放在玻片架上置于烘箱烘烤30分钟，脱蜡入水，将 玻片架用〇. 01M的PBS