癌症的抑制的制作方法

专利名称：癌症的抑制的制作方法
癌症的抑制本发明涉及常见癌症，特别是结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌的生长、维持 和进展的抑制。结肠直肠癌在美国男性和女性两者中都是第三大常见癌症，根据世界卫生组织在 2003年4月关于全球患癌率的报告，每年有超过940000新病例被诊断并且每年全世界报 道近500，000例死亡。结肠癌的总体5年存活率大约为60%，并且在美国每年有近60，000 人死于该疾病。目前采用的疗法主要根据结肠或直肠中肿瘤的位置和疾病阶段，并且可以包括a) 外科手术，b)化疗，c)生物疗法或d)放射疗法。去除原发肿瘤的外科手术是主要的一线治 疗。然而，外科手术的常见不良副作用包括手术出血、腿部血块以及手术过程中对邻近器官 的损害。手术选择包括⑴肠切除，其包括切入腹部以达到受癌影响的结肠或直肠区域。 外科医生去除癌及其附近的结肠或直肠的部分。然后，将结肠或直肠的两个健康末端重新 缝合在一起；(ii)肝切除，其包括去除已经从结肠直肠区域扩散至肝的转移灶以及癌附近 的肝部分。多达一半的肝可以被去除，只要剩余部分是健康的。破坏肝中癌细胞的两种其他 方法包括放射波(射频消蚀)和热(微波凝固)，和(iii)冷冻手术(还称为冷冻疗法)， 其采用液氮冷冻并破坏已经扩散至肝的结肠直肠癌。其在肝中肿瘤尺寸小时被使用。化疗通常用作针对少数患者外科手术的辅助，通常针对肿瘤已经扩散至淋巴结、 化疗对其益处已经明确的那些患者。然而，化疗副作用包括恶心、呕吐、食欲不振、脱发、 口腔溃疡、手足疹，还包括感染风险、轻伤的出血或青肿、以及贫血相关的疲劳。化疗可 以在多种情况下使用(i)首选化疗通常在结肠直肠癌晚期并已扩散至身体其他部分时使 用。这种情况下，外科手术不能清除癌，所以此时医生通常建议化疗，化疗可以收缩肿瘤结 节、缓解症状并延长寿命；(ii)辅助化疗在癌已经被手术去除之后给予化疗时采用。外科 手术可能不会清除所有癌，因此辅助化疗治疗通常用于杀伤可能被漏掉的任何癌细胞，例 如可能已经转移或扩散至肝的细胞；和(iii)新辅助化疗可以在外科手术之前采用以收缩 肿瘤，以便外科医生能够完全去除肿瘤而产生较少并发症。化疗通常与放射一起使用以使 放射更有效。生物疗法可以被指定用于患有已经扩散的癌症的人。目前疗法包括使用(i)生 物应答调节剂，其不直接破坏癌，而是触发免疫系统反应对抗肿瘤。生物应答调节剂包括细 胞因子，例如干扰素和白介素。然而，该策略包括通过注射或输注的大施用剂量的使用，希 望刺激免疫系统的细胞更有效地发挥作用。此外，生物应答调节剂的使用通常伴随流感样 症状，包括发热、寒战、恶心和食欲不振。其他不希望的副作用包括注射部位皮疹或肿胀、 治疗导致的血压下降、和疲劳；(ii)集落刺激因子，其刺激产生骨髓细胞，例如红细胞和白 细胞和血小板。因此，集落刺激因子不直接影响肿瘤，而是在癌症治疗过程中帮助支持免疫 系统。但遗憾的是，集落刺激因子的使用伴随不希望的副作用，例如骨痛、疲劳、发热和食欲 不振；和(iii)肿瘤疫苗，其促使免疫系统识别癌细胞。所述疫苗通常在癌症发作之后采 用，因此是抑制性而非预防性的。效力差，并且肿瘤疫苗的使用伴随肌肉疼痛和低热。
结肠直肠癌治疗的主要困难在于20-25%患者在最初诊断时具有临床可检测的肝 转移，并且另外有40-50%患者在初次手术之后三年内发展肝转移，通常转移性疾病首先在 肝中发展。除了非黑素瘤皮肤癌之外，乳腺癌是女性中最常见的癌症类型。在2007年，估计 美国女性中有近180，000例侵袭性乳腺癌新病例被诊断。女性发生侵袭性乳腺癌的终生风 险是约1/8(13% )0目前疗法包括外科手术、放射疗法、化疗、激素疗法和生物疗法。选择一种疗法而 不选择另一种疗法涉及如下考虑肿瘤尺寸和位置，组织学因素(例如淋巴侵袭和组织学 亚型确定)，疾病阶段或程度，以及患者年龄和健康状况。外科手术选择包括乳房切除术和肿块切除术(还称为保乳疗法或乳房部分切除 术)，去除或不去除淋巴结。不幸的是，经历乳房切除术的患者通常遭受下述一种或多种 伤口感染和脓肿、皮瓣坏死、胸壁感觉异常、乳房假体综合征、术后疼痛综合征、血清肿或淋 巴水肿。类似地，肿块切除术伴随的并发症包括腋静脉损伤或血栓形成、血清肿形成、淋巴 水肿、肩运动受损、臂丛损伤和胸壁痛。放射疗法伴随如下并发症乳房软组织坏死、长期乳房水肿、肋骨骨折、肩活动性 降低、具有感觉异常和臂痛的臂丛病变、淋巴水肿、血管肉瘤、肺癌、冠状动脉疾病和症状性 肺炎。然而，目前的化疗选择伴随不希望的副作用，例如恶心、脱发、绝经期提前、热潮 红、疲劳和暂时降低的血球计数。此外，更严重的副作用包括肝毒性、出血性膀胱炎、闭经、 小脑共济失调、心肌功能不全、外周神经病变、骨髓抑制、神经毒性、秃顶和胸膜渗漏。迄今，激素疗法集中于Tamoxifen 的使用和/或芳香酶抑制剂例如Arimidex 、 Aromasir^^^ni^mara 的使用。这些治疗分子通过抑制激素特别是雌激素活性而起作用， 并因此抑制可在乳腺癌手术后保留的乳腺癌细胞的生长。但不幸的是，激素疗法伴随不希 望的副作用，例如热潮红和阴道干燥。特别是已经显示Tamoxifen 治疗增加子宫内膜癌风 险、诱导围绝经期症状并增加发展白内障的风险。迄今，生物疗法集中于Here印tin 的使用。然而，该治疗分子的使用伴随如下不 良作用心脏毒性、发热、寒战、恶心、呕吐，并且特别是在初次输注之后可发生疼痛。前列腺癌是死于癌症的美国男性中第二大死亡原因，并且是美国男性中诊断的最 常见癌症。在美国，估计10个男性中有一个将在其生命中发展前列腺癌。与其他癌症类型一样，可用的治疗根据多种因素，例如癌症级别和阶段，患者年龄 和健康状况。目前疗法包括(i)基于PSA血液测试的观察等待，PSA血液测试被定期进行 以检查患者病症还未恶化。该方法被推荐用于影响老年男性的小的、缓慢生长的、非侵略性 癌症，其中所述癌症不影响他们的预期寿命；(ii)前列腺切除术(即，去除前列腺)，但是其 伴随如下副作用膀胱控制问题、漏尿、阳痿和吻合口狭窄；(iii)放射疗法，例如使用高功 率X射线的外部束放射疗法(EBRT)，但是该疗法伴随直肠问题、持续出血和直肠溃疡。可 选地，可以使用直接植入前列腺的放射性粒源植入体(radioactive seed implant)。该疗 法还称为短距离放射疗法，并且递送比通常用外部束所实现的更低的放射剂量(在较长时 段内)。不幸的是，该类型的疗法伴随诸如缓慢且疼痛的排尿和阳痿等并发症；(iv)激素疗 法，其被设计为预防雄性激素刺激癌细胞生长。这通常是通过化学抑制雄性激素分泌或通过外科手术方式(睾丸去除)来实现。不幸的是，这些疗法伴随如下副作用乳房增大、性 欲降低、阳痿、热潮红、体重增加和肌肉和骨质量减少。此外，已经显示一些激素疗法药物导 致恶心、腹泻、疲劳和肝损伤；(V)化疗-采用与上文结肠直肠癌、乳腺癌或前列腺癌上下文 中描述的相同类型的药物；和(Vi)冷冻疗法，其通过冷冻受影响组织而破坏癌细胞。遗憾 的是，该疗法受到限制，因为难以监测冷冻过程的程度，经常导致对膀胱周围组织的损伤和 长期并发症(例如，对直肠或控制排尿的肌肉的损伤)。肺癌是世界上男性和女性中癌症相关死亡的首要原因。世界范围内，肺癌依然是 最常见的恶性疾病，估计每年有104万新病例，这占被诊断的癌症新病例的12. 8%。肺癌导 致世界上每年921，000例死亡，占癌症相关死亡的近18%。目前肺癌疗法包括单独或组合的外科手术、放射疗法和化疗。当采用所述疗法时， 医生考虑肺癌类型(小细胞或非小细胞)，肿瘤尺寸和位置，肿瘤阶段(肺之外是否存在 转移)，和患者的健康状况。对于非小细胞肺癌(NSCLC)，目前可用的治疗包括(i)化疗-不幸的是，NSCLC 对化疗仅中度敏感。单剂疗法应答率大约为15%，较新的药剂(例如Gemcitabine 、 PaclitaxelT\Docetaxel ,Vinorelbine )具有略高的应答率 Q0_25%)。此外，化疗伴随 如下并发症血细胞数目减少、恶心、呕吐、腹泻、口疮和口腔溃疡、脱发和疲劳；(ii)生物 疗法-最近的研究努力重点集中于鉴定分子靶标并利用该认识来发展分子靶向疗法。虽然 几种分钟靶向疗法目前被开发并在NSCLC中测试，但这些疗法伴随不希望的副作用，包括 流感样症状，例如寒战、发热、肌肉疼痛、疲劳、食欲不振、恶心、呕吐和腹泻；(iii)放射疗 法。该类型疗法通常用作外科手术的辅助，或者在因为有限的肺储备或存在合并症而不能 手术切除时单独使用。在早期NSCLC中，单独的放射疗法仅伴随12-16%的5年后存活率。 遗憾的是，并发症是常见的，并且包括恶心、疲劳、皮肤反应、脱发、持续咳嗽、咽喉干燥或 疼痛、以及吞咽困难；(iv)联合化疗放疗-最近研究已经显示，当用共存(而非顺序)的基 于钼的化疗和放射疗法治疗时，具有不可切切除的III期疾病的患者中有限的存活。然而， 与上述癌症类型一样，化疗和放疗的使用具有许多不希望的副作用；(ν)外科手术-这通常 在肿瘤处于早期和/或肿瘤还未扩散时采用。实例包括楔形切除术，其包括去除三角形的 组织薄片。楔形切除术被用来去除肿瘤及其周围的小量正常组织。当处理较大量组织时，称 为分段切除；叶切除术，其包括肺的整个叶(段)的去除；和肺切除术，其包括一个完整肺 的去除。这些治疗介入之后遭遇的副作用包括疼痛、感染，还包括肺炎、出血、血块和其 他感染。此外，手术期间的死亡率肺切除术是6%，叶切除术是3%，而肺段切除术是1 %。对于小细胞肺癌(SCLC)，目前可用的治疗包括(i)化疗-单剂化疗显示范围从 17%至50%的应答率。联合化疗具有良好的应答率和存活率，但是主要副作用包括骨髓 抑制、肾毒性、肿瘤溶解综合征(特征为高尿酸血症、高磷酸盐血症、低血钙症、脱水和血 钾过多症)、脊髓受压和低血钠；(ii)放射疗法-该疗法仅用于减轻症状，并且患者一定会 复发；(iii)外科手术-大部分SCLC患者非手术治疗。例外是具有局限于肺而没有涉及任 何淋巴结的非常早期疾病的相对小数目的患者(< 5% )。此类患者通常在最初诊断程序 时经历肺肿瘤切除术。然而，即使对于这些患者，单独的外科手术被认为不是治愈性的。
具有复发型SCLC的患者具有极差的预后，大约65-70 %的SCLC患者在展示时具有 弥散的疾病。扩散阶段的SCLC目前是不可治愈的，并且具有扩散性疾病的患者的中值存活时间小于1年。即使呈现局部疾病(即，局限期)的患者，其中值存活时间小于2年。SCLC 的5年存活率小于20%。就上述讨论的目前可用的全部疗法(对于讨论的癌症类型的每一个_结肠直肠 癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌)而言，存在另一个问题，即，肿瘤溶解综合征(TLS)。TLS是非 常严重且有时威胁生命的癌症疗法并发症。其可以被定义为自发的或治疗相关的肿瘤坏死 或爆发性细胞凋亡导致的代谢异常集合。TLS患者中观察到的代谢异常包括血钾过多症、 高尿酸血症和高磷酸盐血症与继发性低血钙症；并且可以导致急性肾衰竭(ARF)。癌症(尤其是结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌)继续成为全球范围内动物保 健的主要问题。因此，本领域存在对解决上述问题的一个或多个的替代和/或改良的癌症 治疗剂和疗法的需求。本发明通过提供新一类非细胞毒性抗癌剂而解决了所述问题的一个或多个。更具体说，本发明第一方面提供了用于治疗癌症的多肽，所述多肽包括a.非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够在生长激素分泌细胞中切割细胞外融合器 (exocytic fusion apparatus)的胃白；b.靶向部分(TM)，其能够与生长激素分泌细胞上的结合位点结合，所述结合位点 能够经历胞吞作用以被并入所述生长激素分泌细胞的内体；和c.易位结构域，其能够从所述内体内、跨内体膜和进入所述生长激素分泌细胞的 胞质溶胶中易位所述蛋白酶。使用中，本发明多肽结合生长激素分泌细胞。此后，易位组分导致蛋白酶组分转运 入生长激素分泌细胞的胞质溶胶。最后，一旦在内部，蛋白酶抑制生长激素分泌细胞的细胞 外融合过程。因此，通过失活生长激素分泌细胞的细胞外融合器，本发明多肽抑制生长激素 从其释放/分泌。本发明多肽的‘生物活性’组分由非细胞毒性蛋白酶提供。这一独特的蛋白酶 组通过蛋白酶切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或突触融合 蛋白)而发挥作用-参见Gerald K(2002) "Cell and Molecular Biology (细胞分子生 物学)，，(第四版)John Wiley &Sons, Inc0首字母缩写SNARE源自术语可溶性NSF附着 受体(Soluble NSFAttachment Receptor)，其中NSF指N-乙基马来酰亚胺-敏感因子 (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是细胞内囊泡形成以及由此通过囊泡 转运从细胞分泌分子所必不可少的。因此，一旦被递送至预期靶细胞，则非细胞毒性蛋白酶 能够抑制靶细胞的细胞分泌。本发明多肽结合的主要靶细胞是分泌生长激素正常的、非病态的、非癌细胞。然 而，这些细胞不同于根据本发明治疗的最终的‘下游’癌细胞。本发明提供能够(并用于)减少/最小化生长激素和/或胰岛素样生长因子 (IGF-I)的全身或血清水平的多肽。还提供了用于减少/最小化肿瘤溶解综合征(TLS)的 多肽。本发明多肽特别适合用于治疗以下的一种或多种结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌 和/或肺癌(例如SCLC或NSCLC)；包括它们的转移、癌前状态及其症状。就这方面而言， ‘治疗’包括减少、预防或消除局部、区域或体循环中的癌细胞及其扩散。因此，在本发明的一个相关方面，提供了用于治疗患者癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明多肽。本发明还提供了用于减少患者中生长激素和/或 IGF-I水平(优选全身和/或血清水平)的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本 发明多肽。作为实例，在一个实施方案中，本发明允许保持生长激素基础水平在约lOng/ml、 优选小于6ng/ml、更优选小于4或5ng/ml的阈值。在正常人中，每日生长激素水平可以在 睡眠开始后约1小时达到峰值，水平约35ng/ml。就这一点而言，在一个实施方案中，本发明 允许所述峰值被控制在约25ng/ml、优选小于20ng/ml、更优选小于15ng/ml的阈值。还提 供了用于减少/最小化肿瘤溶解综合征(TLS)的方法。不希望受任何理论束缚，本发明人相信升高的生长激素全身水平导致全身IGF-I 的水平变得升高，并且后者导致增加的IGF-IR活化和癌基因活化的伴随增加，这转而导致 增加的细胞增殖和肿瘤形成/生长。在本发明多肽施用之后，观察到生长激素(例如，人GH)从垂体前部的分泌下降。 类似地，观察到循环IGF-I水平的水平降低。GH/IGF-1水平的所述降低与肿瘤收缩相关。 因此，本发明多肽的使用通过去除主要的对抗作用生物途径之一而提供了用于癌症治疗的 有利环境。施用之后，癌症的区域和远端扩散被减少或消除。就这方面而言，不希望受任何理 论束缚，本发明人相信，转移的扩散被本发明多肽所抑制，本发明多肽降低了 IGF-I的循环 浓度。本发明的一个优点在于，癌症治疗之后，垂体功能恢复正常。换言之，本发明提供 了对垂体具有最小治疗后作用的短效疗法。因此，与目前垂体切除疗法不同，本发明不需要 为防止最初癌症治疗导致的并发症的复杂且令人不悦的治疗后(通常是长期的)方案，所 述并发症例如骨质疏松、短肠综合征、可导致阿尔茨海默病的记忆丧失、关节炎、背痛、纤 维肌痛和慢性疲劳。本发明多肽的生物活性组分是非细胞毒性蛋白酶。非细胞毒性蛋白酶是不杀伤细 胞的独立的一类分子；相反，它们通过抑制除了蛋白合成外的细胞过程而发挥作用。非细胞 毒性蛋白酶作为较大毒性分子的部分由多种植物和多种微生物产生，所述微生物例如梭状 芽抱杆菌(Clostridium sp.)禾口奈瑟菌(Neisseria sp.)。梭菌神经毒素代表主要的一组非细胞毒性毒素分子，并且包括通过二硫键连接在 一起的两条多肽链。两条链被称为重链(H-链)和轻链(L-链)，重链分子量为大约IOOkDa, 轻链分子量为大约50kDa。L链具有蛋白酶功能并表现出对参与细胞外过程的囊泡和/或质 膜相关(SNARE)蛋白(例如，小突触泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-2Q高底物特异性。这 些底物是神经分泌器的重要组分。 主要来自淋球菌(N. gonorrhoeae)种的奈瑟菌和主要来自肺炎链球菌 (S. pneumoniae)种的链球菌产生功能上类似的非细胞毒性毒素分子。此类非细胞毒性蛋白 酶的实例是IgA蛋白酶(参见W099/58571，其在此通过引用整体并入)。因此，本发明的非细胞毒性蛋白酶优选是梭菌神经毒素蛋白酶或IgA蛋白酶。现在讨论本发明的靶向部分(TM)组分，该组分使本发明多肽结合生长激素分泌 细胞、优选结合垂体细胞和/或结合外垂体细胞(extrapituitarycell)。在一个实施方案 中，TM结合垂体腺的前部区域，例如结合促生长素细胞和/或腺垂体细胞。适合的TM包括生长激素分泌细胞受体的配体，例如细胞因子、生长因子、神经肽、凝集素和抗体-该术语包括单克隆抗体和抗体片段，例如Fab、F(ab) ‘ 2、Fv、ScFv等。本发明TM结合生长激素分泌细胞例如垂体细胞上的受体。作为实例，TM可以结合 瘦蛋白(OB)受体及其同种型、生长素释放肽受体、促生长素抑制素(sst)受体(例如sstp Sst2, sst3、SSt4和SSt5及其剪接变体)、胰岛素生长因子(IGF)受体(例如IGF-1)、erbB 受体(例如erbBl、erbB2、erbB3和erbB4及其剪接变体)、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液 素超家族受体(包括其剪接变体)例如垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)受体(例如PAC、 VPAC1和/或VPAC2)、食欲肽(OX)受体和剪接变体(例如OX1和/或0 )、白介素(IL)受 体(例如IL-l、IL-2、IL-6和IL-10受体)、神经生长因子(NTR)受体(例如TrkA(NTR)和 p75 (NTR))、血管内皮生长因子(VEGF)受体(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、铃蟾肽受体 (例如BRS-I、BRS-2或BRS-3)、硬骨鱼紧张肽(urotensin)受体、黑色素浓缩激素受体1、 促乳素释放激素受体、KiSS-I受体、促肾上腺皮质素释放因子受体1和生长激素释放激素 (GHRH)受体。在一个实施方案中，本发明TM结合瘦蛋白受体。此类TM的适合实例包括瘦蛋白 肽，例如全长瘦蛋白肽(例如瘦蛋白^57)及其截短物或肽类似物，例如瘦蛋白、瘦蛋白
70-95 禾口瘦蛋白 116-122。在另一个实施方案中，本发明的TM结合生长素释放肽受体。这方面适合的TM的 实例包括生长素释放肽，例如全长生长素释放肽(例如生长素释放肽117)及其截短物或肽 类似物，例如生长素释放肽24_117和生长素释放肽52_117 ； [Trp3,Arg5]-生长素释放肽(1_5)、 des-Gln-生长素释放肽、皮质抑素(cortistatin)-8、His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys_NH2、 生长激素释放肽(例如GHRP-6)或海沙瑞林(hexarelin)。在一个实施方案中，本发明的TM结合促生长素抑制素(SST)受体。作为实例， 适合的TM包括SST肽和皮质抑素(CST)-肽及其肽类似物，例如D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052)、D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Va 1 -Phe-D-Na 1-NH2 (BIM 23056)或 c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2(BIM-23^8)。其他实例包括 SST 肽SST-14和SST-观；以及肽和肽类似物，例如奥曲肽、兰乐肽、BIM23027、伐普肽、司格列肽 和S0M230。这些TM是用于结合SST受体、特别是sst^sst^sst^ss、和sst5受体的优选 TM。在一个实施方案中，本发明的TM结合胰岛素样生长因子(IGF)受体。适合的实例 包括例如IGF-I肽和IGF-2肽。在一个实施方案中，本发明的TM结合VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族受 体，例如结合PAC (例如PAC1)或结合VPAC (例如VPAC-I或VPAC-2)受体。此类TM的适合 实例包括垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、血管活性肠肽(VIP)及其截短物和肽类似物。在一个实施方案中，TM是VIP肽，包括VIP-I和VIP-2肽，例如VIP (1-28)或其截 短物或肽类似物。这些TM显示与VPAC-I的选择性结合。可选地，可以采用显示与VPAC2 选择性结合的TM，例如mR0M(参见Yu等，Peptides 27 (6) pl359_66 (2006)，其在此通过引 用并入)。在另一个实施方案中，TM可以是PACAP肽，例如PACAP(1-38)或PACAP(1_27)或 其截短物或肽类似物。这些TM是结合PACHf^nPAC-I)受体的优选TM。在另一个实施方案中，本发明的TM结合食欲肽受体(例如(^或 ^受体)。适 合的TM的实例包括全长食欲肽-A肽及其截短物或肽类似物，和食欲肽-B肽及其截短物或肽类似物。在一个实施方案中，本发明的TM结合白介素受体。适合的TM的实例包括IL_1 肽(例如IL-I α、IL-β、IL-18肽)及其截短物或肽类似物、IL-2肽(例如IL_2、IL-3、 IL-12、IL-23肽)及其截短物或肽类似物、和IL-17肽(例如11-17A、IL-17C肽)及其截 短物或肽类似物。在另一个实施方案中，本发明的TM结合NGF受体。适合的TM的实例包括全长NGF 及其截短物或肽类似物。在一个实施方案中，本发明的TM结合血管活性表皮生长因子(VEGF)受体。适合 的TM的实例包括VEGF肽(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E及相关的剪接 变体)及其截短物或肽类似物，和胎盘生长因子(PIGF)及其截短物或肽类似物。在另一个实施方案中，本发明的TM结合ErbB受体。作为实例，TM选自EGF 肽、转化生长因子-α (TGF-α)肽、EGF和TGF-α嵌合体、双调蛋白肽、β细胞调节素 (betacellulin)肽、印igen肽、表皮调节素(印iregulin)肽、肝素结合EGF (HB-EGF)肽、神 经调节蛋白(NRG)肽，例如NRGl α ,NRGl β、NRG2 α、NRG2 β、NRG3、NRG4和神经调节蛋白剪 接变体、tomoregulin 1和2肽、神经蛋白聚糖-C肽、lin-3肽、vein肽、gurken肽、spitz 肽或keren肽；及其截短物和肽类似物。存在4类ErbB受体(称为ErbB 1、erbB2、erbB3 和erbB4)，其还被称为HER受体。存在这些受体的许多变体，其产生自全长受体的可变剪接 和/或切割(例如EGFR vl翻译起始在aa543 ；EGFR vll缺失aa521_603 ；EGFR vIII缺失 aa 6-273 ；EGFRvIII/Δ 12-13缺失aa 6-273和409-520 ；EGFR vIV缺失aa 959-1030 ；EGFR vV 截短在残基 958 ；EGFR TDM/2-7 串联重复 6-273 ；EGFRTDM/18-25 串联重复 664-1030 ； EGFR-TDM/18-26串联重复664-1014)。此外，存在四种ErbB4受体同种型，称为erbB4JM_a、 erbB4JM-b、erbB4CYT_l 和 erbB4 CYT-1。优选的TM结合ErbB受体(例如ErbBl、ErbB2、ErbB3、ErbB4)及其剪接变体，特别 是ErbBl受体。ErbB TM还可以包括含有EGF基序的蛋白，在六半胱氨酸EGF-模块中的第四 个半胱氨酸与第五个半胱氨酸之间具有剪接位点，其中所述模块紧邻潜在配体的跨膜区。 例如，感光细胞间(interphotoreceptor)基质蛋白聚糖_2 (IMP-2)、跨膜肽酶(MEP) 1 α、 ΜΕΡΙ β、粘蛋白(MUC) 3、MUC4、MUC12和MUC17，以及具有T结支架的蛋白，例如马铃薯羧肽 酶抑制剂，和ErbB受体的抗体，例如西妥昔单抗、ABX-EGF,曲妥单抗或EMD72000。其他实 例包括不同ErbB配体的交换结构域(环序列和/或连接氨基酸)产生的嵌合体，例如其中 B-环序列已经被昆虫(果蝇)ErbB配体中存在的B-环序列替代的哺乳动物erbB受体配 体、其中EGF的C-环序列已经被TGF α (44-50)的C-环序列替代的ErbB配体、其中一个或 多个结构域已经被TGF α中相应序列替代而产生EGF/TGFa嵌合体(例如E3T、T3E、E4T、 T4E、T3E4T、T6E和E3T4E)的EGF配体，和其中N-末端TGF α序列(WSHFND)或神经调节蛋 白序列(SHLVK)已经用于替代第一个半胱氨酸残基C末端的N-末端EGF序列(NSDSE)的 EGF嵌合体、TlE和Biregulin。而其他嵌合体包括其中结构域已经被另一个蛋白的EGF样 结构域代替的EGF，所述另一蛋白例如血液凝固蛋白、神经发育蛋白或细胞粘附蛋白(例如 Notch 3、Delta 1、EMR1、F4/80、EMR3 和 EMR4 受体)。在进一步实施方案中，本发明的TM结合黑色素浓缩激素受体1。在这方面适合的 TM的实例包括黑色素浓缩激素(MCH)肽，例如全长MCH及其截短物和类似物。
在另一个实施方案中，本发明的TM结合促乳素释放激素受体。在这方面适合的TM 的实例包括促乳素释放肽及其截短物和类似物。在进一步实施方案中，本发明的TM结合KiSS-I受体。在这方面适合的TM的实例 包括Kissp印tin-10、Kisspeptin-54肽及其截短物和类似物。在另一个实施方案中，本发明的TM结合促肾上腺皮质素释放因子受体1。在这方 面适合的TM的实例包括促肾上腺皮质素-释放激素、尿皮质素(urocortin) 1和尿皮质素 2，包括其截短物和类似物。在另一个实施方案中，本发明的TM结合生长激素释放激素(GHRH)受 体。GHRH还被称为生长激素释放因子(GRF或GHRF)或somatocrinin。本发明的 适合的TM实例包括全长GHRH(1-44)肽及其截短物或肽类似物，例如GHRH(1_29)； GHRH(l-37) ；hGHRH(l-40)-OH ； [MeTyrl, Alal5,22, Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2 ； [MeTyrl, Ala8，9，15,22,28, Nle 27]-hGHRH(1-29)-NH2 ；cyclo (25-29)[MeTyrl, Alal5, DAsp25, Nle27, 0rn29+++]-hGHRH(1-29)-NH2 ； (D-Tyr1)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2 ； (D_Asp3)-GHRH(1-29)-NH2(D_Ala4)-GHRH(1-29) -NH2 ； (D-Thr7)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Asn8)-GHRH(1_29)-NH2 ； (D-Ser9)-GHRH(1-29) -NH2 ； (D-TyrlO)-GHRH(1-29)-NH2 ；(Phe4)-GHRH(1-29)-NH2 ； (pCl_Phe6)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-Tyrl)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-Tyrl, D_Ala2)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-D-Tyrl， D-Ala2)-GHRH(1-29)-NH2 ； (N-Ac-D-Tyrl, D-Ala 2，D_Asp3)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Ala2， NLeu27) -GHRH (1-29) -NH2 ； (Hi s 1，D_Ala2，NLeu27) -GHRH (1-29) -NH2 ； (N-Ac-Hi s 1，D_Ala2， N-Leu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (Hisi,D-Ala 2，D-Ala 4，Nleu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Ala2， D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； (D_Asp3，D_Asn8，NLeu27)-GHRH(1-29)-NH2 ； [Hisl, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 ； [NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-L eu_NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ；H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-IIe-P he-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-As p-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-IIe-L eu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Gl u-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu~NH2 ；H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I Ie-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-N H2 ；H is-Val-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-A Ia-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg ；禾口 His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-A sn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.在进一步实施方案中，TM结合铃蟾肽受体(例如BRS-1、BRS_2或BRS-3)。用于本 发明的结合铃蟾肽受体的TM包括铃蟾肽-最初从蛙皮肤分离的14氨基酸肽(pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)；和哺乳动物中两个已知的同系物，即神经调节肽B和促胃液素释放肽(GRP)，例如猪GRP-Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gl y-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-HiS-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -Mel-NH2,和人 GRP-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2。额外的 TM包括相应的铃蟾肽、 神经调节肽B和GRP截短物及其肽类似物。在另一个实施方案中，本发明的TM结合硬骨鱼紧张肽受体。在这方面适 合的TM包括硬骨鱼紧张肽及其截短物和肽类似物，例如环状神经肽硬骨鱼紧张 肽-II (U-II)。U-II的C末端环区域在不同物种中是强烈保守的，并且包括六个氨基 酸残基(-Cys Ple-Trp-Lys-Tyr-Cys-)，其结构类似于促生长素抑制素-14的中央区域 (-Phe-Trp-Lys-Thr-)。适用于本发明的硬骨鱼紧张肽包括U-II前体肽，例如前原-硬骨 鱼紧张肽-II (包括其两个人1 和139同种型)，及其截短物和类似物，例如十一残基成熟 肽形式。根据本发明的第二个方面，提供了物质组合物，即，包括以下的多肽a.非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够在生长激素分泌细胞中切割细胞外融合器 的蛋白；b.靶向部分(TM)，其能够与生长激素分泌细胞上的结合位点结合，所述结合位点 能够经历胞吞作用以被并入所述生长激素分泌细胞的内体；和d.易位结构域，其能够从所述内体内易位、跨内体膜和进入所述生长激素分泌细 胞的胞质溶胶中易位所述蛋白酶。本发明第一方面的所有特征等同应用于上述第二方面。在本发明第一方面和/或第二方面的优选实施方案中，TM具有人肽氨基酸序列。 因此，优选的TM是例如人GHRH肽、人CST肽或人SST肽。多肽制备本发明多肽包括3个主要组分‘生物活性’(即，非细胞毒性蛋白酶)；TM ；和易位 结构域。与制备此类融合蛋白相关的通用技术通常被称为再靶向毒素技术。作为示例，我 们参考W094/21300；W096/33273 ；W098/07864 ；W000/10598 ；W001/21213 ；W006/059093 ； W000/62814 ；W000/04926 ；W093/15766 ；W000/61192 ；和 W099/58571。所有这些出版物在此 通过引用并入。更具体说，本发明TM组分可以与本发明的蛋白酶组分或易位组分融合。所述融合 优选通过共价键，例如直接共价键或通过间隔分子/接头分子。蛋白酶组分和易位组分优 选通过共价键连接在一起，所述共价键例如直接共价键或通过间隔分子/接头分子。适合 的间隔分子/接头分子是本领域公知的，并且通常包括基于氨基酸的序列，长度为5至40、 优选10至30个氨基酸残基。使用中，多肽具有双链构象，其中蛋白酶组分和易位组分优选通过二硫键连接在一起。本发明多肽可通过技术人员公知的常规化学轭合技术来制备。作为实例，参考 Hermanson, GT. (1996)，Bioconjugate techniques (生物辄合技术)，Academic Press，禾口 Wong，S. S. (1991)，Chemistry of protein conjugationand cross_linking(蛋白辄合禾口 交联的化学)，CRC Press, Nagy等，PNAS 95第1794-99页(1998)。使合成TM与本发明多肽连接的更详细方法提供于例如EP0257742。上述轭合出版物在此通过引用并入。可选地，所述多肽可通过单个多肽融合蛋白的重组制备来制备(参见例如 W098/07864)。该技术基于天然梭菌神经毒素(即，全毒素)被制备的体内细菌机制，并得 到具有下述‘简化’结构排列的融合蛋白NH2-[蛋白酶组分]-[易位组分]-[TM] -COOH根据W098/07864，TM被置于融合蛋白C末端。然后融合蛋白通过蛋白酶处理而被 活化，所述蛋白酶切割蛋白酶组分和易位组分之间的位点。由此产生双链蛋白，包括作为与 另一单多肽链共价连接(通过二硫键)的单多肽链的蛋白酶组分，所述另一单多肽链含有 易位组分和TM。可选地，根据W006/059093，融合蛋白的TM组分位于线性融合蛋白序列中间，在蛋 白酶切割位点和易位组分之间。这确保TM与易位结构域连接(即，如天然梭菌全毒素所发 生的)，但是在这种情况下，两个组分的顺序与天然全毒素相反。蛋白酶切割位点的随后切 割暴露TM的N末端部分并提供双链多肽融合蛋白。上述蛋白酶切割序列可以通过常规方式以DNA水平被引入(和/或去除任何固 有的切割序列)，例如通过定点诱变。可以人工或在计算机软件(例如DNASTAR，Inc.的 MapDraw程序)辅助下进行筛选以确认切割序列的存在。虽然可以采用任何蛋白酶切割位 点(即，梭菌的或非梭菌的)，但下述是优选的肠激酶(DDDDK I )Xa 因子(IEGR J, /IDGR J,)TEV (烟草刻蚀病毒)(ENLYFQ I G)凝血酶(LVPR 丨 GS)PreScission(LEVLFQ J, GP)。其他蛋白酶切割位点包括被非细胞毒性蛋白酶，例如被梭菌神经毒素切割的识别 序列。这些包括被非细胞毒性蛋白酶例如梭菌神经毒素切割的SNARE(例如SNAP-25、突触 融合蛋白、VAMP)蛋白识别序列。具体实例提供于US2007/0166332，其在此通过引用整体并 入。术语蛋白酶切割位点还包括内蛋白，其是自切割序列。自剪接反应是可控的，例如 通过改变存在的还原剂的浓度。上述‘活化’切割位点可以被用作‘破坏性’切割位点(下 文讨论)，将要并入本发明多肽的切割位点。在优选实施方案中，本发明融合蛋白可以包括一个或多个位于N末端和/或C末 端的纯化标签。虽然可以采用任何纯化标签，但下述是优选的His-标签(例如6 X组氨酸)，优选作为C-末端和/或N-末端标签MBP-标签(麦芽糖结合蛋白)，优选作为N-末端标签GST-标签(谷胱甘肽-S-转移酶)，优选作为N-末端标签Hi S-MBP-标签，优选作为N-末端标签GST-MBP-标签，优选作为N-末端标签硫氧还蛋白-标签，优选作为N-末端标签CBD-标签(壳多糖结合结构域)，优选作为N-末端标签。融合蛋白中可以包括一个或多个肽间隔分子/接头分子。例如，肽间隔物可以在纯化标签与融合蛋白分子其余部分之间使用。因此，本发明第三方面提供了编码上述多肽(即，本发明第二方面)的核酸(例如 DNA)序列。所述核酸可以包括在载体形式中，例如质粒中，其可以任选包括复制起点、核酸整 合位点、启动子、终止子和核糖体结合位点的一个或多个。本发明还包括用于在宿主细胞特别是大肠杆菌中或通过杆状病毒表达系统表达 所述核酸序列(即，本发明第三方面)的方法。本发明还包括用于活化本发明多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与蛋白酶接 触，所述蛋白酶在位于非细胞毒性蛋白酶组分和易位组分之间的识别位点(切割位点)切 割所述多肽，从而使所述多肽转化为双链多肽，其中非细胞毒性蛋白酶组分和易位组分通 过二硫键连接在一起。在优选实施方案中，识别位点对于天然存在的梭菌神经毒素和/或 天然存在的IgA蛋白酶不是天然的。本发明多肽可被进一步修饰以减少或预防与分散至非靶向区域相关的不想要的 副作用。根据该实施方案，所述多肽包括破坏性切割位点。所述破坏性切割位点不同于‘活 化’位点(即，双链形成)，并且可被第二蛋白酶切割并且不可被非细胞毒性蛋白酶切割。而 且，当通过第二蛋白酶在破坏性切割位点如此切割时，所述多肽效价降低(例如对预期靶 细胞的结合能力降低，易位活性降低和/或非细胞毒性蛋白酶活性降低)。为了完整性，本 发明的任何‘破坏性’切割位点可以单独用作本发明多肽的‘活化’位点。因此，根据该实施方案，本发明提供了可在位点外(off-site)位置被可控制地失 活和/或破坏的多肽。在优选实施方案中，所述破坏性切割位点被第二蛋白酶(即，破坏性蛋白酶)识别 并切割，所述第二蛋白酶选自循环蛋白酶(例如，胞外蛋白酶，例如血清蛋白酶或凝血级联 的蛋白酶)、组织相关蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(MMP)，例如肌肉的MMP)和细胞内蛋 白酶(优选靶细胞不存在的蛋白酶)。因此，在使用中，如果本发明多肽分散远离其预期靶细胞和/或被非靶细胞摄取， 则所述多肽将通过破坏性切割位点的切割(通过第二蛋白酶)而被失活。在一个实施方案中，所述破坏性切割位点被位点外细胞类型中存在的第二蛋白酶 识别并切割。在该实施方案中，位点外细胞和靶细胞优选为不同的细胞类型。可选地(或 附加地)，破坏性切割位点被位点外位置(例如靶细胞的远端)存在的第二蛋白酶识别并切 割。因此，当破坏性切割在细胞外发生时，靶细胞和位点外细胞可以是相同或不同的细胞类 型。就这一点而言，靶细胞和位点外细胞可以各自具有与本发明相同多肽结合的受体。本发明破坏性切割位点在所述多肽处于位点外位置中或位点外位置处时提供所 述多肽的失活/破坏。就这方面而言，在破坏性切割位点处的切割使多肽效价最小化(当 与缺少相同的破坏性切割位点或具有相同的破坏性位点但是为未切割形式的相同多肽相 比较)。作为实例，减小的效价包括降低的结合(与哺乳动物细胞受体)和/或减少的易 位(向胞质溶胶方向跨哺乳动物细胞的内体膜)和/或减少的SNARE蛋白切割。当选择本发明上下文中的破坏性切割位点时，优选地，所述破坏性切割位点不是 可以单独用于作为其生产过程的一部分的本发明多肽的翻译后修饰的任何蛋白酶的底物。 就这方面而言，本发明非细胞毒性蛋白酶通常采用蛋白酶活化事件(通过单独的‘活化’蛋白酶切割位点，其在结构上不同于本发明的破坏性切割位点)。活化切割位点的目的是切割 非细胞毒性蛋白酶与本发明多肽的易位组分或结合组分之间的肽键，从而提供其中所述两 个组分通过二硫键连接在一起的‘活化’双链多肽。因此，为了帮助确保本发明多肽的破坏性切割位点不负面影响‘活化’切割位点和 随后的二硫键形成，前者优选被引入本发明多肽中距离‘活化’切割位点至少20、至少30、 至少40、至少50和更优选至少60、至少70、至少80个(连续的)氨基酸残基的位置。破坏性切割位点和活化切割位点相对于多肽的天然组分而言优选是外源的(即， 改造/人工的)。换言之，所述切割位点优选不是多肽相应天然组分所固有的。作为实例， 基于BoNT/A L-链或H-链(分别地)的蛋白酶或易位组分可以根据本发明被改造而包括 切割位点。但是，所述切割位点不会存在于相应的BoNT天然L-链或H-链。类似地，当多 肽的靶向部分组分被改造为包括蛋白酶切割位点时，所述切割位点不会存在于相应靶向部 分的相应天然序列中。在本发明的优选实施方案中，破坏性切割位点和‘活化’切割位点不被同一蛋白酶 切割。在一个实施方案中，两个切割位点彼此不同，因为各自识别序列内的耐受氨基酸的至 少一个、更优选至少两个、特别优选至少三个和最优选至少四个是不同的。作为实例，在梭菌L-链和Hn组分之间含有)(a因子‘活化’位点的多肽嵌合体的情 况下，优选在非)(a因子位点的位点采用破坏性切割位点，其被插入L-链和/或Hn和/或TM 组分中的其他地方。这种情况下，多肽可以被修饰以在L-链和Hn组分之间容纳可选的‘活 化’位点(例如，肠激酶切割位点)，这种情况下，单独的叙因子切割位点可以作为破坏性 切割位点在其他地方被并入所述多肽。可选地，L-链和&组分之间存在的fe因子‘活化’ 位点可以被保留，并且诸如凝血酶切割位点的可选切割位点作为破坏性切割位点被并入。当在本发明任何组分的一级序列中鉴定用于加入切割位点的适合位点时，优选选 择与将要插入的建议切割位点密切匹配的一级序列。通过这样做，最小的结构变化被引入 多肽。作为实例，切割位点通常包括至少3个连续的氨基酸残基。因此，在优选的实施方案 中，选择已经具有(在正确的位置)为引入新切割位点所需要的氨基酸残基的至少一个、优 选至少两个的切割位点。作为实例，在一个实施方案中，胱天蛋白酶3切割位点(DMQD)可 以被引入。就这方面而言，优选的插入位置被鉴定，其已经包括选自例如DXXX、XMXX、XXQX、 xxxD、DMxx> DxQx> DxxD> xMQx、xMxD、xxQD、DMQx> xMQD、DxQD 禾口 DMxD 的一级序列。类似地，优选将切割位点引入表面暴露的区域。在表面暴露区域内，存在的环区域 是优选的。在本发明优选实施方案中，破坏性切割位点被引入在下述位置的一个或多个，其 基于BoNT/A的一级氨基酸序列。虽然插入位置是参考BoNT/A被鉴定的(为了方便)，但是 可选蛋白酶结构域和/或易位结构域的一级氨基酸序列可以容易地与所述BoNT/A位置对 齐。对于蛋白酶组分，优选下述位置的一个或多个27-31、56-63、73-75,78-81、 99-105、120-124、137-144、161-165、169-173、187-194、202-214、237-241、243-250、 300-304、323-335、375-382、391-400和413-423。以上编号优选始于本发明蛋白酶组分的
N-末端。在优选实施方案中，破坏性切割位点位于距离蛋白酶组分N-末端大于8个氨基酸残基、优选大于10个氨基酸残基、更优选大于25个氨基酸残基、特别优选大于50个氨基酸 残基的位置。类似地，在优选实施方案中，破坏性切割位点位于距离蛋白酶组分C-末端大 于20个氨基酸残基、优选大于30个氨基酸残基、更优选大于40个氨基酸残基、特别优选大 于50个氨基酸残基的位置。对于易位组分，优选下述位置的一个或多个474-479、483-495、507-543、 557-567、576-580、618-631、643-650、669-677、751-767、823-834、845-859。上述编号优选 明确本发明易位结构域组分的N-末端449起始位置和易位结构域组分C-末端871终止位置。在优选实施方案中，破坏性切割位点位于从易位组分N-末端大于10个氨基酸残 基、优选大于25个氨基酸残基、更优选大于40个氨基酸残基、特别优选大于50个氨基酸残 基的位置。类似地，在优选实施方案中，破坏性切割位点位于从易位组分C-末端大于10个 氨基酸残基、优选大于25个氨基酸残基、更优选大于40个氨基酸残基、特别优选大于50个 氨基酸残基的位置。在优选实施方案中，破坏性切割位点位于从TM组分N-末端大于10个氨基酸残 基、优选大于25个氨基酸残基、更优选大于40个氨基酸残基、特别优选大于50个氨基酸残 基的位置。类似地，在优选实施方案中，破坏性切割位点位于从TM组分C-末端大于10个 氨基酸残基、优选大于25个氨基酸残基、更优选大于40个氨基酸残基、特别优选大于50个 氨基酸残基的位置。本发明多肽可以包括一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或更多个)破坏性 蛋白酶切割位点。当包括超过一个破坏性切割位点时，每个切割位点可以相同或不同。就 这一点而言，超过一个破坏性切割位点的使用提供了提高的位点外失活。类似地，两个或多 个不同的破坏性切割位点的使用提供了额外的设计灵活性。破坏性切割位点可以被加入下述多肽组分的任何一个中非细胞毒性蛋白酶组 分；易位组分；靶向部分；或间隔肽(如果存在)。就这一点而言，破坏性切割位点被选择以 确保对多肽效价的不利影响最小(例如，通过对靶向/结合区和/或易位结构域、和/或对 非细胞毒性蛋白酶结构域的影响最小)，同时确保多肽远离其靶位点/靶细胞时不稳定。优选的破坏性切割位点(加上相应的第二蛋白酶)列于下表中。所列切割位点纯 粹是示例说明性的并且不是要限制本发明。0123
权利要求
1.一种多肽，所述多肽应用于抑制癌症，所述多肽包括a.非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够在生长激素分泌细胞中切割细胞外融合器的蛋白；b.靶向部分(TM)，其与生长激素分泌细胞上的结合位点结合，所述结合位点能够经历 胞吞作用以被并入所述生长激素分泌细胞的内体；和c.易位结构域，其从所述内体内、跨内体膜和进入所述生长激素分泌细胞的胞质溶胶 中易位所述蛋白酶。
2.根据权利要求1应用的多肽，其中所述生长激素分泌细胞是垂体细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2应用的多肽，其中所述TM结合选自由以下组成的组的 受体生长激素释放激素(GHRH)受体、瘦蛋白(OB)受体、生长素释放肽受体、促生长素抑制 素(sst)受体、胰岛素生长因子(IGF)受体、ErbB受体、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超 家族受体、食欲肽(OX)受体、白介素(IL)受体、神经生长因子(NTR)受体、血管内皮生长因 子(VEGF)受体、铃蟾肽受体、硬骨鱼紧张肽受体、黑色素浓缩激素受体1、促乳素释放激素 受体、KiSS-I受体或促肾上腺皮质素释放因子受体1。
4.根据任一前述权利要求应用的多肽，其中所述TM选自由以下组成的组生长激素释 放激素(GHRH)肽、瘦蛋白肽、生长素释放肽、促生长素抑制素(SST)肽、皮质抑素肽、胰岛素 样生长因子(IGF)肽、转化生长因子(TGF)肽、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族肽、 PACAP肽、血管活性肠肽(VIP)、食欲肽、白介素肽、神经生长因子(NGF)肽、血管内皮生长 因子(VEGF)肽、甲状腺激素肽、雌激素肽、ErbB肽、表皮生长因子(EGF)肽、EGF和TGF-α 嵌合肽、双调蛋白肽、β细胞调节素肽、印igen肽、表皮调节素肽、肝素结合EGF(HB-EGF) 肽、铃蟾肽、硬骨鱼紧张肽、黑色素浓缩激素(MCH)肽、促乳素释放肽、Kissp印tin-ΙΟ肽、 Kisspeptin-54肽、促肾上腺皮质素释放激素肽、尿皮质素1肽或尿皮质素2肽。
5.根据任一前述权利要求应用的多肽，其中所述非细胞毒性蛋白酶包括梭菌神经毒素 内肽酶。
6.根据权利要求1-4任一项应用的多肽，其中所述非细胞毒性蛋白酶包括IgA蛋白酶。
7.根据任一前述权利要求应用的多肽，其中所述易位结构域包括梭菌神经毒素易位结 构域。
8.一种多肽，包括a.非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够在生长激素分泌细胞中切割细胞外融合器的蛋白；b.靶向部分(TM)，其与生长激素分泌细胞上的结合位点结合，所述结合位点能够经历 胞吞作用以被并入所述生长激素分泌细胞的内体；和c.易位结构域，其从所述内体内、跨内体膜和进入所述生长激素分泌细胞的胞质溶胶 中易位所述蛋白酶。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述生长激素分泌细胞是垂体细胞。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的多肽，其中所述TM结合选自由以下组成的组 的受体生长激素释放激素(GHRH)受体、瘦蛋白(OB)受体、生长素释放肽受体、促生长素抑 制素(sst)受体、胰岛素生长因子(IGF)受体、ErbB受体、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素 超家族受体、食欲肽(OX)受体、白介素(IL)受体、神经生长因子(NTR)受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体、铃蟾肽受体、硬骨鱼紧张肽受体、黑色素浓缩激素受体1、促乳素释放激 素受体、KiSS-I受体或促肾上腺皮质素释放因子受体1。
11.根据权利要求8-10任一项所述的多肽，其中所述TM选自由以下组成的组生长激 素释放激素(GHRH)肽、瘦蛋白肽、生长素释放肽、促生长素抑制素(SST)肽、皮质抑素肽、胰 岛素样生长因子(IGF)肽、转化生长因子(TGF)肽、VIP-胰高血糖素-GRF-促胰液素超家族 肽、PACAP肽、血管活性肠肽(VIP)、食欲肽、白介素肽、神经生长因子(NGF)肽、血管内皮生 长因子(VEGF)肽、甲状腺激素肽、雌激素肽、ErbB肽、表皮生长因子(EGF)肽、EGF和TGF-α 嵌合肽、双调蛋白肽、β细胞调节素肽、印igen肽、表皮调节素肽、肝素结合EGF(HB-EGF) 肽、铃蟾肽、硬骨鱼紧张肽、黑色素浓缩激素(MCH)肽、促乳素释放肽、Kissp印tin-ΙΟ肽、 Kisspeptin-54肽、促肾上腺皮质素释放激素肽、尿皮质素1肽或尿皮质素2肽。
12.根据权利要求8-11任一项所述的多肽，其中所述非细胞毒性蛋白酶包括梭菌神经 毒素内肽酶。
13.根据权利要求8-11任一项所述的多肽，其中所述非细胞毒性蛋白酶包括IgA蛋白酶。
14.根据权利要求8-13任一项所述的多肽，其中所述易位结构域包括梭菌神经毒素易 位结构域。
15.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID N0:8、9、10、ll、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87 的任一个具有至少 90-92%、或至少 95-97%、或至少98-99%序列同一性的氨基酸序列。
16.一种核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求8-15任一项的多肽。
17.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求8的多肽，其中所述核酸包括与SEQ ID NO 7和32的任一个具有至少90-94%、或至少95-97%、或至少98-99%序列同一性的核酸序 列。
18.—种抑制患者癌症的方法，包括向患者施用有效量的根据权利要求8-15任一项的 多肽或根据权利要求16或17的核酸。
19.根据权利要求1-7任一项的应用或者根据权利要求18的方法，用于抑制选自由以 下组成的组的一种或多种癌症前列腺癌、肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌。
全文摘要
本发明涉及用于抑制或治疗癌症的方法，特别涉及用于抑制或治疗结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和/或肺癌的一种或多种的方法。该疗法采用靶向于生长激素分泌细胞例如靶向于垂体细胞的非细胞毒性蛋白酶。当如此被递送时，所述蛋白酶被内化并抑制生长激素从所述细胞的分泌/传输。本发明还涉及用于所述方法的多肽和核酸。
文档编号A61K38/00GK102083451SQ200980122092
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月12日
发明者K·福斯特, P·马科斯, 弗雷德里克·马代克, 菲尔·莱卡纳 申请人:赛恩泰新公司