对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，而最终利用细胞自身的修复机制造成剪切的DNA部位增加或者缺失DNA序列，进而达到敲除基因表达的目的。
[0031]而通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到SgRNA(single guide RNA, sgRNA)。最终再通过将表达sgRNA的序列与表达Cas9的序列相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行敲除。
[0032]作为本发明优选的实施例，本发明基因改造可以为:T细胞的TCR的α及β两条链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术(如CRISPR/Cas9技术)同时敲除，使T细胞的TCR不能够具有活性。T细胞的TCR的α及β两条链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术同时敲除，其中包括采用基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术单独敲除α的恒定区TRAC或者β的恒定区TCRBCl或者β的恒定区TCRBC2，或者组合敲除α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBCl，或者α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBC2，或者α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBCl以及TCRBC2。
[0033]本发明中，所述嵌合抗原受体(即第三代CAR)由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。其中，scFv抗原结合序列包括针对不同肿瘤的序列，包括CD19(序列见 Seq-CD19_scFv)、CD30(序列见 Seq-CD30_scFv)、CD33(序列见 Seq-CD33_scFv)、CEA(序列见Seq-CEA-scFv)、cMet(序列见Seq-cMet-scFv)、EGFRvI II (序列见Seq-EGFRv II1-scFv)、FAP (序列见 Seq-FAP-scFv)、Her 2(序列见Seq-Her 2-scFv)、GD2(序列见Seq_GD2_scFv)、PSMA(序列见Seq-PSMA-scFv)、]^801:1161;[11(序列见369-]\16 801:1161;[11-80卩￥)和从^]\1(序列见Seq-NCAM-scFv)等中的一种。所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段铰链序列(Hinge序列)。所述Hinge序列为⑶8的胞外铰链结构。优选地，所述跨膜序列为⑶8。而经过实验验证简化了操作，采用CD8分子的胞外铰链结构将跨膜序列与scFv抗原结合序列直接相连接。换句话说，本发明跨膜序列包括CD8的铰链序列及跨膜序列(序列见Seq-CD8_hinge-trans)。所述胞内信号转导序列包括⑶28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列等。其中，CD28胞内结构域序列见Seq-CD28-endo，4-lBB胞内结构域序列见Seq-4-lBB-endo，0)3ζ胞内结构域序列见Seq-Q)3G-endo。将这些不同的scFv抗原结合序列和CD8铰链序列及跨膜序列、D28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列组合，就可以得到针对不同血液肿瘤比如急性淋巴癌以及实体肿瘤，比如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌等的嵌合抗原受体。
[0034]进一步地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。优选地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
[0035]本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前CART细胞技术只能够通过分离自身的T细胞，然后结合CAR技术来治疗肿瘤的不足，比如自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。本发明能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
[0036]基于上述嵌合抗原受体T细胞，本发明还提供一种如上任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其包括步骤:
一种如权利要求1-9任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤:
Α、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞；
B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
[0037]本发明主要包括以下几个部分，一个是异体来源的T细胞，而这种T细胞经过基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术改造，将T细胞受体的两条链即α及β两条链分别或者同时敲除，从而使TCR失活，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。二是将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的CART，以便于肿瘤治疗。
[0038]下面通过实施例对本发明进行详细说明。
[0039]实施例1
异体移植TRAC失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC。针对TRAC的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子I。根据TRAC外显子序列，尤其是外显子I的序列，设计表达sgRNA(single guideRNA，sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EXl-1、Seq-TRAC-EXl-2、Seq-TRAC-EXl-3、Seq-TRAC-EXl-4、Seq-TRAC-EXl-5。
[0040]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互补序列(见序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0041 ] 进一步地，还需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0042]进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为:按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后将8μ1的Seq-TRAC-EXl-1-BamH Ι、8μ1 ^Seq-TRAC-EXl-1-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均匀，然后把EP管放在95°C水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
[0043]然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为:采用BamH I和EcoR I对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶buffer溶液，之后在45°C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0044]之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为:将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42 0C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37 °C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0045]将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为:将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液(50微升超纯水和50微升脂质体混合)中，在室温放置15分钟。之后加入到I个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
[0046]质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRc^的抗体ant1-TCRc^-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为:将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入ImL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗体，避光孵育30分钟;孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入ImL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
[0047]之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为:在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞(I X 17数量)，然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8(铰链及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
[0048]病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
[0049]实施例2
异体移植TCRBCl失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的β链的恒定区编码基因TCRBC1。针对TCRBCl的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TCRBCl的外显子I。根据TCRBCl外显子序列，尤其是外显