子I的序列，设计表达sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TCRBCl-E)(l-l、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBCl-EXl-3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBCl-EXl-5。
[0050]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向互补序列(见序列 Seq-TCRBCl-EXl-l-R)。
[0051 ] 进一步地，还需要在Seq-TCRBCl-ΕΠ-Ι和Seq-TCRBCl-En-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I和序列Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I。
[0052]进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为:按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH20溶解成50 μΜ的溶液；然后将8μ1的Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH Ι、8μ1 的Seq-TCRBQ-EX卜1-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2μ?的ddH20混合均匀，然后把EP管放在95 V水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
[0053]然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为:采用BamH I和EcoR I对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0054]之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为:将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42 0C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37 °C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0055]将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为:将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液(50微升超纯水和50微升脂质体混合)中，在室温放置15分钟。之后加入到I个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
[0056]质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRc^的抗体ant1-TCRc^-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为:将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入ImL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗体，避光孵育30分钟;孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入ImL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
[0057]之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为:在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞(I X 17数量)，然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8(铰链及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
[0058]病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
[0059]实施例3 异体移植TCRBC2失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的β链的恒定区编码基因TCRBC2。针对TCRBC2的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TCRBC2的外显子I。根据TCRBC2外显子序列，尤其是外显子I的序列，设计表达sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TCRBC2-E)(l-l、Seq-TCRBC2-EXl-2、Seq-TCRBC2-EX1-3、Seq_TCRBC2_EXl_4、Seq_TCRBC2_EXl_5。
[0060]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC2_EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC2-EX1-1 的反向互补序列(见序列 Seq-TCRBC2-EXl-l-R)。
[0061 ] 进一步地，还需要在Seq-TCRBC2-E)(l-1和Seq-TCRBC2-E)(l-1-R两端加上双酶切位点BamH I和EcoR I，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH I和序列Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I。
[0062]进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为:按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH20溶解成50 μΜ的溶液；然后将8μ1的Seq-TCRBC2-EX1-1-BamH 1、8μ1 的Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均匀，然后把EP管放在95°C水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
[0063]然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为:采用BamH I和EcoR I对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0064]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37 °C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0065]将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为:将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液(50微升超纯水和50微升脂质体混合)中，在室温放置15分钟。之后加入到I个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
[0066]质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRc^的抗体ant1-TCRc^-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为:将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入ImL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗体，避光孵育30分钟;孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入ImL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
[0067]之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为:在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞(I X 17数量)，然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8(铰链及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
[0068]病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
[0069]实施例4
异体移植TRAC及TCRBCl同时失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC以及β链的TCRBCl基因。针对TRAC及TCRBCl的外显子，分别包括它们的外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子I及TCRBCl的外显子I。根据TRAC及TCRBCl的外显子序列，尤其是外显子I的序列，设计表达sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EX 1-1、Seq-TRAC-EX I _2、Seq-TRAC-EX I _3、Seq-TRAC-EX I _4、Seq-TRAC-EX1-5，Seq-TCRBCl-EXl-1、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBCl-EXl_3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBCl-EXl-5。
[0070]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互补序列(见序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0071]进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向