专利名称：一种防治癌症肿瘤的绿茶药物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中医药领域，具体的说涉及一种用于防治癌症肿瘤的绿茶纯中医药药物，本发明还涉及其胶囊制剂的制备方法与应用。
背景技术：
大量的实验研究表明，茶叶内含有较为丰富的抗癌有效成分，其中茶多酚的作用最大，对于茶叶中有效化学成分的抗癌作用机理的研究也有很多，发现茶叶对抗癌作用是多组分、多靶位、多途经的作用机制，目前比较公认的是茶叶的抗氧化、清除自由基机制，由于茶叶抗氧化的作用较强，其在抗肿瘤、抗衰老和心血管疾病方面都引起人们的广泛关注。茶叶的品种不同，其抗癌活性不同，而绿茶是一种含有丰富抗癌活性物质的茶叶。
癌症和肿瘤是当今医学界的难题，对于癌症和肿瘤的治疗药物很多，但大多是化学药物，真正有效和副作用小的药物几乎没有。因此，人们迫切期待疗效显著、副作用小的生物药物的问世。中国专利申请号为02111627.X，名称为表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用，公开了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在制备抗肿瘤药物中的应用，但是该单体价格昂贵，而且抗肿瘤活性不强。
发明内容
本发明的目的是针对现有癌症和肿瘤治疗上存在的问题，通过对绿茶作深入的研究，提供一种防治癌症肿瘤疗效显著、副作用小的绿茶药物。
本发明的另一个目的是提供上述绿茶药物胶囊制剂的制备方法。
本发明的另一个目的是提供上述绿茶药物在制备用于防治癌症肿瘤药物上的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种防治癌症肿瘤的绿茶药物，由如下组分和重量份组成绿茶500～800
绿茶提取物 50～100；两种组分混合后，用高效液相方法检测混合物中EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的含量，根据检测结果，加入相应的单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的总重量份为EGCG 25～35ECG 25～35EGC 15～25EC5～15TFG 0.5～1.0。
本发明所采用的绿茶为绿茶干燥物粉状物，所用绿茶品种为云南大叶、金萱、黄金桂、英红九号中的一种或几种的混合物。所述绿茶提取物提取所用的绿茶也是云南大叶、金萱、黄金桂、英红九号中的一种或几种的混合物。五种单体化合物的简称为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、茶黄素没食子酸酯(TFG)。
上述绿茶药物的优选含量范围为绿茶重量份为600～700，绿茶提取物重量份为70～80；所述EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的重量份为EGCG28～32，ECG28～32，EGC18～22，EC8～12，TFG0.7～0.9。
上述绿茶药物的最佳含量范围为绿茶重量份为700份，绿茶提取物重量份为80份；所述EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的重量份为EGCG30，ECG30，EGC20，EC10，TFG0.8。
上述绿茶提取物是由如下方法制备而成取绿茶，第一次加入8～12倍体积的水，85～95℃提取1.0～1.5小时；第二次加入4～6倍体积的水，85～95℃提取0.5～1.0小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至80～85℃时，相对密度为1.05～1.10的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达65～75％，静置，滤取上清液，回收乙醇，在50～55℃时浓缩至相对密度为1.30～1.35的清膏，干燥，粉碎得到绿茶提取物。
上述防治癌症肿瘤的绿茶药物胶囊制剂的制备方法为按比例取绿茶干燥粉碎至200～300目的细粉；按比例另再取绿茶，第一次加入8～12倍体积的水，85～95℃提取1.0～1.5小时，第二次加入4～6倍体积的水，85～95℃提取0.5～1.0小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至80～85℃时，相对密度为1.05～1.10的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达65～75％，静置，滤取上清液，回收乙醇，在50～55℃时浓缩至相对密度为1.30～1.35的清膏，再将清膏与绿茶细粉混匀，干燥，粉碎成200～300目的细粉；取混合细粉，用高效液相方法检测四种单体含量后，再按比例加入用于调配的各单体化合物，混匀，干燥，再粉碎成200～300目的细粉，装入胶囊，即可得到绿茶药物胶囊。
本发明的绿茶药物在防治癌症肿瘤上疗效显著。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明的绿茶药物活性高，在预防治疗癌症肿瘤上疗效显著。
(2)本发明的制备方法简单，成本低。
(3)本发明的药物是一种植物药物，环保，副作用小。
(4)本发明的应用和市场前景广阔。
图1为未经药物作用的癌细胞凋亡透射电镜图；图2为EGCG作用后癌细胞凋亡透射电镜图；图3为绿茶活性胶囊作用后癌细胞凋亡透射电镜图。
其中，图1中，细胞形态基本正常，未见出现凋亡小体；图2中，细胞边缘溶化，并出现凋亡小体；图3中，细胞边缘溶化，并出现凋亡小体。
具体实施例方式
实施例1绿茶药物胶囊的制备将云南大叶种绿茶干燥粉碎成200目的细粉，取500克；另取粉末状的大叶种绿茶，第一次加入10倍的水，95℃提取1.0小时，第二次加入5倍的水，95℃提取0.5小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至80℃时，相对密度为1.05的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达70％，静置24小时，滤取上清液，回收乙醇，在50℃时浓缩至相对密度为1.31的清膏，干燥，粉碎得到200目的绿茶提取物，取50克绿茶提取物。将500克绿茶和50克绿茶提取物混合均匀，用高效液相方法检测混合物中EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的含量后，再加入用于调配的各单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物总含量分别为25克、26克、16克、8克、0.5克，混匀，干燥，再粉碎成200目的细粉，装入胶囊，制得绿茶药物胶囊。
实施例2绿茶药物胶囊的制备将金萱绿茶干燥粉碎成250目的细粉，取800克；另取干燥粉末状的金萱绿茶，第一次加入10倍的水，95℃提取1.2小时，第二次加入5倍的水，95℃提取0.8小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至82℃时，相对密度为1.08的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达70％，静置24小时，滤取上清液，回收乙醇，在52℃时浓缩至相对密度为1.33的清膏，干燥，粉碎得到250目的绿茶提取物，取100克绿茶提取物。将800克绿茶和100克绿茶提取物混合均匀，用高效液相方法检测EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物含量后，再加入用于调配的各单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物总含量分别为35克、35克、25克、15克、1克，混匀，干燥，再粉碎成250目的细粉，装入胶囊，制得绿茶药物胶囊。
实施例3绿茶药物胶囊的制备将英红九号绿茶干燥粉碎成300目的细粉，取650克；另取干燥粉末状的小叶种绿茶，第一次加入10倍的水，95℃提取1.5小时，第二次加入5倍的水，95℃提取1.0小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至85℃时，相对密度为1.05的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达70％，静置24小时，滤取上清液，回收乙醇，在55℃时浓缩至相对密度为1.35的清膏，再将清膏干燥，粉碎得到300目绿茶提取物，取80克。将650克绿茶和80克绿茶提取物混合均匀，用高效液相方法检测EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的含量，再加入用于调配的各单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体总含量分别为30克、30克、20克、10克、0.8克，混匀，干燥，再粉碎成300目的细粉，装入胶囊，制得绿茶药物胶囊。
实施例4绿茶药物胶囊对癌细胞增殖抑制作用细胞株与培养细胞株人Burkitt’s淋巴瘤RAJI、人低分化鼻咽癌SUNE1和人鼻咽癌CNE2细胞株由中山大学肿瘤防治中心提供。
细胞培养各细胞株接种于含10％小牛血清(Gibco，经56℃，30min灭活)，100U·ml-1青霉素及100μg·ml-1链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃含5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养传代。实验所用的细胞均是对数生长期的细胞。
MTT法测定肿瘤细胞存活率将对数生长期细胞稀释成1×105cells·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，同时分别加入2.0mg/L，4.0mg/L，8.0mg/L，16.0mg/L，32.0mg/L浓度梯度的试验样品处理，每浓度平行6孔，同时设0.1％DMSO溶剂对照组和生理盐水对照组置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养48h。实验终止前4h每孔加入MTT磷酸缓冲液(MTT浓度为5mg·ml-1)10μl。培养结束后每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡10min，使MTT还原产物完全溶解。用550Model酶标仪，以570nm为实验波长，450nm为参考波长测定其吸收度，按下式计算肿瘤细胞抑制率并计算半数抑制浓度IC50。肿瘤细胞存活率＝实验孔测定值/对照孔测定值×100％；肿瘤细胞抑制率＝1-肿瘤细胞存活率。再按Bliss公式计算(BIO-RAD model 500所带软件)程序求出半数抑制浓度IC50。
绿茶药物胶囊对癌细胞增殖抑制结果经不同浓度的绿茶药物胶囊作用后，CNE2、RAJI、SUNE1细胞的抑制率见表1。表中的结果表明3种细胞抑制率随药物浓度升高而逐渐增强，并以浓度依赖性关系抑制癌细胞增殖。由这些结果可计算其半数抑制浓度IC50见表1。
结论绿茶药物胶囊能抑制三种癌细胞的增殖，细胞抑制率随药物浓度升高而逐渐增强；绿茶药物胶囊对癌细胞的抑制作用是CNE2＞RAJI＞SUNE1，表明它对不同的癌细胞的抑制效果是不相同的。
表1、绿茶药物胶囊对CNE2、RAJI、SUNE1细胞增殖的抑制率浓度(mg/L) IR(CNE2)(％)IR(RAJI)(％)IR(SUNE1)(％)2.0 22.03±0.41 19.23±0.31 18.66±0.334.0 40.13±0.86 42.11±0.63 39.85±0.778.0 68.55±1.02 65.31±0.83 62.42±0.5716.084.01±1.24 80.21±0.78 79.69±0.8332.088.22±1.21 84.67±0.86 83.95±0.97IC50(mg/L) 5.015.696.68注表中的数据均为三次重复的平均值，±后标出的数据均表示标准误(S.E)
实施例5 绿茶药物胶囊清除O2.-的作用绿茶药物胶囊清除O2.-实验用pH值为7.8的0.05mol/L混合磷酸盐缓冲液为溶剂，配制含3.3×10-6mol/L核黄素，0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑兰(NBT)及各种浓度的儿茶素氧化产物，在25℃下，4000Lx照度下光照30min，于560nm处测定溶液的吸光度。
核黄素在光照条件下产生O2.-，O2.-能将NBT还原为蓝色的甲月替，在560nm处测其吸光度为A，可表示为O2.-的含量，加清除剂后能清除O2.-，抑制了甲月替的产生，测得其吸光度为A1，则A-A1表示O2.-的减少量。其清除率可通过下式进行计算清除率(SCR)＝(A-A1)/A×100％实验结果经不同浓度的EGCG和药物胶囊作用后，清除O2.-清除率(SCR％)的结果见表2。表中的结果表明2种试验药剂清除O2.-能力均随其浓度升高而逐渐增强，由此计算其半数清除浓度SC50。
结论从它们SC50的结果表明，药剂清除O2.-能力是绿茶药物胶囊＞EGCG，但其成本则大大低于EGCG。结果还表明绿茶药物胶囊具有较好的清除自由基的作用，能有效地清除生物体内过多的自由基。
表2、绿茶药物胶囊在不同浓度下对O2.-的清除率(％)浓度(mg/L)EGCG 绿茶药物胶囊20.0 92.6±2.193.2±2.38.0 80.6±1.788.7±2.04.0 68.5±1.076.8±2.22.0 50.3±1.559.2±1.50.8 28.6±1.035.7±1.30.4 18.9±1.120.2±1.0SC50(mg/L) 2.0 1.7注表中的数据均为三次重复的平均值，±后标出的数据均表示标准误(S.E)实施例6绿茶药物胶囊对癌细胞的作用绿茶药物胶囊对癌细胞凋亡的实验为了考察绿茶药物胶囊对人鼻咽癌(CNE2)的诱导凋亡作用，应用活细胞对荧光剂拒染能力和凋亡细胞受染的原理，在对数生长的癌细胞接种在6孔培板中，每孔3×104细胞数/孔。每孔内加入1640细胞培养液2ml，置于CO2培养箱中培养24小时，然后加入EGCG、绿茶药物胶囊至其最终浓度达到2.0mg/L，再培养24小时后，吸取培养液，加入0.5ml(含异硫氰酸荧光素0.01％)的生理盐水溶液，20min后，在荧光显微镜下观察细胞中荧光着色数目(％)。所有药剂对体外对数生长的CNE2细胞处理24小时后，以5个孔平均数计算，每孔中癌细胞的荧光着色凋亡细胞百分数(％)，以此作为癌细胞凋亡指数，对照组以不加入药作对照，结果见表3。
绿茶药物胶囊对癌细胞分裂实验收集CNE2对数期细胞，以3×104个/ml接种在6孔培板平中，培养方法同前所述，加入EGCG、绿茶药物胶囊至其最终浓度达到2.0mg/L，加药后12小时，用酶消化脱壁，经1000r/min离心后，滴点在玻片上，显微镜计数，计算其癌细胞核分裂指数(‰)，对照组以不加入药作对照，结果见表3。
表3、绿茶药物胶囊的癌细胞凋亡指数AI(％)和癌细胞核分裂指数MI(‰)组号 AI(％)MI(‰)对照组3.5±1.2 159.0±2.0EGCG 42.1±1.5 40.2±1.8绿茶药物胶囊 55.7±1.4 32.6±1.3注表中的数据均为多次重复的平均值，±后标出的数据均表示标准误(S.E)透射电镜观察细胞凋亡实验以CNE2对数期细胞为空白对照，用EGCG、绿茶药物胶囊(浓度为2.0mg/L)作用48小时后，弃培养液，迅速用戊二醛、锇酸双固定，细胞刮子小心刮取细胞，离心，缓冲液冲洗，乙醇上行脱水，包埋，切片，重金属盐(铀、铅)电子染色，透射电镜观察，拍照。
实验结果应用活细胞凋亡指数的荧光测试技术测定不同药剂的癌细胞凋亡指数，癌细胞凋亡指数越大，其诱导凋亡效应越强，从表3的EGCG和绿茶药物胶囊等2种药剂的癌细胞凋亡指数AI(％)来看，其对癌细胞诱导凋亡效应为绿茶药物胶囊＞EGCG。
核细胞分裂指数反映癌细胞的增殖能力和生长速度，核细胞分裂指数越大，癌细胞的增殖能力和生长速度越强，表3的结果表明，抑制癌细胞生长能力为绿茶药物胶囊＞EGCG。
从癌细胞凋亡的透射电镜观察图片来看，对照组细胞基本是完整的(图1)，经EGCG和绿茶活性胶囊作用后的细胞则出现不同的凋亡小体(图2-3)，但两者的差别不是很大，表明绿茶活性胶囊与EGCG一样，都可使癌细胞产生凋亡现象，抑制其生长。
结论上述的这些结果说明绿茶药物胶囊对癌细胞的作用能力比单体要强，表明绿茶药物胶囊经本发明通过绿茶粉、绿茶提取物和单体调配组合后，成本降低，而活性并没有减少，对防治癌症肿瘤具有较好的效果。
权利要求
1.一种防治癌症肿瘤的绿茶药物，其特征在于由如下组分和重量份组成绿茶 500～800绿茶提取物 50～100；两种组分混合后，检测混合物中EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的含量，根据检测结果，加入相应的单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的总重量份分别为EGCG25～35ECG 25～35EGC 15～25EC 5～15TFG 0.5～1.0。
2.如权利要求1所述的绿茶药物，其特征在于所述绿茶重量份为600～700，绿茶提取物重量份为70～80；所述EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的重量份为EGCG28～32，ECG28～32，EGC18～22，EC8～12，TFG0.7～0.9。
3.如权利要求2所述的绿茶药物，其特征在于所述绿茶重量份为700份，绿茶提取物重量份为80份；所述EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的重量份为EGCG30，ECG30，EGC20，EC10，TFG0.8。
4.如权利要求1或2或3所述的绿茶药物，其特征在于所述绿茶为云南大叶、金萱、黄金桂、英红九号中的一种或几种的混合物。
5.如权利要求1或2或3所述的绿茶药物，其特征在于所述绿茶提取物是由如下方法制备而成取绿茶，第一次加入8～12倍体积的水，85～95℃提取1.0～1.5小时；第二次加入4～6倍体积的水，85～95℃提取0.5～1.0小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至80～85℃时，相对密度为1.05～1.10的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达65～75％，静置，滤取上清液，回收乙醇，在50℃～55℃时浓缩至相对密度为1.30～1.35的清膏，干燥，粉碎得到绿茶提取物。
6.如权利要求1所述的绿茶药物，其特征在于所述检测是采用高效液相方法检测。
7.一种权利要求1所述防治癌症肿瘤的绿茶药物胶囊制剂的制备方法，其特征在于按比例取绿茶干燥粉碎至200～300目的细粉；按比例另再取绿茶，第一次加入8～12倍体积的水，85～95℃提取1.0～1.5小时，第二次加入4～6倍体积的水，85～95℃提取0.5～1.0小时，合并两次提取液，过滤，滤液浓缩至80℃～85℃时，相对密度为1.05～1.10的清膏，加入乙醇使清膏含醇量达65～75％，静置，滤取上清液，回收乙醇，在50℃～55℃时浓缩至相对密度为1.30～1.35的清膏，再将清膏与绿茶细粉混匀，干燥，粉碎成200～300目的细粉；取混合细粉，用高效液相方法检测五种单体含量后，再按比例加入用于调配的各单体化合物，混匀，干燥，再粉碎成200～300目的细粉，装入胶囊，即可得到绿茶药物胶囊。
8.权利要求1所述绿茶药物在制备用于治疗癌症肿瘤的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述绿茶药物在制备用于治疗淋巴瘤或鼻咽癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种防治癌症和肿瘤的绿茶药物及其制备方法与应用。该绿茶药物，由下述重量份的组分组成绿茶500～800，绿茶提取物50～100；两种组分混合后，用高效液相方法检测其混合物中EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种单体化合物的含量，根据检测结果，加入相应的单体化合物，使得EGCG、ECG、EGC、EC、TFG五种物质的重量份分别为25～35，25～35，15～25，5～15，0.5～1.0。本发明的绿茶药物在防治癌症和肿瘤上疗效显著；同时，本发明的制备方法简单，成本低，副作用小，市场应用前景广阔。
文档编号G01N33/15GK1757408SQ200510036860
公开日2006年4月12日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者罗一帆, 赵超艺, 凌彩金, 许旋, 唐劲驰 申请人:华南师范大学, 广东省农业科学院茶叶研究所