利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子I及TCRBCl和TCRBC2的外显子I。根据TRAC及TCRBCl和TCRBC2的外显子序列，尤其是外显子I的序列，设计表达sgRNA(single guide RNA，sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EXl-l、Seq-TRAC-EXl_2、Seq-TRAC-EXl-3、Seq-TRAC-EXl-4、Seq-TRAC-EXl-5，Seq-TCRBCl-EXl-1、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBQ-EX 卜3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBQ-EX 卜5，Seq-TCRBC2_EX1-1、Seq-TCRBC2-EX1-2、Seq_TCRBC2_EXl_3、Seq_TCRBC2_EXl_4、Seq_TCRBC2_EXl_5。
[0094]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互补序列(见序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0095]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向互补序列(见序列 Seq-TCRBCl-EXl-1-R)。
[0096]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC2_EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC2-EX1-1 的反向互补序列(见序列 Seq-TCRBC2-EXl-l-R)。
[0097]进一步地，还需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0098]进一步地，还需要在Seq-TCRBCl-ΕΠ-Ι和Seq-TCRBCl-En-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I和序列Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I。
[0099]进一步地，还需要在Seq-TCRBC2-E)(l-1和Seq-TCRBC2-E)(l-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH I和序列Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I。
[0100]进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为:按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后将8μ1的Seq-TRAC-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH Ι、8μ1 的Seq-TRAC-EXl-1-R-EcoR I或者Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I或者Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I以及2μ1的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均匀，然后把EP管放在95°C水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
[0101]然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为:采用BamH I和EcoR I对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0102]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0103]将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为:将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液(50微升超纯水和50微升脂质体混合)中，在室温放置15分钟。之后加入到I个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
[0104]质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRc^的抗体ant1-TCRc^-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为:将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入ImL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗体，避光孵育30分钟;孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入ImL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
[0105]之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为:在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞(I X 17数量)，然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8(铰链及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
[0106]病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
[0107]综上所述，本发明提供的一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前CART细胞技术只能够通过分离自身的T细胞，然后结合CAR技术来治疗肿瘤的不足，比如自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。本发明能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
[0108]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。2.根据权利要求1所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。3.根据权利要求2所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述特定基因为TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为:在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。4.根据权利要求2所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述基因定点敲除技术为CRISPR/Cas9。5.根据权利要求1所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。6.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。7.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。8.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。9.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列。10.—种如权利要求1-9任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤: A、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞； B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
【专利摘要】本发明公开一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。且能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
【IPC分类】C12N5/10
【公开号】CN105647871
【申请号】
【发明人】陈光风, 史秀娟, 刘小青
【申请人】苏州佰通生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月27日