一种可异体移植的嵌合抗原受体t细胞及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，严重危害人类健康。因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。目前，传统的三大主要治疗手段即手术治疗、化疗、放疗这三大主要治疗手段虽然是全球肿瘤治疗的基本手段方法，然而其治疗效果有限。
[0003]其中传统手术切除是肿瘤行业中最基本、最重要的肿瘤治疗手段。放疗是用放射线照射癌组织，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，是大多数肿瘤的辅助疗法，然而由于放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，多次放疗后，患者会产生一系列毒副作用和反应，对中晚期肿瘤患者，放疗作用有限。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖的一种治疗方式，但对大多数肿瘤的治疗的有效性较低。并且，化疗与放疗一样，其在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫细胞一同杀灭，导致病患者免疫能力和身体机能下降，生活质量降低。
[0004]目前，免疫肿瘤疗法正在全世界兴起，为肿瘤患者带来了曙光。而免疫疗法中最有效果的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells , CART)疗法。其基本原理是利用基因工程改造从肿瘤患者自身身体中分离培养的T细胞，即通过逆转录病毒和慢病毒载体给T细胞加入一个能特异识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体。然后将这些基因工程改造的T细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力，从而达到治疗肿瘤的效果。
[0005]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分组成，位于细胞外的抗原结合区scFv，跨膜区以及胞内信号转导结构域组成。其中，根据胞内信号转导结构域的研究发展，CAR可以分为第一代CAR、第二代CAR以及第三代CAR。第一代CAR仅含有一个信号单元，大多来自于CD3G，对肿瘤的杀伤效果很不理想。第二代CAR是在第一代CAR的胞内信号转导结构域基础之上增加了一个共刺激结构域，比如⑶28、0X40或者4-1BB，能够提高CART细胞杀伤肿瘤的疗效，但是效果还不能令人满意。目前，大多数CAR都是第三代CAR，其主要是在在第二代CAR的胞内结构域基础之上再增加一个共刺激结构域，因此具有三个个共刺激结构域，研究发现这样极大地提高了CART细胞的扩增倍数以及T细胞在体内存活的时间，达到治疗肿瘤的效果。
[0006]虽然CART技术在治疗肿瘤上面显示出了巨大的优势和效果，然而，由于CART治疗肿瘤非常的个体化，即必须要分离肿瘤患者自身的T细胞，这在实际应用之中具有相当大的困难，也存在许多的不足。首先是绝大多数肿瘤患者采用CART治疗肿瘤时都是在其他肿瘤治疗方法失去效果的情况下进行的，在经过手术治疗，尤其是在经过化疗和放疗之后，患者的免疫系统遭到毁灭性的破坏，其自身的T细胞数量极其有限，这会造成分离T细胞困难。第二，经过放化疗至后，患者自身的T细胞遭受化学药物及射线的破坏，T细胞的活性非常低，尤其是细胞增殖能力非常低，分泌肿瘤杀伤因子的能力也大幅下降，进而不能够有效杀伤肿瘤细胞。第三，CART治疗前分离肿瘤患者自身的T细胞，在分离细胞的同时，无法完全避免分离的T细胞里面有少量的肿瘤细胞也混杂在分离的细胞里面，即便经过大规模的体外扩增，由于放化疗之后的肿瘤细胞活性更高，因此获得的T细胞里面也具有大量的肿瘤细胞，在输入患者体内之后，这些肿瘤细胞也会再次输入患者体内，为患者造成了致命打击。第四，经过放化疗的肿瘤患者身体极其脆弱，肿瘤随时都可能复发，留给患者的时间非常不足，往往在经过极其短的时间，甚至一两周之内就会复发，然而，个体化分离患者的T细胞、然后在经过基因改造成CART细胞，其后再大规模体外培养、最后输入患者，这段时间会经历非常长的时间，往往会需要几个月的时间，而这段准备CART的时间之内，患者可能已经失去生命O
[0007]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0008]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，旨在解决现有T细胞分离困难、不能够有效杀伤肿瘤细胞及混杂有肿瘤细胞的问题。
[0009]本发明的技术方案如下:
一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其中，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。
[0010]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。
[0011]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述特定基因为TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为:在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。
[0012]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述基因定点敲除技术为CRISPR/Cas9。
[0013]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
[0014]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
[0015]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种o
[0016]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。
[0017]所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列。
[0018]—种如上任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其中，包括步骤: A、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞；
B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
[0019]有益效果:本发明异体来源的T细胞经过基因工程改造，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。然后将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的嵌合抗原受体T细胞，以便于肿瘤治疗。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1中T细胞α链恒定区TRAC的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
[0021]图2为本发明实施例2中T细胞β链恒定区域一TCRBCl的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
[0022]图3为本发明实施例3中T细胞β链恒定区域二 TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
[0023]图4为本发明实施例4中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域一 TCRBCl的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
[0024]图5为本发明实施例5中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域二 TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
[0025]图6为本发明实施例6中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域一 TCRBCGPM^g定区域二 TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
【具体实施方式】
[0026]本发明提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]本发明提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其中，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。其中，本发明T细胞的来源包括健康成年人采血分离获取或者患者自身血液分离提取或者其他符合相应条件的人的血液提取分离。本发明异体来源的T细胞经过基因工程改造，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。然后将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的嵌合抗原受体T细胞，以便于肿瘤治疗。
[0028]具体地，本发明所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。其中，所述特定基因可以为但不限于TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为:在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。
[0029]具体地，本发明所述TCR的α链的恒定区域为TRAC，TCR的β链的恒定区域具有两个区域，分别为TCRBCl和TCRBC2。
[0030]具体地，所述基因定点敲除技术优选为CRISPR/Cas9(Clustered regularlyinterspaced shortpalindromic repeats (CRISPR) /CRISPR-associated systems(Cas)，CRISPR/Cas9)技术。CRISPR/Cas9技术是最近发展起来的基因定点敲除技术之一，之前基因定点敲除技术还有锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease , ZFN)技术以及TALEN(Transcript1n activator-like effector nucleases, TALEN)技术。而CRISPR/Cas9技术相较于ZFN技术和TALEN技术而言，其操作更加简单，同时脱靶效应也小于另两种技术，因此，在最近获得了巨大的关注和发展。Cas9酶含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA这两种结合成复合物，然后再通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而