专利名称：肿瘤治疗的制作方法
背景技术：
自由基已显示可对肿瘤细胞的脂质、蛋白质及核酸造成氧化伤害进而抑制肿瘤的生长。在临床上，先传送一光敏感物质至肿瘤位置，再以放射线活化该物质而产生自由基，由此可抑制肿瘤的生长。在已知的光敏感物质中，光福林-II(photofrin II)最近已被美国食品药物管制局认可。然而光福林-II的制造方法非常繁复。
福乐林(Fullerenes)为封闭式笼型结构的结合链烯烃。当光激发时，该结构可以将氧分子转型为单氧及相关自由基，例如过氧自由基，如O2·-。然而，福乐林具有低生物取得性，且在试验其作为如治疗肿瘤的光敏感物质的效力前必须先经化学修饰。
发明概要本发明系有关于一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包括造成肿瘤细胞的死亡。该方法包括于肿瘤位置投与一所需物质，其中含有一光敏感产自由基福乐林化合物，以及接着暴露该肿瘤位置于放射线下。该化合物具有一福乐林核心，其中直接或经一C1-50交联剂而被1-30个离子基团取代。将该化合物以足够抑制肿瘤细胞生长的剂量投与于肿瘤位置。
「福乐林核心」系指如C60、C61、C62、C63、C64、C65、C70、C76、C78、C82、C84、C92、La@C60、La@C74、La@C82、Ho@C60、Ho@C74、Ho@C82、Gd@C60、Gd@C74、Gd@C84、Er@C60、Er@C74、Er@C82等等。其中，以C60为佳。
前述离子基团系指在生理酸碱值的水溶液中为离子化者。这些离子基团为如磺酸根、硫酸根、碳酸根、磷酸根、正磷酸根以及氨基。福乐林核心可以被如2-16或4-10个磺酸基团取代而形成本发明方法的福乐林化合物。
离子基团可以直接连接至福乐林核心(例如C60)以形成一福乐林化合物，例如C60(NH3+)12。或者也可以经一C1-50交联剂(例如C2-16或C3-8交联剂)而连接至福乐林核心。这些交联剂为如烷基(例如-C2H4-)、芳香基(例如-C6H4-)、酯(例如-C3H6CO-O-)、醚(例如-C3H6OC3H6-)、硫醚(如-C7H14SC5H10-)、尿烷(如-C4H8NH-CO-O-)、尿素(如-NH-CO-NH-)、醯胺(如-CO-NH-)、酐(如-CO-O-CO-)、胺(如NHC2H4-)以及酮醚(如-CO-C3H6-O-C5H10-)。福乐林核心也可以被如6个硫酸基团取代，每一个经由一-C4H8-交联剂而形成C60(-C4H8-SO3-)6。
前述福乐林化合物亦包括其药学上可接受盐。这些盐可以形成一阴性离子基团(例如磺酸根或碳酸根)或其阳性的对应离子基团。适当的对应基团包括，但不限于，钠、钾、钙、或镁。同样地，阳性离子基团(如氨)可以形成一具有阴离子(如氯、溴、或碘)的盐。可用于本发明方法的盐有例如六(硫代丁基)福乐林化钠(hexa(sulfobutyl)fullerene sodium)。
用于本发明方法的福乐林化合物是在用于肿瘤治疗前先调制成一药学组合物。因此本发明的范围亦包含具有一福乐林化合物与一医药学上可接受载体的组合物以用于治疗肿瘤。载体为如包括水、胶状二氧化硅、硬脂酸镁、脂质、脂蛋白、血蛋白、或纤维素。本发明亦有关于采用前述福乐林化合物用以治疗一肿瘤的的药物制程。
前述福乐林化合物作为一药学组合物的活性成分，是在肿瘤位置暴露于放射线照射前，先投与于试验者的肿瘤位置。经过放射线照射，福乐林化合物转变附近的氧分子成为高活性氧自由基，包括过氧自由基，而转而攻击肿瘤细胞并抑制其生长。
本发明将在下文详细说明。本发明的其他特征、目的、及优点将会详细说明如下文及权利要求的范围。
本发明的最佳实施样态本发明系有关于以一福乐林化合物作为光敏感物质，以抑制良性或恶性肿瘤细胞的生长。该福乐林化合物系为一福乐林核心被1-30个离子基团取代，以经由一C1-50交联剂来交联为佳。当被光激发时，福乐林化合物转化氧分子为单独的氧以及相关自由基，例如过氧自由基。自由基接着会对附近肿瘤细胞造成损伤，因而抑制肿瘤细胞的生长(即减少肿瘤细胞的数目与大小)。该放射线源可以为雷射或是其他光，例如萤光或X射线。放射线可以具有400-1000nm的波长以及10-300J/cm2的能量密度，且放射线照射时间可以为10-200分钟。
本发明方法所采用的福乐林化合物包括美国专利USP 5,994,410所记载的化合物。该化合物的合成方法可依照习知技术。例如，一磺酸-烷基-福乐林化合物可以由一福乐林与一强路易士碱(例如基金属)反应以产生一阴离子福乐林中间产物。该中间产物再与一环磺内脂反应产生磺烷基福乐林。请参考Chiang等人Chem.Lett.1998，465。
一氨基福乐林可以直接将一福乐林与一胺于环境温度反应两天而得。请参考Hirsch等人，Angew.Chem.In.t Ed.Engl.1991，30，1309。
一碳酸端福乐林化合物可以由一阴离子福乐林中间产物，经基金属，与丁二酸酐反应而得，或是将一碳酸端烷基胺或芳基胺与C60(NO2)6于碱，如三乙基胺，的存在下，于40℃反应5-16小时而得。请参考Chiang等人的J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1999，31。
一磷酸端福乐林化合物可以由一磷酸端烷基胺或芳基胺与C60(NO2)6于碱，如三乙基胺，的存在下，于40℃反应5-16小时而得。请参考Chiang等人的J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1999，31。
一硫酸端福乐林化合物可以由一硫酸端烷基胺或基胺与C60(NO2)6于碱，如三乙基胺，的存在下，于40℃反应5-16小时而得。请参考Chiang等人的J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1999，31。
在投与需治疗肿瘤的个体前，取适当剂量的适合治疗肿瘤的福乐林化合物或其盐与一药学上可接受载体调制形成一药学组合物。「适当剂量」是指化合物的剂量足以在需治疗个体造成治疗效果。对于动物及人体的剂量关系(基于每平方公尺体表面积投与的毫克量)可参考Freireich等人的论文Cancer Chemther.Rep.，1966，50，219。体表面积可由病患的身高与体重估计而得。请参考Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，N.Y.，1970，537。由习知技术可知，有效剂量也依投与路径、赋形剂用法、肿瘤与皮肤表面的距离、放射线来源、以及最适合并用治疗方法，包括采用其他抗癌化合物，而有所不同。
药学组合物可以经由注射投与，例如局部注射、腹腔注射、以及静脉注射。注射剂量形式可以包括如一活性化合物溶解于磷酸缓冲液(PBS)，或是与其他药学上可接受载体混合。该药学组合剂也可以包含溶解剂，例如环糊精(cyclodextrins)、或是其他习知的溶解剂。
预先评估一福乐林化合物抑制肿瘤细胞生长可以采用一体外抑制试验(in vitro inhibition assay)。例如，一福乐林化合物溶液可以加入一预先培养的细胞悬浮液。接着，细胞悬浮液以萤光激发，再进行进一步培养。加入一3-(4，5-二甲基三唑-2基)-2，5-二苯基-四唑化溴溶液至细胞悬浮液以与粒线体去氢形成福马啶(formazon)，再以二甲基亚(DMSO)萃取。二甲基亚萃取液立刻用于光学测量以测得福马啶的含量，该含量与去氢或活细胞相对数目有相关。
预先评估过的福乐林化合物可进一步以体外抑制试验测试而确定其效力。请参考Chiang等人的论文Proc.Electrochem.Soc.1999，99-12，238-249。例如，一具有肿瘤的小鼠可以先投与一适当的福乐林化合物PBS溶液至肿瘤位置附近。接着将小鼠置于暗处以待福乐林化合物经循环至肿瘤位置。除去肿瘤位置上及其附近的毛发，对该肿瘤位置照射雷射光束或其他光源。放射线照射后，小鼠肿瘤生长将于不同时间间隔进行测试。以测量小鼠平均体重与肿瘤体积来评估抑制效果。小鼠以二氧化碳窒息的方法安乐死。再测量被测试小鼠最后的体重与器官重。取血液样品进行生化学及血液学分析。所有数据将可用于评估该福乐林化合物对治疗肿瘤的效力。
任何熟习于此技艺人士基于本说明书的方法，将可应用本发明并发展的。所有提及的文献以其整体一并在此作为参考。以下所说明的具体实施例中的合成一化合物及其生物试验可用于本发明，然实施例仅是作为举例说明，而非用以限定本发明的范畴。
实施例1(1)合成六(硫代丁基)福乐林(FC4S)首先，将一基钠的二甲氧基乙烷(DME)溶液以丁二酸滴定。接着将C60以基钠的DME溶液(10.0当量)于25℃处理以产生一六阴离子福乐林中间产物。此中间产物接着与过剩的1，4-丁烷磺内脂(15.0当量)反应以产生FC4S。过滤纯化及由水溶液重复酒精沈淀后，得到80-85％的化合物。FC4S的HPLC色层分析采用相反相的C-18管柱以及H2O作为洗涤液时，可以显示一单波峰。FC4S的红外线光谱显示一广吸收带，且其中央为3444cm-1(因有一水合分子)，与量个强吸收带，其中央分别为1178与1050cm-1，对应于一C-SO2-O交联剂的磺酸展开带。CF4S的1H NMR光谱于D2O显示两个广波峰，其中央分别为δ1.92与3.10，分别对应于-CH2-C与-CH2S质子的化学位移。
以4N HCl酸化FC4S提供对应的六磺酸，C60(CH2CH2CH2CH2SO3H)6。以阴离子矩阵协助雷射吸附离子化(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)质谱仪可于m/z 1542测得C60(CH2CH2CH2CH2SO3H)6的离子。在两族群的离子段片伴随着一群最大密度为m/z 1405与1269的波峰，分别对应于C60(CH2CH2CH2CH2SO3H)5与C60(CH2CH2CH2CH2SO3H)4的质量。
由FC4S产生过氧自由基的能力由下述步骤达成不同浓度(0-100μM)的FC4S水溶液(每次1.0毫升)分别加入含铁细胞色素c(ferricytochrome c)的PBS(1.0ml，lOOμM)。每一个混合物再加入一24孔盘的各孔中，并暴露于萤光(27瓦特)0-90分钟。试验盘盖与光源的距离为5-6公分。铁细胞色素c还原为亚铁细胞色素c的变化系以光学测量评估。550nm吸收光的增加是对应于亚铁细胞色素c量的增加。亚铁细胞色素c的产生代表FC4S经过放射线照射会将分子氧转化成过氧自由基，且电子由过氧自由基转移至铁细胞色素c，而将铁细胞色素c还原成亚铁细胞色素c。观察显示当FC4S剂量与放射线照射时间增加时，会有更多过氧自由基产生。
(3)基于肿瘤细胞的活性进行体外放射线照射诱发FC4S的细胞毒性试验由下述方法准备肿瘤细胞纤维肉瘤细胞(CCCRC 60037)与肉瘤细胞180(由台湾，中山医学与牙医学院，生化研究所取得)以含有L-榖氨酸与酚红、10％胎牛血清、以及抗生素(100单位/毫升的盘尼西林G与100微克/毫升的链霉素)的α修饰伊果培养基(α-modified eagle medium，以下称α-MEM)维持与培养。细胞培养于95％潮湿空气、含有5％CO2的暗处。以胰蛋白 EDTA处理收集后，细胞以α-MEM悬浮使其浓度为1×104细胞/毫升。
得到的细胞悬浮液(每孔500μl)放入一24孔盘的各孔中并预先于37℃培养24小时。不同浓度(0-20μM)的FC4S(每孔500μl)加入各孔。每一细胞悬浮液以萤光(27瓦特)照射0-60分钟。试验盘盖与光源相距5-6公分。放射线照射后，细胞再培养48小时。之后加入3-(4，5-二甲基三唑-2-基)-2，5-二苯基一四唑化嗅(MTT，0.5％in PBS，每孔100μl)至每孔的细胞悬浮液中以与活细胞的粒线体去氢 进行反应以产生福马啶。将悬浮培养基去除后，细胞悬浮液再于37℃培养3小时。之后以二甲基亚砜(DMSO，每孔1.0ml)萃取福马啶。DMSO萃取液立刻进行光学测量。540nm吸收光直接对应于福马啶的含量，因此亦对应于活细胞相对数目(细胞活性)或去氢酶量。结果显示细胞活性对应于FC4S剂量与放射线照射时间的增加而减少。
(4)基于肿瘤细胞的型态学进行体外放射线诱发FC4S的细胞毒性试验纤维肉瘤细胞(CCRC 60037)悬浮液(4.0ml)培养于一6孔盘内的盖玻片上。细胞悬浮液于不同浓度(即2.5-5.0μM)的FC4S中，以萤光(27瓦特)照射40分钟。再培养48小时后，以新鲜制备的戊二醛(glutaraldehyde)的PBS溶液(2.5％)于4℃固定细胞2小时。固定后以PBS清洗盖玻片三次。细胞再以甲醇穿孔(permeabilized)7分钟。以气流干燥而移除所有液体后，盖玻片上的纤维肉瘤细胞以Giemsa染剂溶液(20倍稀释)染色60分钟，并转移至载玻片，其中每片含有10μl的载置剂(mounting media)，以供光学显微镜(Zeiss)检视。可观察到玻片上被破坏细胞构造与每个细胞的破裂细胞膜。结果显示过度放射处理诱发FC4S对纤维肉瘤细胞的细胞毒性为高于2.5μM的剂量。于5.0μM的剂量，所有细胞被破坏成碎片状的固体残渣。
(5)FC4S的活体内放射线治疗研究放射线治疗试验是以雄性ICR小鼠(Charles River Japan origin CrlCd-l(ICR)BR)进行，采用8周大且体重约37±0.8克的小鼠。小鼠住于聚碳酸盐、鞋盒大小的笼子，且铺以硬木(5只小鼠/笼)，并控制于无病源环境下(温度为22±1℃、相对湿度为55±15％，且光/暗周期12/12小时)，而且小鼠可以自由取食实验室用鼠粮(5K55，Purina Mills，Inc.，St.Louis，MO)与水。
其他小鼠腹腔具有鼠肉瘤180细胞。每只小鼠的腹腔表皮以腹腔注射注入1×107的肿瘤细胞(约0.1-0.15ml的腹水)以诱发皮下肿瘤。让肿瘤细胞于植入处增殖5-7天。五十只小鼠，每只具有一约10±2mm的皮下肿瘤，分成五组，即1.肿瘤对照组(无治疗)；2.腹腔注射FC4S(15mg/kg)但无雷射照射处理；3.腹腔注射FC4S(5.0mg/kg)之后以雷射照射处理；4.腹腔注射FC4S(10mg/kg)之后以雷射照射处理；5.腹腔注射FC4S(15mg/kg)之后以雷射照射处理。第6组为无肿瘤对照组。
于肿瘤位置2.0公分以外处腹腔注射溶解于PBS的FC4S(每只小鼠体重5-15mg/kg)后，小鼠置于暗室中24小时。小鼠以艾福定(avertine，0.3ml/head)麻醉后除去肿瘤上及附近的毛发。接着将肿瘤位置分别以氩离子雷射光束(Spectra Physics，Model 168)于514.5nm的波长下照射0-60分钟。光束是经由一石英纤维与一环绕照度的范围输出为集中于7-8mm直径的总光量调整为100J/cm2者传送至各实验组。
处理过后，每隔5天检测小鼠，共30天。放射线照射治疗效果以测量每只小鼠的体重与肿瘤体积来评估。30天后，小鼠以二氧化碳窒息的方法安乐死。测量最终体重与器官重，包括肝、肾、脾、心脏、以及肿瘤。抽取血液样本，并以日立7050自动分析仪与Serono系统9000分别进行生化学与血液学分析。
以放射线照射治疗的小鼠(第3、4与5组)显示体生长率接近无肿瘤对照组(第6组)。未治疗其肿瘤的对照小鼠(第1组)比起第2、3、4、5与6组具有较低的体生长率。由放射线治疗小鼠(第3、4与5组)分离的肿瘤的平均重量随着FC4S剂量的增加而降低。当FC4S剂量为5.0mg/kg(第3组)时，肿瘤重量在第30天为对照组(第1组)的20％。当剂量为10与15mg/kg(第4与5组)时，平均肿瘤重量为对照组(第1组)的10％。这些结果显示以FC4S的放射线治疗对于减低纤维肉瘤细胞活性具有高效力。有趣的是，FC4S单独(第2组)可以抑制肿瘤生长约23％。
分析血液样本发现治疗组与未治疗组的小鼠的生物活性不同。例如，放射线治疗后，第3、4与5组的小鼠显示天门冬酸转胺酶(asparateaminotransferase)、离胺酸转胺酶(alanine aminotransferase)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)具有比第1组高的活性。第30天时的乳酸去氢酶(lactatedehydrogenase)活性在第3、4与5组亦高于在第1组。这些结果暗示肿瘤细胞膜损伤与酵素蛋白流失。胆固醇与葡萄糖的数值在第3、4与5组的小鼠明显高于第1组，代表第1组小鼠的肿瘤细胞持续地增殖而增强这些物质的累积。
未治疗肿瘤细胞(第1组)如预期的以高速率继续增殖。不论是在实验的任何阶段，第3、4与5组的肿瘤细胞生长率都远低于第1组。在第30天时，第3、4与5组的小鼠的肿瘤平均大小为第1组的17％。
实施例2于ICR小鼠体内以FC4S进行放射线治疗的程序与实施例1相同，除了放射线改采波长633nm的雷射与投与方式改采静脉注射。
小鼠分成5组(1)肿瘤对照组(无治疗)；(2)腹腔注射FC4S(15mg/kg)后以波长514.5nm的雷射照射处理；(3)腹腔注射FC4S(15mg/kg)之后以波长633nm的雷射照射处理；(4)静脉(尾根)注射FC4S(15mg/kg)之后以波长514.5nm的雷射照射处理；以及(5)静脉(尾根)注射FC4S(15mg/kg)之后以波长633nm的雷射照射处理。
这些小鼠的肿瘤生长将于放射线照射后以不同时间间隔测量(即5、10、15、20、25与30天)。结果显示FC4S对于肿瘤生长的抑制在高能的波长514.5nm雷射较低能的波长633nm雷射为有效。腹腔注射FC4S只比静脉注射有轻微地较佳的抑制效果。肿瘤细胞在腹腔注射15mg/kg的剂量时可以完全清除。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习于此技艺人士，在不脱离本发明的精神与范畴内，仍可做些润饰与更动。例如，本发明方法中的福乐林化合物包括，除了离子基团取代者外，更有非离子基团取代者(例如，氢氧根)。因此，本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括给所需患者肿瘤位置施用足够剂量抑制肿瘤细胞的化合物，然后对肿瘤位置进行辐射，其中该化合物为福乐林核心由1-30个离子基团，任选地经C1-50交联剂而被取代。
2.如权利要求第1项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由1-30个离子基团，经C1-30交联剂而被取代。
3.如权利要求第2项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由2-20个离子基团取代。
4.如权利要求第2项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂独立地为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、酰胺、酐、胺或酮醚。
5.如权利要求第3项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂分别为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、酰胺、酐、胺或酮醚。
6.如权利要求第5项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂为烷基，且每一离子基团分别为磺酸根、硫酸根、碳酸根、磷酸根、正磷酸根或氨基。
7.如权利要求第6项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由6个磺酸基团取代。
8.如权利要求第1项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由1-30个离子基团，经一C2-16的交联剂而被取代。
9.如权利要求第8项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由2-20个离子基团取代。
10.如权利要求第8项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂分别为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、醯胺、酐、胺或酮醚。
11.如权利要求第9项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂分别为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、醯胺、酐、胺或酮醚。
12.如权利要求第11项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂为烷基，且每一离子基团分别为磺酸根、硫酸根、碳酸根、磷酸根、正磷酸根或氨基。
13.如权利要求第12项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心以6个磺酸基团取代。
14.如权利要求第1项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由1-30个离子基团，经一C3-8的交联剂而被取代。
15.如权利要求第14项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由2-20个离子基团取代。
16.如权利要求第14项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂分别为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、醯胺、酐、胺或酮醚。
17.如权利要求第15项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂分别为烷基、芳香基、酯、醚、硫醚、尿烷、尿素、醯胺、酐、胺或酮醚。
18.如权利要求第17项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂为烷基，且每一离子基团分别为磺酸根、硫酸根、碳酸根、磷酸根、正磷酸根或氨基。
19.如权利要求第18项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心以6个磺酸基团取代。
20.如权利要求第19项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中每一交联剂为C4烷基。
21.如权利要求第1项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由2-20个离子基团，任选地适当地经一C1-50的交联剂而被取代。
22.如权利要求第21项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由4-10个离子基团，任选地经一C1-50的交联剂而被取代。
23.如权利要求第22项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心由4-10个离子基团，经一C2-16的交联剂而被取代。
24.如权利要求第22项所述的抑制肿瘤细胞生长的方法，其中福乐林核心以4-10个离子基团，经一C3-8的交联剂而被取代。
全文摘要
一种抑制肿瘤细胞生长的方法。包括投与一个体的肿瘤位置一足够剂量抑制肿瘤细胞生长的化合物，以及接着暴露该肿瘤位置于放射线照射。该化合物为一福乐林核心由1－30个离子基团，适当地经C
文档编号A61K31/74GK1462197SQ01816096
公开日2003年12月17日 申请日期2001年9月18日 优先权日2000年9月21日
发明者江隆永, 余祺 申请人:江隆永