专利名称:治疗癌和非恶性肿瘤的方法和组合物的制作方法
本发明是有关癌和非恶性肿瘤的免疫治疗。更具体地说，是有关通过增加细胞的细胞毒活性来增强身体免疫反应的方法，这些细胞是调节依赖於抗体的细胞毒性。根据本发明的方法所获得的，增加了细胞毒性活性的细胞在治疗各种类型的癌和非恶性肿瘤的方法和组合物中是有用的。
由於病毒的感染，化学致癌物，辐射，身体的因素或自发肿瘤的生长会诱导体内正常细胞转化为癌和非恶性瘤。其转化的结果使正常细胞表面抗原的表达发生了变化。在很多类型的肿瘤上可以证明新的抗原-肿瘤的特异抗原或早熟细胞类型的抗原特性-或抗原表达型式的改变。这些抗原的变化是身体免疫反应的目标。
在有些情况下，细胞转化的范围或速率会超过身体免疫反应的潜在能力。换句话说，免疫反应会自身失效或不足。所以，已采用了一些辅助的方法来治疗转化细胞。这些方法包括例如化学治疗及放射治疗这样的非外科治疗和外科治疗。通常，它们的共同特点是会产生一系列不良副作用。有免疫抑制剂效应的非外科治疗会增加患者继发性感染的易感性。切除转化细胞的外科治疗有伴随侵袭过程的危险性，而且也不可能有效地排除或除去整个转化细胞的群体。
一个可选择的治疗癌和非恶性肿瘤的方法包括对转化细胞表面的肿瘤特异抗原使用单克隆抗体。有代表性的包括鼠的单克隆抗体的这些疗法的效果经常受到种种因素的限制。例如用鼠单克隆抗体治疗的患者可能会产生抗鼠免疫球蛋白的反应，这种反应会严重地降低以后施用鼠单克隆抗体的效力(G.E.Goodman等，“用鼠单克隆抗体对黑素瘤增生患者的小型试验”，Journal of Clinical Oncology，3，pp.340-51(1985))。其他报道过的单克隆抗体疗法的副作用包括过敏反应，发烧和寒战。
单克隆抗体对治疗那些暴露在特异抗体下能调整的肿瘤特异表面抗原也是无效的，这样一些抗原包括，例如一般的急性淋巴细胞血癌抗原(“CALLA”)，这种抗原出现在大多数患有急性淋巴细胞血癌病人的转化细胞表面(J.Ritz等，“用单克隆抗体进行的急性淋巴细胞血癌的血清疗法”，Blood，58，pp.141-52(1981))。当在肿瘤细胞表面上的CALLA抗原暴露在它的特异抗体之下时，抗原就迁移，而且细胞使抗原和抗体内化，这样，免疫反应效应细胞，例如白细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，杀伤(“K”)细胞或自然杀伤(“NK”)细胞，对肿瘤靶细胞的辨认就受到了阻碍。
鉴于上述辅助疗法所存在的缺点，所以各种疗法都指向增加身体对转化细胞的自然免疫反应。众所周知，在抗体存在的情况下，某些效应细胞，例如有抗体Fc区域的表面结合受体的淋巴细胞，能调节依赖抗体的细胞的细胞毒性(“ADCC”)对靶细胞的反应。依靠ADCC，这些效应细胞产生了对靶细胞的细胞溶解活性。
ADCC反应的两种类型已在体外得到了证明。在经典的ADCC反应中，效应细胞连接到被抗体覆盖的靶细胞上，然后使靶细胞溶解(A.H.Greenberg等，“调节对覆盖有抗体的靶细胞的细胞毒性的效应细胞的特征.I”，Immunology，21，p.719(1975))。效应细胞和靶细胞的这种连接是由於覆盖靶细胞抗体的Fc区与效应细胞的Fc受体相互反应产生的。这种类型的ADCC反应有一个缺点，它会受到常与各种疾病有关的循环的抗原-抗体复合物的阻碍，它们与效应细胞的Fc受体的靶细胞结合抗体进行竞争(I.C.M.Maclennan，“对有细胞毒素的淋巴细胞上的免疫球蛋白受体的竞争”，Clin.Exp.Immunol.，10，p.275(1972))。由於经典的ADCC存在上述的缺点，於是就提出了ADCC反应的第二种类型-抗体引导的ADCC。在支配抗体的ADCC中，先把靶特异抗体连接到效应细胞上，然后通过该抗体，把所得的复合物引导到靶细胞表面上的特异抗原上。其优点是，支配抗原的ADCC不会受到在宿主系统内循环的抗原-抗体复合物的影响。
一般，通过Fc区/Fc受体的连接，发生在抗体与效应细胞间的相互作用是弱的。在某些情况下，抗体与效应细胞的结合並不能保持一段足以使靶细胞溶解的时间。鉴于这种潜在的问题，把抗体连接到用聚乙二醇和邻苯二甲酸盐油混合物进行过预处理过的效应细胞上(J.F.Jones和D.M.Segal，“用覆盖抗体的效应细胞调节依赖抗体的细胞的细胞溶解作用(ADCC)增强抗体结合和细胞溶解的新方法”，J.Immunol.，125，pp.926-33(1980))。然而，由於抗体-效应细胞复合物上的任何聚乙二醇和邻苯二甲酸盐油的残存物会对人体产生的毒性作用，可能会减少此方法用於体内治疗的适用性。
还提出了一个用带有细胞毒素的药物进行辅助化学治疗来增强支配抗体ADCC的方法(I.R.Mackay等，“包括左旋溶肉瘤素的辅助的细胞毒素化疗在乳腺癌中对自然杀伤细胞和依赖抗体细胞的细胞毒性的作用”，Cancer Immunol.Immunother.，16，pp.98-100(1983))。然而，这种方法会由於使用细胞毒素药物而带来人们不希望产生的副作用的危险。
由此看来，通过辅助或增强身体免疫反应来治疗癌和非恶性肿瘤的一般方法都会带来各种缺点。所以，就需要一种能避免这些缺点，而能有效地治疗癌和非恶性肿瘤的有效的方法和组合物。
本发明通过提供一种增强身体对癌和肿瘤免疫反应的方法，从而解决了上面提到的问题，此方法是通过活化调节依赖抗体细胞的细胞毒性(“ADCC”)的效应细胞，使它们的细胞毒素活性增加到超过一般水平。然后把由本方法所得到的，以增加细胞毒活性为特征的效应细胞，有效地用於本发明的用免疫治疗法治疗癌和非恶性肿瘤的方法和组合物中。此外，本发明的一个实施例提供了一个更有效地把活化的效应细胞引导到靶细胞的方法，它是通过把靶特异抗体连接到活化的效应细胞表面的Fc受体上实现的，还提供了一个以这种特异抗体效应细胞的复合物为特征的组合物。
本发明的方法和组合物可用来退化，减缓或阻止转化细胞的生长，以防止在体内各处的转移生长或增加宿主对致病因子再挑战的免疫力。有利的是，本发明的方法和组合物，通过ADCC，增强了身体的细胞调节免疫力的自然免疫反应，於是就不会引起癌和肿瘤一般治疗法中所特有的副作用。
在第一个实施例中，本发明提供了一个从密度梯度离心技术或分离白细胞的其他方法获得的大量的淋巴细胞中，预选Fc受体阳性细胞的方法。
本发明还涉及一种处理调节依赖抗体细胞的细胞毒性的效应细胞，以使它们的细胞毒活性增加到超过一般水平的方法。本方法的一个实施例的步骤包括由供体中回收效应细胞和在体外活化细胞，以增加它们的依赖抗体细胞的细胞毒的活性。本发明还涉及用该方法活化的细胞。
本发明还涉及到一种治疗癌和非恶性肿瘤的方法和组合物。概括地说，该方法包括把用本发明方法活化的效应细胞再导入到供体中或把活化的细胞转移到受体中这样的步骤。根据本发明的另外一个实施例，把对要被治疗的癌和非恶性肿瘤有特异性的抗体在它们被再导入到供体或转移到受体之前，先连接到活化的效应细胞上。
根据本发明方法对效应细胞的处理，通过增加了它们依赖抗体的细胞毒素对靶细胞活性，而使它们得到活化。依赖抗体的细胞毒素活性的增加范围至少为处于正常状态的未处理效应细胞的1.25-25倍，在有些情况下，至少为1.25-125倍。
在不受理论约束的情况下，我们认为依赖抗体的细胞毒素活性的增加是由於在用发明方法活化的效应细胞表面上增加了Fc受体表达的缘故。我们尤其认为，活化的细胞能更好地调节依赖抗体细胞的细胞毒性是由於，在用本发明方法处理后，效应细胞上存在有更多的Fc受体，所以，有Fc区的肿瘤特异抗体(覆盖了靶细胞或外源物)更可能以一种有效的方式连接到效应细胞上，也就是，通过抗体的Fc区连接到效应细胞的Fc受体上。这样，就维持了这种连接，确保了得到ADCC。
此外，由於在活化的效应细胞上有更多的Fc受体，所以，就会有大量的靶特异抗体连接到每个效应细胞上。每个效应细胞上抗体密度的增加不仅能使大量的抗体存在於或到达每个效应细胞的靶转移细胞上，而且增加了效应细胞识别或找到靶细胞的能力以便调节ADCC。对处理过的效应细胞这些作用总结果是增强了身体对靶细胞的免疫反应。这对于治疗导致患者免疫系统内降低或缺少效应细胞的疾病是特别有利的。
用本发明的方法和组合物所治疗的疾病是那些以抗体能特异地被引入的靶细胞不良增生为特征的疾病。这些疾病包括恶性和非恶性的固体或液体肿瘤，癌，骨髓瘤，肉瘤，白血病和淋巴瘤。此外，预防性地使用由本发明方法活化的效应细胞还可以防止癌和非恶性肿瘤。
还应理解，用本发明活化的效应细胞，特别是与一个合适的抗体一起使用，可用来增加对任何一种靶细胞的ADCC活性。在对人靶细胞的ADCC和抗肿瘤细胞增殖试验中，用本发明方法活化的效应细胞证明了细胞毒素活性的增，这些人靶细胞，例如是从K562肿瘤细胞系，人骨髓性白血病(H.Pross和M.Baines，“人体自生的抗肿瘤靶细胞的淋巴细胞调节的细胞毒性，I.恶性病的作用”，Intl.J.Cancer，18，pp.593-604(1976));Nalm-6白血病细胞系(gift of Dr.Tucker LeBein，University of Minnesota);急性淋巴细胞白血病细胞新鲜样品和慢性骨髓性白血病细胞新鲜制品得到的靶细胞。活化的效应细胞也证明了细胞毒素对鼠靶细胞活性的增加，这些鼠靶细胞，例如Zbtu鼠T-细胞淋巴瘤细胞;EL-4鼠细胞(ATCC Tib-39)p815鼠细胞(ATCC Tib-64)和Yac鼠细胞(R.Kiessling等，“体外细胞毒素活性的遗传变性和未免疫的半同源的小鼠对A鼠淋巴瘤系在体内排斥的潜力”，Intl.J.Cancer，15，pp.933-40(1975))。
本发明的方法和组合物还可以用来治疗任何一种动物，包括人。效应细胞的来源最好是要治疗的病人。但是调节ADCC的效应细胞既不必来自特定的病人，也不必来自特定的种。因此，来自一个病人或一个种並用本发明方法活化了的效应细胞，就可用於另一个病人或另一个种上，产生出抗靶细胞的细胞毒素活性。对于效应细胞水平降低的受者，可能必须使用由另一个病人或种提供的，活化了的效应细胞。虽然，这种用供者效应细胞的治疗最终会使细胞遭到受者的排斥，但是一般在这些细胞遭到排斥以前，活化的效应细胞总会产生一定程度的依赖抗体细胞的细胞毒性活性，而这些活性足以对要治疗的疾病的发展过程发生影响。
效应细胞可以用本发明活化的效应细胞包括任何一类具有抗体Fc区的表面受体並能调节ADCC的细胞毒素细胞，这些效应细胞包括，例如像淋巴细胞，单核白细胞，K细胞和NK细胞这样的白细胞。
上述的细胞可以用很多种分法分离，包括直接从同源的供体和上述细胞1到7天的培养液中分离，例如可用下述的方法分离效应细胞从小鼠体内取出脾，剁碎，用灭菌的平衡盐溶液清洗以及用淋巴细胞分离解质(Lymphopaque，Accurate Chemical and Scientific Corporation，Westbury，New york)，通过离心，分离出白细胞，最终浓度为5×107细胞/毫升。
人效应细胞可以，例如用A.Boeyum描述的改良法(见“淋巴细胞.分离，分级和鉴定”，J.B.Natvig等(出版)，Scand.J.Immunol.，5Suppl.5，pp.9-15(1976))从外周血中被分离。在有些情况下，白细胞群众可通过梯度离心分离法(Ficoll-Hypaque density gradient，Pharmacia Fine Chemicals，Pis-Cataway，New Jersey)被进一步地分类以分离出单核白细胞。然后，可把获得的单核白细胞或就作为效应细胞源，或用标准的技术作进一步的处理，分出那些具有更多活性的细胞，或仅有Fc受体的细胞。这些技术包括利用单克隆抗体的分离或富集技术，用FACS Ⅳ(萤光活化细胞分类器，Becton Dickinson，FACS Division，Sunnyvale，California)分类或粘连技术。
例如各种各样的抗体都可用来获得要用本发明方法处理的效应细胞。用来识别，标记，鉴定，分类，分离，富集和/或减除在本发明方法中被处理的效应细胞的抗体包括下列的例(1)HNK-1，Leu-7(Becton Dickinson，Mountain View，California-Catalog No.73-90)(2)Leu-11-a(Becton Dickinson-Catalog No.75-23)(3)Leu-11-b(Becton Dickinson-Catalog No.75-30)(4)Leu-11-C(Becton Dickinson-Catalog No.76-17)(5)Anti-IL2-Receptor(Becton Dickinson-Catalog No.76-40)(6)Anti-Human Fc Receptor(New England Nuclear，Boston，Massachusetts-
Catalog No.Nei033)(7)Goat Anti-Mouse IgG Fc Fragment F(ab′)2(Jackson Immuno-Research Labs，Avondale，Pennsylvania-Catalog No.115-0646)(8)Rabbit Anti-Goat IgG Fc Fragment F(ab′)2(Jackson Immuno-Research Labs-Catalog No.305-0608)(9)Rabbit Antigoat IgG(Cappel，Malvern，Pennsylvania-Catalog No.0612-3151)(10)Mouse IgGl(Catalog No.9041，Litton Bionetics Inc.，Kensington，Maryland)(11)Mopc 104E，a Purified mouse myeloma Protein(Catalog Nol 8402-29，Litton Bionetics，Inc.)例如，单核白细胞可以是用Anti-Leu-lla，Anti-Leu-llb或Anti-Leu-llc抗体(Becton Dickinson)标记，只有这些用抗体标记的细胞才能用阳性选择进行分选。或者，由于有Fc受体的细胞直径为7μ-25μ，可采用根据大小分类细胞的淘析离心器〔Beckman Instruments〕。
作为上述步骤一个可供选择的办法是当为人由人供体获得效应细胞，有可能采用利用了，例如Fenwal CS-3000(Fenwal Labs，Deerfield，Illinois)或Haemonetics 30型白细胞移动机(Haemonetics Corp.，Braintree，Massachusetts)〔T Loftus等，“白细胞电透法用Fenwal CS3000增加粒性白细胞的产量”，J.Clin.Apheresis，1，pp.109-14(1983)和H.Braine等，“外周血淋巴细胞体外增殖反应和定期血移动供体内的血清免疫球蛋白”，J.Clin.Apheresis，2，pp.213-18(1985)〕的白血球除去法技术。白细胞电透法，允许通过一个安放在具有进出患者线路的线路中的离心机，从循环的外周血中获得白细胞。采集白细胞並把红细胞再送回给病人。该技术与从一个单元的血获得白细胞相比，其优点是能收集更多的白细胞，因此，也就是更多的具有Fc受体的效应细胞。
从患者或供体获得效应细胞后，把它们放入到如Hanks平衡盐溶液这样的平衡的盐溶液解质中或组织培养解质中，例如用经热失活的5%胎儿小牛血清，5%Ultroser G或5%自体血清增补的RPMI-1640，也可添加抗菌素，如庆大霉素(5μg/ml)，青霉素(10units/ml)，链霉素(10μg/ml)或它们的混合物，在4℃冰箱中保存。如果效应细胞要在体外保存超过24小时，就要把它们放置在含有细胞存活所需基本营养的解质中。最好，把它们经过快速冷冻到-70℃后，进行冷冻贮存。
根据本发明，效应细胞的活化可以在体外，用淋巴细胞活素，同种或异种的血清，或它们的混合物处理细胞来完成。采用的淋巴细胞活素可以是由天然原料用常规技术纯化的，也可以是通过重组技术产生的。本发明中最适用的淋巴细胞活素是r干扰素(“r-IFN”)和内白细胞素-2(“IL-2”)。为了活化效应细胞，它们可以单独使用，结合使用或相继使用。r-IFN最合适的剂量为600单位/ml，其有效范围为200-2500单位/ml。IL-2最合适的剂量为750单位/ml，其有效范围为30-2000单位/ml。用这两个淋巴细胞活素进行相继的结合处理最好先用r-IFN处理，再用IL-2处理，其用量为已指出的单独处理时的量。
根据本发明，效应细胞通常在体外，用淋巴细胞活素，同种或异种的血清或它们的混合物进行处理，並於37℃在5%CO2气中保温或在4℃冷藏一段足以使细胞活化的时间，以使依赖抗体细胞的细胞毒性增加到超过正常的水平，可通过相继的采样测定来证实活化作用。更具体地说，在悬浮液中每ml解质最好含105-107效应细胞的效应细胞，用淋巴细胞活素，同种或异种血清，或它们的混合物处理1-7天，最好是3-4天。
效应细胞在活化后和给患者施用前，可以进行冷冻贮藏。或者，效应细胞也可以局部活化，冷冻贮藏，使用前再解冻和进一步活化。例如活化的效应细胞可以放置在用胎儿小牛血清，正常人血清，或血清代用品，如Ultro Ser G，和二甲亚砜(“DMSO”)增补的组织培养解质中，並用控制速度的细胞冷冻设备或任何一种常规的冷冻方法，尽可能快地把它冷冻到至少-70℃。贮藏后，活化的效应细胞在细胞温度不超过37℃下，尽可能快地被解冻。
在本发明的方法和组合物中，抗体最好与活化的效应细胞一起使用以调整对靶细胞增强了的ADCC作用，並显示所取得的效应细胞活化作用的程度。上述的抗体是IgG类的，最好是IgG2抗体，它们有Fc区並能主要辨认对特定的癌或非恶性肿瘤特异的，或在癌或非恶性肿瘤细胞上以比在正常细胞上更高密度存在的抗原。
上述的抗体包括下列的例
(1)GAGRA-Goat anti-Gross Passage A Virus(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland)(2)PAGRA-Pig anti-Gross Passage A Virus(National Institute of Health，Bethesda，Maryland)(3)Anti-CALLA(Becton Dickinson，Mountain View，California-Catalog No.7500)(4)J-5 Anti-CALLA(Coulter Immunology，Florida-Catalog No.6602143)(5)BA3 Anti-CALLA(Hybritech，Inc.，San Diego，California-Catalog No.0672)(6)ANTI-HPCA-1(Becton Dickinson-Catalog No.7660)(7)Rabbit Anti-Nalm6(一个多克隆抗体，它是由用一星期静脉注射一次1×107Nalm-6细胞，共五星期的方法超免疫一个新西兰雌兔而产生的)根据本发明较好的实施例，在把细胞施用于患者以前，先把对靶转化细胞有特异性的抗体连接到活化的效应细胞上。这样的连接可通过把体外活化的效应细胞与高浓度的单一的或汇集起来的单克隆或多克隆抗体一起保温来完成。例如可以以每2mg抗体107细胞的比率让活化的效应细胞与抗体接触进行这种连接，然后把混合物保持在室温或37℃，或在4℃冷藏，大约1-72小时。下文中，与抗体连接了的活化效应细胞称为装备的效应细胞(armed effectorCells)。
例如把抗体连接到已用本发明方法活化的血沉棕黄色层白细胞上，白细胞先采用离心法，用RPMI-1640洗三次，离心是用装有TH-4转子的Beckman TJ-6离心机，以1200rpm离心5分钟。用多级清洗方法除去结合松散的亲细胞免疫球蛋白，增加Fc受体与所需要抗体结合的效力。然后通过在密度梯度解质，如Ficoll-Hypaque(Litton Bionetics，Bethesda，Maryland)中的离心分离，进一步纯化效应细胞。把收集到的白细胞界面再悬浮在每0.5-2.0mg抗体含有至少5×107效应细胞的RPMI-1640解质中，並在缓慢摇动的情况下，在室温，或37℃下保温，或在4℃下冷藏1-72小时。然后让效应细胞通过明胶血浆代用品，如凝胶状胞浆(HIT Corporation，Buffalo，New york)或在密度梯度解质，如Ficoll-Hypaque中离心分离进行沉淀，以便在给患者施用以前，把这种抗体的连接装配到效应细胞上。连接到靶特异抗体上的效应细胞就可以像下面所讲的那样可以给病人施用。
通过把用本发明方法活化的效应细胞，以治疗学上或肿瘤学上有效的剂量施用于癌或非恶性肿瘤患者，对他们进行治疗。如前所述，活化的效应细胞最好在施用以前，让对靶细胞特异的抗体连接到它们上面。活化的效应细胞可以以液体剂型通过静脉注射或输注的方式给药。活化效应细胞的可注射/可输注的溶液也包括常规的药剂学上可接受的载体，如无菌的生理盐溶液。
一次或在一个连续治疗阶段中，活化效应细胞的投药量取决于最初剂量中存在的和有效的活化效应细胞的体积和活性，患者的健康状况，癌或非恶性肿瘤的病历和严重性以及治疗医生的判断。有效剂量的范围大约为1×106-5×1010细胞。治疗的效果，可在治疗后的不同间歇，通过分析血样或骨髓样(对白血病和淋巴瘤)，或通过测定肿瘤重量减少的速率(对致瘤病)来确定。
当没有连接抗体下施用处理过的效应细胞时，患者可用抗体或其他的物质进行预处理，以增加体内循环的抗体量，最好是对肿瘤特异的抗体。例如患者可以通过静脉注射或输注单一的单克隆或多克隆肿瘤特异抗体或合并两个或更多个对肿瘤特异的单克隆或多克隆抗体进行处理。有用的抗体是那些属于免疫球蛋白-G“IgG”类的、通过体外分析确定具有ADCC调节能力、以及能够识别癌特异抗原或要优先发现的抗原或者以更高的密度在癌或非恶性肿瘤细胞上的抗体。
为了能更充分地了解这里所述的发明，列示了下面的实例，这些实例仅是为了达到具体说明的目的，无论如何不是对发明的限制。
实例下列的实例中，用两个试验方法来查定效应细胞在用本发明方法活化前后的细胞毒素活性和抗肿瘤增生的潜力。它们一个是ADCC51铬释放试验，一个是抗肿瘤细胞增生试验。
ADCC51铬释放试验51铬释放试验是一种测定效应细胞细胞毒素活性的方法。对ADCC51铬释放试验，我们采用了由R.Perlmann和G.Perlmann阐述的改良法(见“纯化的淋巴细胞对覆盖抗体的小鸡红细胞的接触性溶菌作用”Cell Immunol.，1，P.300(1970))。
用51铬(固体铬酸盐)〔Dupont-New England Nuclear，Catalog ＃NEZ-030S;1mci/ml浓缩物〕如下标记靶细胞。将2.5×106或5.0×106靶细胞吸入到一个17×100mm的塑料离心管中，分别加入0.05ml51铬或0.1ml51铬，在含5%的湿润CO2的气氛(Forma Scientific Water Jacketed Gas Processor Incubator-Model 3315，Forma，Marietta，Ohio)中，於37℃下，保温75分钟。离心管的盖子不要盖得太严，在75分钟保温阶段的中间，摇动一次。加入5ml含有RPMI-1640(Gibco Laboratories，Grand Island，New york)，並添加了经热失活的5%胎儿小牛血清(Gibco Laboratories)的洗涤解质洗细胞后，离心管在装有TH-4转子(Beckman Instruments，Palo Alto，Califonia)的Beckman TJ-6离心机中，以1200rpm转速，离心5分钟。除去上层清液，加入5.0ml(对2.5×106标记细胞)或10.0ml(对5.0×106标记细胞)洗涤解质，使最终浓度为5.0×105标记细胞/ml。然后取出1.0ml的标记细胞，放到一些4ml管中，将它们分组，以供下面这样的处理。
第一组靶细胞，未用抗体标记，用1.5ml的洗涤解质洗二次，以1200rpm转速，离心5分钟。除去上层清液后，把靶细胞再悬浮在1.0ml的洗涤解质中，使浓度为5×105活细胞/ml。再用洗涤解质调节细胞，浓度最终为5×104活细胞/ml。
第二组靶细胞，用抗体进行了标记，以1200rpm转速，离心5分钟。除去上层清液后，将这些小粒状的靶细胞再悬浮在0.10-0.25ml适当的抗体中。靶细胞与抗体的混合物，在摇动的条件下，在室温下，保温30分钟。然后把1.5ml洗涤解质加入到混合物中，用1200rpm离心5分钟。除去上层清液后，重复洗涤三次。用洗涤解质再悬浮靶细胞，以使最终浓度为5×104活细胞/ml。
我们按照下述制备效应细胞(用本发明方法活化过的或未被活化的)。用10ml含有RPMI-1640的解质洗涤效应细胞，在装有TH-4转子的Beckman TJ-6离心机中，以1200rpm转速，离心5分钟。除去上层清液，为了做效应细胞∶靶细胞＝140∶1的试验，用洗涤解质再悬浮效应细胞，使其最终浓度为7×106活效应细胞/ml，而为了做效应细胞∶靶细胞＝47∶1的试验，用洗涤解质再悬浮效应细胞，使其最终浓度为2.3×106活效应细胞/ml，这样，对每个靶细胞就有0.5ml的效应细胞。
把靶细胞和效应细胞接到一式三份的孔穴微量滴定板(Costor Plastics，Cambridge，Massachusetts)上。一些自发孔穴形成加靶细胞和稀释剂的地方。最大的一些孔穴形成加靶细胞和洗涤剂的地方。效应细胞孔穴是加效应细胞，靶细胞，在有的情况下还加稀释剂的孔穴，而且其中的效应细胞∶靶细胞可以是140∶1-1∶1。
吸取0.1ml的稀释剂，RPMI-1640解质，到每个自发孔穴和有最高效应细胞与靶细胞比例的效应细胞孔穴中。前三个孔穴或每个靶细胞行的最大孔穴中都不加稀释剂。然后吸0.15ml的效应细胞到每个靶细胞行的前三个孔穴並对效应细胞作一系列的1∶3稀释，一式三份，然后，用吸管从每个第一个孔穴中吸0.05ml效应细胞到每个第四个孔穴中。搅匀第四个孔穴，从每个第四个孔穴中吸0.05ml效应细胞，加到它们每个第七个孔穴中。搅匀每个第七个孔穴，吸出其内容物0.05ml。对孔穴的两个系列2，5和8以及3，6和9中的每一系列都重复上述的稀释操作。再把0.1ml的靶细胞(浓度为5×104活细胞/ml)加入到每个靶细胞行的孔穴中。接着，在含有靶细胞但不含有稀释剂的孔穴中，例如最大孔穴中，加入0.1ml的洗涤剂，Triton X-100，1%的RPMI-1640解质。
然后平衡板的重量，以1000rpm转速，旋转1分钟，以实现细胞与细胞的接触。把板於37℃，在含CO2的湿润空气中，放置4小时。4小时后，以2000rpm转速将板离心10分钟。由每个孔穴中吸0.1ml的上清液到一个液体闪烁计数器的微量小并(Beckman Instruments)中，吸时要避免任何小形颗粒的扰动。然后在每个管中加入1ml的闪烁合剂(Beckman HP/b)，盖好盖，进行摇动。将每个管放入到液体闪烁计数器(Beckman Instrumentsl，Model LS-3801)中，计数1分钟，以测定放射性。
通过平均三份的51铬测定法的每分钟的计数(“CPM”)，根据下列公式，计算出特定靶细胞细胞毒性的百分比溶菌%＝ (试验的CPm-自发的CPm)/(最大的CPm-自发的CPm) ×100其中-试验的CPm＝有效应细胞存在时靶细胞释放出的放射性
-自发的CPm＝没有效应细胞存在时靶细胞释放出的放射性-最大的CPm＝有洗涤剂存在时靶细胞释放出的放射性抗肿瘤细胞增生试验抗肿瘤细胞增生试验是效应细胞，通过ADCC，抑制体外肿瘤细胞增生能力的一个量度。
从组织培养并中，收集靶肿瘤细胞，用RPMI-1640洗，並把它悬浮在生长解质中，使浓度达到1.25×104活细胞/ml。用Titer-Tek多槽吸管(made for Flow Laboraties by Eflab Oy，Finland)，把80ml培养生长解质放入96个孔穴的u型底面灭菌微量滴定板(Costar Plastics)的孔7-36中。
用RPMI-1640洗效应细胞(用本发明方法活化的或未活化的)，並调节浓度到2.5×106活细胞/ml。将效应细胞，涂覆在六个一样的孔穴上，以达到总共36个孔穴中6个效应细胞与靶细胞的比例值为200∶1;100∶1;50∶1;25∶1;13∶1;6∶1。孔穴1-6，每个放浓度为2.5×106的效应细胞160ul。从孔穴7-12的每个孔穴中取出80ul效应细胞，把它们分别转移到孔穴13-18中，通过重复吸移进行混合。这样1∶2的稀释重复到孔穴＃36。然后从孔穴30-36中弃去80ul。将20ul合适的试验抗体加入到试验行的每个孔穴中，並把20ul的培养解质加入到效应细胞的36个对照孔穴中(“2号对照”)。随后，把80ul的靶细胞加入到试验行的每个孔穴中(36个2号对照孔穴和仅含有抗体的36个对照孔穴)。36个只含有效应细胞的对照孔穴(“1号对照”)中加入80ul培养解质。
这些板於37℃，在湿润的5%CO2的空气中保温，总共24小时。保温20小时后，所有的孔中都加入50ul浓度为20μci/ml的3H-胸苷(Dupont-New England Nuclear)。在收获所有孔穴之前15分钟，每个中都加入15ul浓度为1∶250的胰蛋白酶(Gibco Laboratories New york)，以便实现细胞从板塑料上分离。随后，通过PHD细胞采集机(Cambridge Technology，Cambridge，Massachusetts)的自动细胞采集，把所有的孔穴都采集到过滤盘，PHD No.240-1玻璃纤维过滤条(Cambridge Technology，Cambridge，Massachusetts)上。把干燥的滤物放入塑料的微量小并(Beckman Instruments)中，加入2.0ml的闪烁合剂(Hp/b，Beckman)，激烈摇动，在液体闪烁计数器中对β射线计数。每分钟的衰变(“DPM”)可以被计算出来，並对六个重复样取平均值(“
X”)。没有抗体的效应细胞与靶细胞的对照孔穴作为肿瘤增生的基础。根据下列公式，可以计算出作为抗增生一个量度的抑制百分数
当抗增生试验中使用了装备效应细胞，用下列公式计算测定抗增生的抑制百分数
＊“3号对照”代表在没有靶细胞下，由装备效应细胞培养物所得到的值。
为了对上述两个试验作个比较，可以用51铬释放试验和抗肿瘤细胞增生试验平行地测定效应细胞的ADCC活性。在比较试验中，我们用根据前述方法分离的人效应细胞，把它悬浮在添加了5mg/ml庆大霉素和5-10%胎儿小牛血清的RPMI-1640中，靶细胞用GAGPA抗体标记了的Zbtu肿瘤细胞，采用了各种不同的效应细胞对靶细胞的比例(ETRatio)。51铬试验进行(如前述)4小时，抗增生试验进行(如前述)24小时。估量51铬释放试验的特异细胞毒性百分数和估量抗肿瘤细胞增生试验的肿瘤增生的抑制百分数都列示在表Ⅰ中。
表Ⅰ效应细胞与 特异细胞试验＃ 增生的抑制(%)靶细胞的比率 毒性(%)100 51.7 107.450 38.5 89.41 25 30.4 59.212.5 28.1 33.36.25 18.4 25.0100 73.7 99.750 39.1 99.82 25 29.6 91.912.5 - 55.76.25 - 34.9
效应细胞与 特异细胞试验＃ 增生的抑制(%)靶细胞的比率 毒性(%)100 61.5 84.250 53.0 69.43 25 41.2 46.112.5 18.6 32.36.25 6.7 24.0体外51铬释放试验的分析表明，在引起抗原调节的抗体存在下，ADCC敏感性降低。特定的单克隆抗体(结合了白血病细胞的抗原)已经显示出能引起抗原的调制，如CALLA(J.Ritz等，“急性成淋巴细胞白血病的血清疗法与单克隆抗体”，Blood，58，pp.141-52(1981)和J.M.Pesando等，“人体与白血病有关的抗原(CALLA)的分布与调制”，J.Immunology，131，pp.2038-45(1983))。正如下述，抗增生试验在对准稳定和调节抗原时是灵敏的，足以探测ADCC的调节作用。试验是在并内，经受着轻微的摇动或不经受摇动时进行的。摇动促使了细胞的运动，以利於细胞与细胞间的接触，有可能使抗原的调节作用减到最小。试验按上述进行，只是摇动是把并子放在摇动平台(Labquake Labindustries，Berkeley，California)上建立的並调整在每分钟大约为40-50次摇动。肿瘤靶细胞是Zbtu和Nalm-6系。所用的抗体包括GAGPA，RaNalm或抗-CALLA(＃7500，Becton-Dickinson，Mountain View，California)。抗增生试验和51铬释放试验的结果列示在表Ⅱ上。
表Ⅱ特异细胞 抑制(%)靶 抗体 毒性(%) 摇动 不摇动Zbtu 无 6.1 0 0GAGPA 79.5 86.5 88.1Nalm-6 无 3.4 0 0RaNalm 58.9 103.5 93.8CALLA 7.1 47.3 10.9冷冻贮藏我们通过51铬释放试验，做了些试验来评价冷冻贮藏(-75℃)对效应细胞ADCC活性的影响。靶细胞是带有GAGPA抗体的Zbtu肿瘤。效应细胞按上述取自三个健康人供体，並根据Pross等“用於生物学反应变更研究的NK细胞试验的标准化”，J.Immunological Methods，68，pp.235-49(1984)，的技术进行冷冻。12-58天后解冻，按前面讲过的那样，用标准洗涤解质再补洗两次。解冻的效应细胞，按前面讲过的方法进行活化。表Ⅲ列示了冷冻前后细胞的存活力，用细胞毒性百分数表示的ADCC活性和冷冻后活细胞恢复的百分比数。
表Ⅲ%存活力 %细胞毒性 %恢复的供体天0 天(×) 天0 天(×) 活细胞数1 94 93(12) 76 68(12) 672 92 80(34) 71 49(34) 583 97 94(58) 71 58(58) 62被治疗的肿瘤根据本发明方法，被治疗的动物体内的肿瘤，例如是Zbtu，起源於胸腺内注射Gross Passage A病毒的C3Hf近系繁殖鼠的T-细胞白血病/淋巴瘤。割除初生的胸腺瘤，用灭菌的生理盐水悬浮细胞並将它由内腹膜注射到正常的C3Hf成年鼠受体鼠内，以诱发腹水形式的肿瘤。这种肿瘤自1970年开始在体内已被连续地转移。平均残存时间为16天的C3Hf鼠有少於10个细胞的LD100。这种肿瘤的亚系已适应於在体外生长，並不显示出肿瘤形成的明显损失。Zbtu肿瘤细胞表达了下列的表面抗原，它们可用完全依赖于血清毒性的非直接免疫荧光法，FACS(萤光活化细胞分析器)分析法以及ADCC来检测(1)Thy1.2(2)gp70(3)P12(4)Gross Passage A Virus根据本发明方法，用於体内治疗鼠的抗体是GAGPA抗体。
实例1对C3Hf同系繁殖的小鼠〔在明尼苏达鼠群大学繁殖並从马里兰州沃克斯维尔(Walkersville)的微生物学会得到〕在第0、7和14天通过将C57B1/6J〔缅因州，巴尔哈鲍(Bar Harbor)的杰克逊(Jackson)实验室〕种供体全脾组织的5×5毫米切片移植到耳囊中进行三次异种抗原接触。在第17天，从接触异种抗原的小鼠和正常鼠令对照组上无菌切除宿主的脾，将脾细胞通过一个304型CX-30号的不锈钢目筛(Small Part公司，弗罗里达，迈阿密)而被采集到用5%小牛胚胎血清增补的“完全Dulbecco最小基本培养基中(纽约州Grand Island，Gibco实验室)。在具有1.0×107细胞/毫升的C57B1/6J刺激细胞浓度下、且反应细胞和刺激细胞的比例为1∶1的情况下，将脾细胞放在单向混合的淋巴细胞培养物(“MLC”)〔J.C.Cerottini等人“体外T淋巴细胞细胞毒的产生，I.在混合白血细胞培养物中正常小鼠和免疫小鼠脾细胞的反应”J.Exp.Med.(实验医学杂志)，140卷703页(1974)〕中培养3-7天，反应细胞在对GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞(表Ⅳ)进行的51铬释放试验(以前讲到过)中被用作为效应细胞。
在体内治疗具有大于1×105个Zbtu白血病细胞的小鼠时，反应细胞也用作效应细胞。把含有1.0×107效应细胞的平衡盐溶液以及在某些情况下和GAGPA抗体一起以静脉注射方式注射到患白血病的C3HF小鼠中(表Ⅴ)。在表Ⅵ中A组代表已经接受0.1毫升GAGPA和0.2毫升平衡盐溶液静脉注射的10只小鼠，B组代表已接受0.1毫升正常羊血清和含0.2毫升(1.0×107活细胞)效应细胞的平衡盐溶液静脉注射的10只小鼠，C组代表已接受0.1毫升GAGPA和含0.2毫升(1.0×107)效应细胞的平衡盐溶液静脉注射的10只小鼠。
表Ⅳ特异ADCC的百分比-5天MLC效应细胞∶靶细胞比例 未接触抗原的 接触抗原的140∶1 19.9 56.047∶1 10.4 47.016∶1 8.3 31.2表Ⅴ治疗后的具有肿瘤小鼠的存活百分比组别 6周 10周 18周A 20 0 0B 10 0 0C 100 90 40实例2从健康的人供体的外周血液中如下地分离出效应细胞由静脉穿刺从供体抽取一个单位(450CC)的外周全血放入含有63毫升抗凝剂-磷酸柠檬酸盐-葡萄糖腺嘌呤-1溶液的一个CPDA血袋中，並置于十个50毫升的试管中，然后，血样在具有TH-4转子的Beckman TJ-6离心机上以1200转/分的转速离心分离10分钟，使得血细胞沉淀，白细胞形成一层浅黄色覆盖层，通过该血浆上层用吸管吸取。
从每个管子中收集该浅黄色层，並在为了进一步分选出效应细胞而进行密度离心分离之前，将它们集中到一个50毫升的试管中，然后加Hank平衡盐溶液至体积为17.3毫升，在50毫升玻璃管中小心地将该容积分层到14毫升的Ficoll-hypaque上。在20℃温度下，在具有TH-4转子的Beckman TJ-6离心机上将该管以1400转/分的转速离心分离30分钟，用吸管移弃上层，收集其界面白细胞，置于一个50毫升玻璃管中，加入30毫升灭菌洗涤介质(用至少2%本体血清增补的RPMI-1640)，该管以1400转/分离心分离15分钟，去除上清液，将效应细胞重新悬浮在8-10毫升洗涤介质中。然后，取少量的悬浮液置于一个小管中。然后吸取所需容积的效应细胞，並在洗涤介质或实验介质中洗两次。将这种白细胞以1×107细胞/毫升的浓度悬浮在RPMI-1640培养介质中。
然后，在按前面讲过的方法制备的、与同种的(由无关供体汇集的)或异种的(由C57B1/6J繁殖鼠的脾汇集的)经辐射成2500R刺激细胞具有1∶1比例的单向混合淋巴细胞培养物中培养这些白细胞。在与刺激细胞混合之前(第0天)以及与刺激细胞一起保持在培养物中3至7天后，反应细胞在对未标记的或用GAGPA标记的Zbtu肿瘤靶细胞进行的51铬释放试验中用作为效应细胞。表Ⅵ表示了ADCC活性的增加，是在用混合淋巴细胞培养物处理过的效应细胞的51铬释放试验中(效应细胞、靶细胞＝140∶1)测定的。
表Ⅵ特异ADCC的百分比刺激细胞 0天 3天 5天 7天同种的 38.1 61.3 86.2 79.5异种的 38.1 53.2 66.6 59.7实例3除了血放在250毫升瓶中而不是10个50毫升的试管以及不汇集其浅黄色白细胞层外，按照例2指出的步骤由健康的人供体取得450毫升的外周血液。将白细胞以1×107细胞/毫升的浓度在具有不同量γ干扰素(细胞产品公司，Buffalo，New York)情况下悬浮在含有庆大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培养介质中，γ干扰素以100-1000单位/毫升范围的量存在。得到的培养物在4℃的空气中、或37℃含5%CO2的空气恒温箱中保持1-4天。在与干扰素混合之前以及在1～4天的干扰素各处理期后，处理过的效应细胞被用在对未标记或用GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞进行的51铬释放ADCC试验中。表Ⅶ表明了处理过的效应细胞的ADCC活性的增加，它是51铬释放试验中(效应细胞∶靶细胞＝140∶1)测得的。
表Ⅶ特异ADCC的百分比单位 4℃ 37℃IFN 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天100 36.3 39.1 43.7 45.9 42.8 46.6 39.1200 36.3 ND ND ND 49.7 51.9 59.3600 36.3 43.8 51.1 49.4 36.4 53.6 51.21000 36.3 33.2 36.1 39.4 ND ND ND-特异ADCC的百分比是平均值-ND＝未测实例4如例3一样地分离人的白细胞效应细胞，並以1×107细胞/毫升的浓度将它们悬浮在含有庆大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培养介质中。将重组体内白细胞素-2(Genzyme公司，Boston，Massachusetts)加入效应细胞培养液中，其量的范围为30到750单位/毫升。
这样得到的培养物在4℃的空气中或37℃含5%CO2的空气恒温箱中保温1至4天处理过的效应细胞在与该内白细胞素-2混合之前和在1～4天的内白细胞素-2的各种处理期限后被用在对未标记或用GAGPA标记的Zbtu肿瘤细胞进行的51铬释放ADCC试验中。
表Ⅷ特异ADCC的百分比单位 4℃ 37℃IL-2 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天30 43.2 36.9 46.3 51.2 51.6 62.3 55.450 43.2 ND ND ND 39.5 51.9 60.7100 43.2 48.7 49.6 54.6 ND ND ND250 43.2 39.2 55.4 49.3 56.4 62.1 57.8500 43.2 ND ND ND 60.6 63.7 59.4700 43.2 36.1 52.7 61.1 61.4 60.9 58.3特异ADCC百分比是平均值ND＝未测实例5如实例4一样地分离人的白血球效应细胞，並以1×107细胞/毫升的浓度把它悬浮在含有庆大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培养介质中，然后以100-1000单位/毫升之间变化的量将γ干扰素(细胞产品公司，Buffalo，纽约)加到培养基中，在37℃含5%CO2的空气恒温箱中保持培养物1～4天。然后，效应细胞在RPMI-1640培养介质中洗三次，除去所加的干扰素，然后以100-1000单位/毫升之间变化的量把内白细胞素-2加到这些细胞中，並在37℃含5%CO2的空气恒温箱中保持1～4天。然后这些效应细胞在与淋巴细胞活素混合之前以及在用淋巴细胞活素处理的各种处理期限后，被用于对未标记的Zbtu和未标记的Nalm-6肿瘤靶细胞，GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞和兔的抗-Nalm-6标记的Nalm-6肿瘤靶细胞进行的51铬释放ADCC试验中，测定ADCC的百分比活性。
表Ⅸ说明了处理过的效应细胞ADCC活性的增加(效应细胞∶靶细胞的比率为140∶1)表Ⅸ特异ADCC的百分比GAGPA标记的 兔的抗Nalm-6标记Zbtu靶细胞 的Nalm-6靶细胞组 0天 2天 4天 6天 0天 4天A 41.4 66.7 89.1 76.3 36.3 75.2B 41.4 ND 79.8 73.6 36.3 88.7C 41.4 90.1 106.5 101.3 36.3 94.3D 41.4 88.2 91.4 ND 36.3 NDE 41.4 75.5 86.3 89.1 36.3 NDA- 600单位IFN，500单位IL-2B- 600单位IFN，250单位IL-2C- 200单位IFN，600单位IL-2D- 600单位IFN，600单位IL-2E- 1000单位IFN，100单位IL-2对各组，效应细胞在IFN(第一)，和IL-2(第二)中培养相等的时间。
ND-未测定实例6如实例5一样地分离人的白血球效应细胞，並以1×107细胞/毫升的浓度将它们悬浮在具有本体血清的RPMI-1640中。然后用51铬释放ADCC试验测定这些细胞的ADCC百分率。
随后，在RPMI-1640介质中清洗效应细胞三次，除去本体血清，並将它们悬浮在含庆大霉素(5微克/毫升)、並用1%Ultroser G，5%本体血清，5%小牛胚胎血清或5%同种血清增补的RPMI-1640培养介质中。将这种培养物在4℃空气中或37℃含5%CO2的空气恒温箱中保持1～4天，将这些效应细胞在与任一RPMP-1640的增补介质混合前以及在各种处理期之后，用于对未标记的Zbtu和未标记的Nalm-6肿瘤靶细胞，GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞，抗-CALLA标记的Nalm-6靶细胞和兔的抗-Nalm-6标记的Nalm-6肿瘤细胞进行的51铬释放ADCC试验中，测定其百分比ADCC活性。
表Ⅹ说明处理过的效应细胞对GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞ADCC活性的增加(效应细胞∶靶细胞的比例＝140∶1)表Ⅺ说明处理过的效应细胞对用抗CALLA或兔的抗Nalm-6抗体标记的Nalm-6肿瘤靶细胞ADCC活性的增加(效应细胞∶靶细胞的比例＝140∶1)
表Ⅹ特异ADCC的百分比4℃ 37℃培养介质 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天A 38.6 39.6 41.3 38.6 39.3 40.2 42.8B 38.6 43.1 36.3 31.8 41.4 33.2 36.8C 38.6 68.7 83.2 79.4 81.5 93.1 86.4D 38.6 64.4 69.7 91.5 86.7 78.5 85.3表Ⅺ特异ADCC的百分比培养 抗CALLA标记的 兔的抗Nalm-6标记的介质 Nalm-6靶细胞(37℃) Nalm-6靶细胞(37℃)0天 2天 0天 2天A 12.1 17.3 32.1 31.1B 12.1 13.4 32.1 39.5C 12.1 37.8 32.1 69.4D 12.1 39.1 32.1 61.6A- 用1%Ultroser G(LBK Industries，Gaitherburg，Maryland)增补的RPMI-1640B- 用本体血清增补的RPMI-1640C- 用热失活的5%小牛胚胎血清(Gibco实验室，Grand Island，纽约)增补的RPMI-1640
D- 用5%采集的同种血清增补的RPMI-1640实例7如例6所述那样分离人的效应细胞，並把它们悬浮在用5%本体血清或1%Ultroser G(失活细胞)增补的RPMI-1640中，或悬浮在用5%小牛胚胎血清(失活细胞)增补的RPMI-1640中，以得到细胞浓度为1×107细胞/毫升的每种悬浮液，在1或2天的处理周期后，通过这些处理过的效应细胞对用GAGPA抗体标记的Zbtu靶细胞和用兔的抗Nalm-6抗体标记的Nalm-6靶细胞的ADCC测定其百分比抗增生的活性。
表Ⅻ证明了由于处理过的效应细胞，抑制了肿瘤靶细胞的增生。
表Ⅻ抗增生的百分比效应细胞 Zbtu靶细胞 Nalm-6靶细胞1天 2天 1天 2天失活的 24.3 32.1 20.1 19.6活性的 84.2 78.8 82.6 92.3用单克隆抗体去连接、因而“装备”效应细胞可用51铬释放试验和抗增生试验两种方法评价。对能够识别在Zbtu细胞表面上表达的抗原的单克隆抗体进行分析，以确定它们调节ADCC的能力。
IgG 2a类的单克隆抗体，抗Thy 1.2(＃630021 Miles Scientific)和IG2b类的单克隆抗体，抗Thy1.2(＃1330Becton-Dickinson，Mountain View，加利福尼亚)能识别在鼠的“T”细胞和Zbtu肿瘤细胞系上表达的Ty1.2抗原。这种试验用未标记的或用GAGPA标记的Zbtu靶细胞作为对照。人的效应细胞或是用抗体(GAGPA或Thy 1.2)“装备”了的或是未装备的(未处理过的)。这些试验结果见表ⅩⅢ表ⅩⅢ靶细胞 抗体 效应细胞 特异细胞毒 抑制增生的性的百分比 百分比Zbtu None 未装备的 5.9 0Zbtu GAGPA 未装备的 79.1 86.6Zbtu GAGPA 装备的 65.3 79.7Zbtu THY1.2(2a) 未装备的 78.6 104.5Zbtu THY1.2(2a) 装备的 74.3 88.8Zbtu THY1.2(2b) 未装备的 82.5 86.3Zbtu THY1.2(2b) 装备的 75.4 89.8实例9由8个诊断有白血病人供体每人的外周血液抽取50毫升血放到含有2毫升肝素(肝素钠注射剂-1000USP单位/毫升，Elkins-Sinn公司，Cherry Hill，New Jersey)抗凝剂的60毫升注射器中，然后如例2所述那样分离白细胞，在不作进一步处理的情况下，通过对未标记的和GAGPA抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞以及本体肿瘤靶细胞的51铬释放ADCC试验，对效应细胞进行分析作为对照。
培养过的效应细胞以1×107细胞/毫升的浓度用含有庆大霉素的10%同种或10%异种血清刺激1～5天，再测试ADCC。表ⅩⅣ表明白血病供体效应细胞对各种Zbtu肿瘤细胞和本体肿瘤靶细胞调节ADCC的能力。
表ⅩⅣ特异ADCC的百分比Zbtu靶细胞 本体肿瘤靶细胞病人号 诊断 治疗 情况 0天 2天 0天 2天1 ALL CC 急性 32.6 58.4 31.1 53.42 CML CC 复发 14.0 21.1 13.3 37.73 CLL CC Rem 49.5 83.4 ND ND4 ALL CC Rem 19.8 62.7 ND ND5 CLL CC 复发 8.7 12.2 5.4 18.76 CML BMT Rem 31.4 60.9 ND ND7 T淋巴 CC Rem 23.2 71.1 ND ND8 CLL CC Rem 45.1 52.4 ND ND定义ALL-急性淋巴细胞白血病CLL-慢性淋巴细胞白血病CML-慢性骨髓性白血病Tlymph-“T”细胞淋巴瘤CC-结合化疗BMT-骨髓移植(同种的)Rem-缓解ND-未测表ⅩⅣ中2号和5号病人在外周血液样中已经广泛污染了肿瘤细胞。在这两个病人中，大于80%的效应细胞是恶性的。因此，调节过的每个这种病人血样中的效应细胞的浓度相当于从其它病人得到血样中的效应细胞浓度恢复的20%左右。此外，他们是在治疗时处于缓解的病人3，4，6，7，8的外周血液中没有任何循环中的肿瘤细胞。
实例10来自4个诊断有白血病人每人的外周血液得到白细胞。如例8所述那样抽取和分离白细胞。这种白细胞在用10%小牛胚胎血清增补的RPMI-1640中，在37℃湿润CO2(10%)的恒温箱中培养24小时。用对未标记的或用GAGPA多克隆抗体Thy 1.2-2a或Thy1.2-2b单克隆抗体记标的Zbtu肿瘤靶细胞进行的51铬释放ADCC试验分析效应细胞，结果列于表ⅩⅤ。
表ⅩⅤ病人号 诊断 治疗 情况 抗体没有 GAGPA Thy 1.2(2a) (2b)1 CML CC Rem 0 16 39 132 ALL CC Rem 0 68 71 643 CML 未 慢性的 1 22 45 164 CML 未 慢性的 1 39 65 23
实例11由五个诊断具有白血病人每人的外周血液得到白血细胞，如例8所述的那样抽取血液並分离白细胞。效应细胞用以下五个程序之一处理(1)不处理;(2)在用10%小牛胚胎血清增补的RPMI-1640中培养48小时;(3)在用IL-2(70单位/毫升)增补的RPMI-1640中培养48小时;(4)在用IFE(300单位/毫升)增补的RPMI-1640中培养48小时;(5)在用IFN(300单位/毫升)增补的RPMI-1640中培养24小时。在标准洗涤介质(如上述)洗两次，在IL-2(70单位/毫升)中另外再培养24小时，所有的培养物在37℃湿润的CO2(10%)恒温器中培养。用对GAGPA多克隆抗体标记的Zbtu肿瘤靶细胞进行51铬释放ADCC试验分析效应细胞。结果例于表ⅩⅥ中表ⅩⅥ病人号 诊断 治疗 情况 0天 FCS IL-2 IFN IFN/IL-21 ALL 未 急性 23 - - 30 312 CML 未 慢性 39 45 45 - -3 CML CC 缓解 16 40 28 - -4 CML CC 复发 12 33 20 - 215 CML 未 慢性 22 51 - - -实例12用血流血球计数法分析按本发明的方法活化的效应细胞，对结合了单克隆抗体Len-Ⅱa的效应细胞用直接免疫萤光法，而对结合了Leu-Ⅱb的用间接免疫萤光法。Leu-Ⅱa和Leu-Ⅱb是被认为能识别在大颗粒淋巴细胞和颗粒细胞中Fc受体的抗体(B.Perussia等人，“人体自然杀伤细胞IgG的Fc受体用单克隆抗体进行遗传表型的，功能的和对比的研究”J.Immunol，133卷180页(1984)〕。
如例5那样分离人的白血球效应细胞，並按照分别在例7，3，4和5中提出的步骤用本体血清或小牛胚胎血清、r-IFN、IL-2、或r-IFN+IL-2混合物处理这些细胞。处理的具体时间和温度，以及所用的血清或淋巴细胞活素的浓度在表ⅩⅦ中指出。
收取每个处理组的细胞，並以1×106活细胞/毫升的浓度将它们悬浮在磷酸盐缓冲液中(PBS，0.01M磷酸盐，0.15M Nacl，PH7.2-7.4)。並洗涤这些细胞，用具有TH-4转子的Beckman TJ-6离心机在1200rpm下离心分离5分钟。将这些细胞颗粒分成4组，並在以下每一组中悬浮一种颗粒。
A组Leu-Ⅱa，5ul抗体，40ulPBS，以获得1∶9的稀释度。
B组小鼠IgGI，6ul 1×106个细胞的200ug/ml浓度，(非特异对照)C组Leu-Ⅱb，5ul抗体，40ulPBS，以获得1∶9的稀释度。
D组MoPc 104E纯化的小鼠骨髓瘤蛋白质，5ul，每1×106细胞稀释度为1∶5(非特异对照)4组细胞的每一组在一遮光的容器中，在4℃下培养30分钟。然后洗效应细胞两次，每次加1.0ml PBS，並在1200rpm离心分离这种混合物5分钟。
然后将A组和B组的每一组细胞再悬浮在0.1ml PBS中，到浓度为1×106活细胞/ml並进行分析。
将C组和D组的每一组细胞再悬浮在通过加入0.1ml的，在PBS中稀释度为1∶50的抗体，而与羊的抗鼠IgM抗体(Tago，Inc.Burlingaml，加里福尼亚)结合的亲合纯化的异硫氰酸萤光素盐(FITC)中。然后，这些效应细胞在一个遮光的容器中，在4℃下再培养30分钟将每组细胞洗两次，每次加0.1ml PBS，在1200rpm下将混合物中离心分离5分钟。然后，将每组细胞重新悬浮在1.0ml PBS中至浓度为1.0×106存在细胞/ml，並进行分析。
然后，在用血清或淋巴细胞活素处理前或血清或淋巴或淋巴细胞活素处理並接触抗体后在FACS Ⅳ细胞分离器中通过流动细胞计数法评价这些效应细胞的免疫萤光特性。
用400mW，488nM的光(氩激光)激发FITC。用一个90°再聚焦透镜收集萤光辐射。绿光通过一个530uM的带通滤波器送到一个光电倍增管中(EMI.nu，99224A)，绿萤光90°角的光散射峰值电信号由模拟量转换成数字量。由一个线性放大器放大，並分配到256个通道上。用在X轴上的萤光通道数和在y轴上的相对阳性细胞数画出直方图。(B和D组)没有特殊对照的值。将实验数值减去非特异对照值(B和D组)以得到平均通道值和阳性细胞的百分比(实验的平均通道一对照的平均通道二平均通道差和阳性细胞的百分比)，阳性细胞百分比数据反映了具体与抗体结合的细胞数。平均通道数据表明阳性细胞免疫萤光的强度。因而也表明了发生与抗体结合的相对量。
这些效应细胞还在用血清或淋巴细胞活素处理前以及在这些处理和接触抗体后，用于对GAGPA抗体-标记的Zbtu肿瘤靶细胞进行的51铬释放ADCC试验中。
已具体参照发明最佳形式叙述了我们的发明。显然，对于该技术领域：
中的专业人员，在不脱离本发明的要旨和范围的情况下，可以对本发明做出各种各样的变化和改进，本发明的要旨和范围是由所附的权利要求
规定的。
权利要求
1.一个处理具有抗体FC区表面受体的效应细胞以增加它们的依赖抗体细胞的细胞素活性的方法，包括在体外用由淋巴细胞活素、同种异型血清、异种血清或其混合物中选出的一种材料活化所说的效应细胞的步骤，以使所说效应细胞的依赖抗体细胞的细胞素的活性至少增加到效应细胞在它们自然状态下活性的1.25到125倍之间。
2.根据权利要求
1的方法，进一步包括在体外或体内将一种抗体连接到活化的效应细胞上的步骤，所说的抗体具有一个FC区，並主要识别癌或非恶性肿瘤上的特异抗原或以比正常细胞更高的密度出现在癌或非恶性肿瘤上的抗原。
3.根据权利要求
1或2的方法，其特征为所说的效应细胞选自于白细胞，淋巴细胞、单核细胞、K细胞和NK细胞。
4.根据权利要求
1或2的方法，其特征为所说淋巴细胞活素选自γ干扰素、内白细胞素(interleukin)-2或其混合物。
5.根据权利要求
1或2的方法，其特征为所说异种血清是小牛胚胎血清。
6.根据权利要求
1或2的方法，其特征为所说化合物处理1至7天的时间周期。
7.根据权利要求
2的方法，其特征为所说癌或非恶性肿瘤选自于固体的肿瘤、液体的肿瘤、骨髓瘤、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
8.根据权利要求
1的方法，其特征为所说抗体是IgG抗体。
9.根据权利要求
8的方法，其特征为所说抗体是IgG2抗体。
10.根据权利要求
1或2的方法，其特征为所说效应细胞的供体是所说效应细胞的受体。
11.根据权利要求
1和2的方法的一种效应细胞。
12.用于治疗癌或非恶性肿瘤的一种组合物，它含有对癌症是有效量的权利要求
11的效应细胞。
13.一种治疗癌和非恶性肿瘤的方法，其特征为包括了用根据权利要求
12的组合物治疗一种哺乳动物的步骤。
专利摘要
本发明是有关癌和非恶性肿瘤的免疫治疗的方法和组合物。更具体的说，本发明是有关通过提高调节依赖抗体细胞的细胞毒性的细胞素活性来增强身体的免疫反应的方法和组合物。根据本发明得到的这些细胞是以提高细胞素活性为特征的，这些细胞用于治疗各种类型的癌和非恶性肿瘤的方法和组合物中。
文档编号A61K35/14GK86104913SQ86104913
公开日1987年5月27日 申请日期1986年6月28日
发明者加里·R·兰杜希, 托尼·N·马里尼 申请人:明尼苏达州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan