一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法 与应用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体最大的消化器官，担负着繁重而复杂的任务，除物质代谢外，还具有内 分泌和免疫调节等功能。肝脏所担负的物质代谢功能也决定了它是最易遭受外界因素损伤 的器官之一，许多毒害物质的靶器官都是肝脏。各种原因如病毒、寄生虫感染、乙醇、药物或 化学毒害以及免疫功能紊乱等均能引起急、慢性肝损伤，长期或反复作用还可能导致肝硬 化甚至发展到肝衰竭、终末期肝病。肝病一旦发展到终末期，常规治疗仅能缓解患者的临床 症状，且疗效不佳。肝移植被认为是治疗终末期肝病的唯一有效手段，但由于供肝严重缺 乏、术后免疫抑制剂长期使用、围手术期风险以及高额费用等问题，限制了肝移植的广泛应 用，每年有大量的肝病患者因肝功能衰竭而死亡。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期的中胚层和外 胚层，属于多能干细胞。MSCs最初在骨髓中发现，因其具有自我复制、多向分化潜能、造血支 持和促进干细胞植入、免疫调控、异体移植不易发生免疫排斥等特点而日益受到人们的关 注。如MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神 经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。因其处于未分化状态，增殖能力活跃，可以在体外大量 培养、扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于 衰老和病变引起的组织器官损伤修复。国内外已有学者将不同来源的MSCs应用于肝病动物 模型、临床前及临床肝病的治疗，取得了一些有意义的发现和可喜的治疗效果。研究显示， MSCs在体外可被诱导分化成具有肝细胞的形态、表型和功能特征的细胞，此类细胞能表达 白蛋白（albumin)、甲胎蛋白（alpha-fetal protein, AFP)、细胞角蛋白（cytokeratins， CK) CK8、CK18等肝系细胞和胆管细胞的特异性标志物;大鼠 MSCs移植到体内后能转分化为 肝细胞样细胞，表达肝细胞特异性标志物白蛋白；动物实验和临床研究结果显示，自体骨髓 来源MSCs移植能够显著改善肝功能，减轻肝纤维化、肝腹水等症状。
[0004] 但MSCs移植治疗肝病仅处于理论阶段，在临床应用中仍存在许多亟待解决的问 题。虽然大多数实验表明MSCs对肝损伤有修复作用，但疗效并不稳定，个体差异较大;更有 研究显示MSCs移植对肝功能、组织结构的修复无作用，甚至有负面的影响。究其原因，一方 面，移植的MSCs只有定植/归巢到病变部位，才能有效地发挥治疗和修复作用，但体内研究 发现只有少量的移植细胞富集到了损伤或病变部位;其次，移植的MSCs定植到肝损伤部位， 有的分化为肝巨噬细胞（kupffer cell)，而肝巨噬细胞对于肝星形细胞（hepatic stellate cell)的活化、增殖、迀移、存活等有促进作用，不利于炎症和纤维化的修复;有的 召集肌成纤维细胞(myofibroblast)而促进其分泌胶原产生纤维化;有的可以转分化为功 能性的肝星形细胞和肌成纤维细胞，更多地分泌胶原等细胞外基质，从而进一步增强了肝 脏的纤维化损伤（参见：Zhao Q, Ren H, Zhu D, Han Z. Stem/progenitor cells in liver injury repair and regeneration. Biol Cell, 2009, 101(10): 557-571；Ji J, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem Cells, 2004，22(3): 415-427)。因此， 提高MSCs在病变组织的定植能力，增加归巢至损伤部位的细胞数量将有助于改善移植治 疗效果，并且，改善MSCs移植治疗肝损伤的效果，还需要减轻或避免其促炎、促纤维化等副 作用。从而很有必要对移植的MSCs种子细胞进行修饰和质量控制。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种高效肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法，增加归巢到 病灶部位的MSCs数量，提高间充质干细胞在病灶部位的定植能力；有助于提高MSCs对肝损 伤的靶向性，改善MSCs对肝功能和肝组织结构的治疗和修复效果。
[0006] 本发明采用以下技术方案实现本发明目的： 一种肝损伤靶向间充质干细胞，由间充质干细胞转染或感染核酸制备得到;所述核酸 为miR-26b。优选的所述肝损伤靶向间充质干细胞由间充质干细胞转染或感染核酸后，再经 过碱性成纤维细胞生长因子处理得到。
[0007] 上述技术方案中，所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、 羊水或者胎盘。本发明中的间充质干细胞来源广泛，可以是自体的，也可以是异体的，来源 充足，细胞的增殖、存活、分化、迀移、合成与分泌因子等各方面能力优良，无伦理问题、免疫 原性低，应用前景广阔。
[0008] 本发明还公开了上述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞;或者通过病毒载体将miR-26b转入间 充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞。本发明使MSCs高表达miR-26b的方法，包括利用 各种转染试剂，包括脂质体转染试剂，如Lipofectamine 2000等，转染miR-26b;也包括利用 临床上证实安全有效的病毒，如腺相关病毒AAV、腺病毒Adenovirus、逆转录病毒、慢病毒 等，构建表达miR-26b前体的重组病毒，感染MSCs。转染或感染24~48 h后，RT-qPCR检测 miR-26b显著高表达，得到肝损伤靶向的间充质干细胞。
[0009] 上述技术方案中，通过转染试剂将miR_26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间 充质干细胞的步骤为将miR_26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得 到转染混合液;然后将培养至第4~8代、汇合度达80%~90%的间充质干细胞经roS洗涤，再 加入转染混合液和L-DMEM;然后于37°C培养箱中孵育5~6 h，接着将转染混合液更换为完 全培养基，继续培养36~48 h即可得到肝损伤革E1向间充质干细胞;通过病毒载体将miR-26b 转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将培养至第4~8代、汇合度达 80%~90%的间充质干细胞经PBS洗涤，然后加入表达miR-26b的病毒上清液，37°C感染90 min后，病毒上清液更换为完全培养基继续培养24~48 h即可得到肝损伤靶向间充质干细 胞。比如将50 nM miR-26b mimic与5 μL Lipofectamine 2000以250 μL L-DMEM分别稀释， 室温静置10 min后将二者合并，室温静置30 min。将培养至第4~8代、汇合度达80%~90%的 MSCs PBS洗2次，加入转染混合液和500 μL L-DMEM，37°C培养箱中孵育6 h，更换为完全培 养基，继续培养48 h即可。或者选择培养至第4~8代、汇合度达80%~90%的MSCs，PBS洗2次， 加入表达miR-26b的病毒上清液，37°C感染90 min后，更换为完全培养基继续培养24~48 h，RT_qPCR检测miR_26b显著高表达且细胞状态良好，即可得到肝损伤靶向的间充质干细 胞。
[0010]上述技术方案中，通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成 纤维细胞生长因子(bFGF)处理得到肝损伤靶向间充质干细胞;或者通过病毒载体将miR-26b转