专利名称：一种检测癌或恶性肿瘤组织中jwa表达的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物和医学检测领域，具体是一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，已成为死因分类构成中的首位。随着现代生物医学技术的发展，人们对恶性肿瘤发生发展规律的认识日益深入，一系列与恶性肿瘤相关的基因被发现，随着研究的深入这些基因的功能逐渐得到阐明，因此，以基因诊断和基因治疗为核心的新的恶性肿瘤治疗策略也应运而生。JffA,即ARL6IP5基因，是发明人周建伟1998年率先从人气管支气管上皮细胞构建的cDNA文库中克隆的与受维甲酸诱导调节细胞分化新基因(LOCUS :NM_006407 ； ACCESSION :NM_006407)。JWA 在 GenBank 中还有如下同名基因addicsin ；DERPll ； GTRAP3-18 ；hp22 ；HSPCI27 ； jmx ；PRAF3。JWA 基因全长 cDNA 序列为 2107bp，其开放阅读框序列为564bp，共编码188个氨基酸。近十多年来，发明人围绕JWA基因及其编码蛋白的结构功能开展研究工作，取得了一系列原创性研究成果。发明人发现JWA基因是新的抑癌基因，其表达产物JWA蛋白具有抑制肿瘤细胞粘附、浸润、转移和抑制肿瘤血管生长等功能。JWA在大多数人正常组织中均有较高水平的表达，然而在大多数恶性肿瘤，如胃癌、肝癌、食道癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等组织细胞中表达较低，而且表达水平高低与肿瘤恶性表型呈负相关，即JWA表达水平越低，肿瘤细胞的恶性程度越高。研究发现(1)当增加人黑色素瘤A375细胞和小鼠黑色素瘤B16细胞中JWA 表达后，在细胞水平和动物整体水平分别观察到这两种细胞的侵袭和转移能力显著减弱； (2)采用组织芯片和免疫组化方法检测分析了三个独立的胃癌手术患者队列及其病理组织 (共1257例)以及314例肝癌患者队列及其病理组织中JWA的表达情况，以及与肿瘤分期分型、预后、化疗效果之间的关系。结果显示胃癌和肝癌组织JWA蛋白表达水平均显著低于癌旁组织，癌组织中JWA表达水平与患者临床病理特征和预后等呈显著负相关。肝癌和胃癌组织中JWA低表达者，术后生存期较JWA高表达者明显缩短；胃癌组织中JWA低表达者若接受5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利钼联合化疗方案，其预后明显好于仅接受手术或手术并使用其它化疗方案者；如果胃癌组织中JWA高表达，则单纯手术病人与手术后再接受化疗者相比，预后无统计学差异。换言之，胃癌组织中如果JWA高表达，患者仅需手术治疗而不一定需要化疗，或化疗对延长患者生命并无意义。综上所述，JffA在多种癌组织的表达低于癌旁正常组织，JffA表达降低在多种肿瘤的发生和发展过程中起重要作用。在临床实践中，目前对恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗、中医药治疗和生物治疗等，通常使用综合治疗方案。患同一种肿瘤，如临床病理特征相似，则常常采用同样的或相似治疗方案。事实上，即使临床病理特征相似的不同患者对同样的治疗方案的反应和效果可能完全不同，其中有些方案也许根本不适合用于某个或某些患者，但迄今为止尚无特别可靠的方法判定一个恶性肿瘤患者是否需要接受某种治疗即个体化治疗。本发明针对上述问题，提供一种试剂盒能简单方便检测恶性肿瘤组织中JWA表达水平，从而帮助判断恶性肿瘤患者预后以及手术后是否需要接受某种特殊治疗即个体化治疗。
发明内容
恶性肿瘤组织中JWA表达水平作为判断患者预后和制定个体化治疗方案的分子标志物。本发明目的在于提供快速检测恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，为临床检测提供便利，指导临床上对肝癌、胃癌等肿瘤患者的诊断和治疗。一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于优化了试剂盒中各种试剂的配置、浓度和用量，包括封闭液、一抗、二抗-多聚体溶液、显色剂。其中所述的一抗为小鼠抗人JWA单克隆抗体(1 μ g/μ 1;1 750稀释)或兔抗人 JWA多克隆抗体(1 800) ；二抗-多聚体溶液为鼠兔通用型二抗-辣根过氧化物酶多聚体溶液；封闭液为羊血清或5%胎牛血清白蛋白溶液或任何与二抗同一种族来源的正常血清；显色剂为DAB (临时配制)。本试剂盒中所述的小鼠抗人JWA单克隆或兔抗人多克隆抗体是本发明人的专利产品(申请(专利)号:98111422. 9公开号:CN1208733，
公开日期=1999. 02. 24) 本领域技术员已知，以上组分仅是示意性的，所述封闭液可以是羊血清或BSA ；二抗是鼠兔通用型二抗-辣根过氧化物酶多聚体溶液；显色试剂可以根据二抗所连接的酶选择 DAB 或 AEC。本试剂盒可以用来检测各种肿瘤组织中JWA蛋白的表达水平和在细胞内分布。通常情况下，JWA主要分布在细胞浆中，少量可分布在细胞核。有益效果1、本发明提供一种试剂盒，用于检测肿瘤组织中JWA蛋白的表达水平，结果可以作为判断肿瘤患者预后和制定个体化治疗方案的重要依据，即检测肿瘤组织中JWA的表达水平，根据JWA表达水平协助确定治疗方案。显而易见，本发明内容具有十分重要的原创性意义和应用价值。癌组织JWA表达水平可以作为衡量肿瘤恶性程度、制定化疗方案、判断预后的重要分子标志物。发明人对314例肝细胞肝癌患者术后生存随访研究发现，肝癌组织中JWA蛋白高表达者中位生存时间是Iio个月，而JWA低表达者仅为51个月，差别具有统计学意义(P < 0. 001)。对三个独立的胃癌患者队列(累计1257例)手术后生存随访以及胃癌组织和癌旁组织中JWA及相关蛋白表达的研究显示，胃癌组织中JWA低表达患者术后中位生存时间为22个月，而胃癌组织中JWA高表达患者术后中位生存时间为88个月，换言之，胃癌组织中JWA高表达者术后中位生存时间比JWA低表达者增加66个月，差别具有非常显著的统计学意义(P < 0. 001)。进一步研究发现，胃癌组织中JWA低表达者，如手术后结合以5-氟尿嘧啶和奥沙利钼为主的辅助化疗，则术后生存时间可明显延长(P = 0. 04)，然而，胃癌组织中JWA高表达者，在手术后使用辅助化疗则对患者术后生存无明显影响。因此，临床上对于每一例胃癌手术患者，可以用本试剂盒检测其胃癌组织中JWA表达水平预测其预后，并直接指导其术后辅助化疗方案的制定。
2，由于多种恶性肿瘤有相似或相同的发生发展机制，研究表明JWA表达水平高低与多种恶性肿瘤细胞的恶性表型呈负相关，因此，检测肿瘤组织中JWA表达水平不仅可用于指导预测胃癌患者预后和术后辅助治疗方案，也适用于其他肿瘤，如肝癌、食道癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等。
图1为胃癌和癌旁组织中JWA表达的免疫组化染色结果；其中A 组织芯片中胃癌和癌旁组织免疫组化染色，N-癌旁组织，C-胃癌组织；上部分X 40，下部分X 200。B 105例胃癌和癌旁组织配对标本的JWA表达水平N-C差值。图2为909例不同JWA表达水平胃癌患者单纯手术后生存情况；其中JWAhigh-指免疫组化评分(IRS)8_12分者，JffA low-指免疫组化评分 (IRS) 0-6 分者。图3为胃癌组织中JWA低表达者单纯接受手术与手术+辅助化疗者生存情况比较，其中S-单纯接受手术者，S+FL0-手术后使用辅助化疗者。图4为314例肝癌组织中JWA表达高低与复发㈧和术后生存时间⑶的关系结果；图5为食道癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异；图6为膀胱癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异；图7、图8为肾癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异；图9、图10为前列腺癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异；图11为乳腺癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异；图12、图13为子宫癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整，只要是用针对JWA及其同名基因编码蛋白抗体作为工具检测癌组织中该蛋白表达水平的方法，以及依据试剂盒检测癌组织中JWA表达水平制定治疗方案均属于本发明的范围。实施例1 JWA在胃癌组织中表达水平的免疫组化检测(以胃癌组织石蜡切片为例)一、癌组织切片的染色前准备各种商业化或委托生物技术公司制备或实验室自己制备的含有胃癌肿瘤组织的石蜡切片(厚度4 μ m)，以二甲苯脱蜡3次，每次5min，依次以100%、 100 %、95 %、90 %、80 %、70 %的乙醇水溶液漂洗，每次3min，然后入蒸馏水漂洗5min。再用 PBS (磷酸盐缓冲液，pH = 7. 4)漂洗3次，每次3min。抗原修复方法(1)置切片于IOmM柠檬酸盐溶液(pH6. 0)中，在微波炉中加热，使温度保持在92 100°C，并持续2 X 5min ；在第一次5min后，可视柠檬酸盐溶液是否有蒸发减少，如有蒸发减少，可适当添加柠檬酸盐溶液再进行第二次的5min。
抗原修复方法(2)置切片于含IOmM柠檬酸盐溶液(pH6. 0)的不锈钢杯中，将此杯浸于高压锅内蒸馏水中，加热高压锅煮沸放气3分钟，然后自然冷却，也可用自来水冲洗加快冷却。用PBS漂洗3次，每次;3min。3%的过氧化氢溶液，10-15min。用PBS漂洗3次， 每次;3min。3%的过氧化氢溶液配制取浓过氧化氢溶液(30% )，加入蒸馏水稀释为3%溶液。二、癌组织切片的免疫组化染色用羊血清或5%胎牛血清白蛋白溶液或任何与二抗同一种族来源的正常血清(试剂A)封闭IOmin后，甩干不洗，以小鼠抗人JWA单克隆抗体(lyg/yl;l 750稀释)或兔抗人JWA多克隆抗体(1 800)作为一抗(试剂B)，每张切片滴加50μ1，4 孵育过夜或室温孵育lh。吸去孵育的一抗溶液，用PBS漂洗3次，每次;3min。用鼠兔通用型二抗-辣根过氧化物酶多聚体溶液(试剂C)，每张切片滴加50 μ 1，室温孵育30min。用PBS漂洗3 次，每次:3min。每张切片滴加100 μ 1新鲜配制的DAB溶液(试剂D，显微镜下观察至显色结果满意(大约5至IOmin)则终止显色。IOml的DAB ( 二氨基联苯胺)溶液配制方法如下(I)DAB :6mg(2) 0. 05M, ρΗ7· 6 的 TBS IOml(3)3% H2O2 0. Iml将配制好的DAB溶液过滤掉沉淀物即可使用。流水冲洗，苏木素复染，0. 盐酸酒精分化，弱碱溶液返蓝。梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%、100%)脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在上述实验同时，以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性表达组织同时进行免疫组化标记作为阳性对照。显微镜下观察免疫组化染色切片中JWA在癌组织中的表达水平，JWA阳性表达定位在细胞浆，呈棕黄色或棕褐色。推荐JWA免疫组化染色结果判断标准至少由二位病理医生，依照半定量的免疫反应评分方法(immunoreactivity scoring, IRS)分别双盲观察判断完成。此法评分结果由染色强度与阳性着色细胞比例相乘而得。具体评判方法染色强度计分0-3分，0为无阳性着色，1为淡黄色，2为棕黄色，3为棕褐色；阳性着色细胞比例计分1-4分，1分为阳性染色细胞占全部观察细胞的0-25%，2分为-50%，3分为51% -75%，4分为76% -100%。 因此，IRS评分范围为0-12分。建议将0-6分定义为低表达，将8-12分定义为高表达。发明人及其课题组用以上试剂盒和所述方法对三个独立样本(共1257例胃癌组织和110例胃癌旁组织)的胃癌手术切除组织标本和314例肝癌手术切除组织标本制成的组织芯片进行免疫组化染色，并与各样本的临床病例数据库以及生存随访数据库进行多种相关性统计学分析，证实JWA在胃癌和肝癌样本中表达水平都是癌旁组织高于癌组织，癌组织中JWA表达水平与患者肿瘤恶性程度分级、分型等呈负相关，与术后生存时间长短成负相关。胃癌和癌旁组织中JWA表达的免疫组化染色结果见图1 ；909例不同JWA表达水平胃癌患者单纯手术后生存情况见图2 ；胃癌组织中JWA低表达者单纯接受手术与手术+辅助化疗者生存情况比较结果见图3 ;314例肝癌组织中JWA表达高低与复发(A)和术后生存时间(B)的关系结果见图4。发明人及其课题组又用商品化人消化系统、泌尿系统和生殖系统恶性肿瘤组织芯片验证了 JWA在癌旁组织和癌组织中的表达水平差异，结果发现这三个系统的恶性肿瘤中，绝大多数癌旁组织中JWA表达水平均高于癌组织中JWA的表达水平。其中代表性的结果如食道癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图幻；膀胱癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图6)；肾癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图7、图8)；前列腺癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图9、图10)；乳腺癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图11)； 子宫癌组织和癌旁正常组织JWA表达差异(图12、图13)。
权利要求
1.一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一抗、 通用型二抗-多聚体溶液、显色剂、封闭液。
2.根据权利要求1所述的一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于所述的一抗为小鼠抗人JWA单克隆抗体或兔抗人JWA多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于通用型二抗-多聚体溶液为鼠兔通用型二抗-辣根过氧化物酶多聚体溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于封闭液为羊血清或5%胎牛血清白蛋白溶液或任何与二抗同一种族来源的正常血清。
5.根据权利要求1所述的一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于显色剂为DAB或AEC。
全文摘要
本发明涉及生物和医学检测领域，具体是一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒。一种检测癌或恶性肿瘤组织中JWA表达的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一抗、通用型二抗-多聚体溶液、显色剂、封闭液。本发明提供一种试剂盒，用于检测肿瘤组织中JWA蛋白的表达水平，结果可以作为判断肿瘤患者预后和制定个体化治疗方案的重要依据，即检测肿瘤组织中JWA的表达水平，根据JWA表达水平协助确定治疗方案。显而易见，本发明内容具有十分重要的原创性意义和应用价值。癌组织JWA表达水平可以作为衡量肿瘤恶性程度、制定化疗方案、判断预后的重要分子标志物。
文档编号G01N33/577GK102297971SQ201110160118
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者周建伟, 张建兵, 强福林, 李爱萍, 谈永飞, 陈颜夙 申请人:南京医科大学