一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法
【专利摘要】本发明提供一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法：取人的包括表皮和真皮的正常皮肤组织，进行体外消化、分离，获得人的表皮细胞；然后将表皮细胞进行体外扩增培养。本发明方法无需去除脂肪，无需将表皮和真皮进行分离。本发明方法所取皮肤组织为所有人体正常皮肤组织包括带毛发的头皮、带脂肪的组织等。该方法简便、快速、不受时间限制，适合各种皮肤组织如带毛发的头皮、带脂肪的组织等直接分离。可建立较高活力的表皮细胞库，以利临床移植所需。
【专利说明】一种体外分罔培养人的表皮细胞的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种体外进行人表皮细胞的分离、培养的新方法，属于组织细胞学领 域。
【背景技术】
[0002] 表皮细胞是皮肤表层的上皮细胞，主要由角朊细胞、树枝状细胞及麦克尔细胞组 成，其在创伤愈合中起至关重要的作用，尤其是严重烧伤病人表皮细胞的匮乏与其病程长 短、并发症的发生、后期瘢痕的形成均有密切关系，因此应用组织工程技术在体外进行表皮 细胞的分离、培养与保存，直接或与其他材料共同组成复合皮肤应用于临床始终都是烧伤 工作者的一个研究热点。
[0003] 表皮细胞的培养繁殖始于1975年Rheinwald发表的有关文献报道，后又经过一些 学者探索，目前有多种方法如Tr法、Tr-C法、Dispase法、Lp分离法等。表皮细胞分离过程 中常见的问题如：需特殊底物、特殊培养基、易与成纤维细胞混杂生长而难以长期生存、细 胞数量少、活力低、不易贴附等一直是研究者们力求改进和克服的。另外，以目前的技术水 平，并非所有部位的皮肤组织都能成功分离出表皮细胞，对于有毛发的皮肤组织如头皮组 织，目前还没有成功的案例。
[0004] 表皮细胞的培养方法有滋养层培养法、无滋养层无血清培养法以及气液界面培养 法。其中滋养层培养法是最常用的表皮细胞培养法，它常采取鼠胚胎瘤的纤维母细胞株3T3 细胞经Q60照射或丝裂霉素 C处理丧失活力后作为表皮细胞的底物，可促进表皮细胞贴附 及生长，同时可接触性抑制人体成纤维细胞在培养中的增殖。但由于3T3细胞可能产生和 表达对人体不利的代谢产物和抗原，而且培养液中的胎牛血清蛋白可同培养的表皮细胞膜 结合，易导致植皮后的排斥反应，且含血清的培养基易腐败，影响细胞增殖和形态的观察， 此外此法需同时两种培养液，培养液需添加10余种附加成分，个别成分如霍乱毒素、硒离 子、表皮生长因子等价格昂贵且难予购买；3T3细胞灭活程度难以掌握、操作复杂等均不利 于推广应用，目前仅使用做原代培养或被淘汰；气液界面培养法是一种较新的表皮细胞培 养方法，它是应用异体表皮或类似于真皮样物质以增加表皮基底层细胞与培养液的接触， 并让浅表部大多数细胞暴露于空气中，任培养的角质细胞在这种人工创造的生理条件下得 以完全分化。它可以培养出类似正常皮肤结构的表皮细胞，角化程度高，但操作过程相对复 杂，需真皮类似物HSE等，培养过程不易观察，培养周期长，不利于大量培养。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法，该 方法简便、快速、不受时间限制，适合各种皮肤组织如带毛发的头皮、带脂肪的组织等直接 分离。可建立较高活力的表皮细胞库，以利临床移植所需。
[0006] 为实现上述目的，本发明米用的技术方案是：一种体外分离培养人的表皮细胞的 新方法，取人的包括表皮和真皮的正常皮肤组织，进行体外消化、分离，获得人的表皮细胞； 然后将表皮细胞进行体外扩增培养。本发明方法无需去除脂肪，无需将表皮和真皮进行分 离。本发明方法所取皮肤组织为所有人体正常皮肤组织包括带毛发的头皮、带脂肪的组织 等。
[0007] 具体步骤如下：
[0008] (1)采集人的正常皮肤组织样本（包括表皮和真皮），约〇.5-5cm2,放入准备好的 F12培养基（Gibco31765)中，冷藏保存。
[0009] (2)组织称重。
[0010] (3)组织用70 %酒精润洗一下，然后放入含200U/ml青链霉素的PBS里浸泡5分 钟，PBS用量以淹没过组织为准，然后换新的含青链霉素的PBS溶液再次浸泡5分钟以达到 灭菌消毒的目的。
[0011] (4)将组织完全切碎成匀浆。
[0012] (5)切碎后，每lg组织加入含有20ml消化液（含2. 5mg/ml胶原酶和2. 5mg/ml分 散酶的PBS)的离心管中，混匀。37°C水浴震荡消化90-120min，然后加入终浓度为0. 05%的 胰蛋白酶继续消化30min，最后再加100ull0mg/ml的脱氧核糖核酸酶（DNase)消化5min。
[0013] (6)组织消化好后加相同体积的含有10 % FBS的DMEM中和消化液，反复吸打 50-100 次。
[0014] (7)组织悬液用过滤器过滤，过滤后的液体lOOOrpm离心5min，弃上清。
[0015] (8)细胞沉淀用DMEM洗一次，然后离心弃上清。
[0016] (9)细胞沉淀用表皮细胞培养基重悬，铺在coating matrix (Gibco)预处理过的 培养瓶或皿里面37°C、5% C02培养。
[0017] 本发明方法中表皮细胞可用任何可供细胞自然生长的培养基培养，包括MEM、 DMEM、RPMI、F-12、CNT07培养基等，培养基中根据需要添加不同生长因子如表皮细胞生长因 子EGF、表皮细胞生长因子B27和血小板（PC-1)补充液等，这些生长因子对调节细胞生长、 增殖和分化起着重要作用。另外，为了更好的维持表皮细胞的多功能性，在表皮细胞的培养 基中可加入2-10 μ Μ蛋白激酶抑制剂。表皮细胞培养环境应接近人体生理环境，培养基PH 值为6-8,优选7. 4 ;细胞的培养温度为30°C -40°C，优选为35°C -37°C。培养3天以上，即 可获得大量表皮细胞。
[0018] 本发明所用的分离方法适合所有的人正常皮肤组织包括带毛发的头皮、带脂肪的 组织的直接分离，无需去除脂肪，无需将组织的真皮和表皮分离，将胰蛋白酶的消化时间缩 短至30分钟，并且在胰蛋白酶消化之前用分散酶进行了预消化，既降低了胰蛋白酶对细胞 的损伤程度，又可获得高数量、高活力、高克隆形成效率的细胞，培养过程中加入了蛋白激 酶抑制剂，可以有效抑制成纤维细胞的污染，操作过程简便易于掌握，用时短，细胞状态好、 易于贴壁。
[0019] 本发明的有益效果如下：
[0020] 1、本发明方法适合所有的人正常皮肤组织包括带毛发的头皮、带脂肪的组织的直 接分离，无需去除脂肪。填补了利用有毛发的皮肤组织如头皮组织成功分离出表皮细胞这 一技术空白。
[0021] 2、本发明方法无需滋养层，近似于生理状态的细胞培养条件，表皮细胞可直接附 着于培养皿底面发生增殖，操作方便，成片时间早，消除了异种蛋白的影响，较适于表皮细 胞的大量培养。
[0022] 3、本发明方法无需将组织的表皮和真皮分离开，简单，快速，分离的人表皮细胞数 量多，生长良好，连接成片，无成纤维细胞污染，培养过程中不需要加饲养层细胞，避免了其 他细胞的污染，且在此培养条件下，细胞保持了较为旺盛的增值力，有利于进行下一步实 验。
[0023] 4、本发明技术可以用于制作人造皮肤，也可以作为种子细胞种植于支架材料上， 并最终构建成在结构和功能上与正常皮肤类似的人工皮肤，也可以进行自体细胞移植，用 于解决深度烧伤创面皮肤修复中自体皮肤来源有限的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为用本发明方法分离的人表皮细胞。
【具体实施方式】
[0025] 结合以下实例对本发明作进一步说明：
[0026] 在以下的实例1中，我们成功地用成人胸部皮肤分离并扩大培养出了人表皮细 胞。我们取了 〇. 3g的组织（约0. 5cm2)，经过2周的培养，表皮细胞数量超过3000万，细胞 生长状态良好，无其他细胞污染，且细胞经过冻存复苏后仍保持良好的增殖能力和生长状 态。实例2中我们用该发明方法成功地从带毛发的人皮肤组织中分离出了表皮细胞。实例 3和4举例说明了用本发明方法分离的人的表皮细胞的应用情况。
[0027] 实例1 :用成人胸部皮肤成功分离并扩大培养出人表皮细胞
[0028] (1)材料和方法
[0029] 组织：医院手术废弃的成人正常胸部皮肤（包括真皮和表皮），约0. 5cm2。
[0030] 细胞培养基：CNT07
[0031] (2)细胞分离及培养：
[0032] a)组织在F12培养液中冷藏运到实验室，称重。用70%酒精润洗一下，然后放入 含200U/ml青链霉素的PBS里浸泡5分钟2次。
[0033] b)用手术刀将组织完全切碎，时刻观察组织情况，如果太干，补加 PBS。每lg组织 加入含有20ml消化液（含2. 5mg/ml胶原酶和2. 5mg/ml分散酶的PBS)的离心管中，混勻， 37°C水浴震荡消化90-120min，然后加入终浓度为0. 05%的胰蛋白酶继续消化30min，最后 再加100ull0mg/ml的脱氧核糖核酸酶（DNase)消化5分钟，消化过程中每隔10-15min摇 晃一下管子将组织团块摇散。
[0034] c)酶切过程中提前用coating matrix (Gibco)孵育细胞培养瓶，室温孵育10分钟 即可。
[0035] d)组织消化好后加相同体积的含有10 % FBS的DMEM中和消化液，反复吸打 50-100 次。
[0036] e)用过滤器过滤，过滤后的液体lOOOrpm离心5min，弃上清。并用DMEM清洗管子 和过滤器。
[0037] f) lOOOrpm 离心 5min，弃上清。
[0038] g)细胞沉淀用DMEM洗一次，然后离心弃上清。
[0039] h)沉淀用含有lOuM蛋白激酶抑制剂的表皮细胞培养基CNT07重悬，培养基PH值 为7. 4。铺在步骤c预处理过的培养瓶里面，37°C、5% C02培养。
[0040] (3)结果：细胞分离出时数量较多，有聚团，第2天开始逐渐贴壁，显微镜下可观察 到许多表皮细胞克隆，这些克隆逐渐连接成片，呈典型的"铺路石"状，如附图1所示。细胞 基本无成纤维细胞污染。传代和冻存后仍能保持良好的状态和增殖能力。
[0041] 实例2 :用人头部皮肤组织，成功分离并扩大培养出人头部皮肤表皮细胞
[0042] (1)材料和方法
[0043] 组织：医院手术废弃的胚胎正常头部皮肤（包括真皮和表皮），约1cm2。
[0044] 细胞培养基：CNT07
[0045] (2)细胞分离及培养：方法与实例1相同。
[0046] (3)结果：分离到的细胞克隆较多，易于贴壁，在培养瓶中能较快连接成片，细胞 呈"铺路石"状，细胞较纯，传代和冻存后仍能保持良好的状态和增殖能力。
[0047] 实例3 :用本发明方法分离的人的表皮细胞应用于制作人造皮肤
[0048] (1)材料：BD胶原蛋白
[0049] (2)细胞：人的真皮细胞和实例1中获得的人表皮细胞
[0050] (3)方法：
[0051] a)在冰上准备不含细胞的胶原蛋白层，并铺到6孔细胞培养板嵌套孔内，室温静 置20分钟使其凝胶。
[0052] b)将培养的真皮细胞消化下来，与胶混合基质混匀，铺到非细胞胶原层上培养30 分钟。
[0053] c)加入真皮细胞培养液培养3天。
[0054] d)去真皮细胞培养液，将分离培养的人的表皮细胞消化下来铺在胶原蛋白胶中 心，室温静置15分钟使细胞贴壁，然后培养箱中培养30-60分钟。
[0055] e)加入DMEM :F12 (3:1)培养基培养3天。
[0056] f)弃去培养基，于气液界面再培养4天。
[0057] h)用手术刀将人造皮肤切下，进行组织学分析。
[0058] (4)结果：通过组织学分析，可以看到，表皮细胞会在胶质的最上面形成一层，形 态和生化结构与人体内正常表皮层相似。表皮层下面为真皮细胞层。
[0059] 实例4 :用本发明方法分离的人的表皮细胞移植到小鼠身上实现人皮肤无疤痕再 生
[0060] (1)动物：免疫缺陷的裸鼠
[0061] (2)细胞：取自人头部皮肤组织的真皮细胞和实例2中分离获得的表皮细胞
[0062] (3)方法：从有免疫缺陷的裸鼠背上切取全层皮肤形成开放的伤口，将附有人的 表皮和真皮细胞的硅胶膜覆盖于鼠的伤口上，细胞面与伤口直接接触，硅胶膜覆盖在上面。 每只裸鼠身上可做1到2个移植，并将硅胶膜与裸鼠皮肤缝合，将涂有药膏的消毒纱布置于 伤口上，并用消毒绷带包裹裸鼠。移植后的裸鼠每周观察并拍照记录，可观察12周到一年。
[0063] (4)结果：移植4周后，移植处的创面已完全愈合，并形成有色素的新皮肤，没有疤 痕形成，说明可以用于无疤痕的创伤愈合。到第12周，皮肤表面产生肉眼清晰可辨的带有 色素的毛发。因为免疫缺陷的裸鼠没有黑色素细胞不会形成含色素的皮肤和毛发，说明新 生的皮肤和毛发是来自移植的培养的细胞。长出来的毛发可以持续增长，6个月可以达到 3cm长。6个月组织切片染色（苏木紫-伊红染色方法）分析显示：再生皮肤的结构和成人 头皮的皮肤结构非常相似，含有表皮层，真皮层和皮下组织层，再生的毛发其成熟毛干连接 至皮脂腺和真皮乳突，可循环生长。
[〇〇64] 通过以上实施例结果可以看出用本发明的分离培养和扩增技术，可以有效地从所 有的人正常皮肤组织中分离出人的表皮细胞，方法简单，用时短，无需将组织的真皮和表皮 分开，获得的细胞数量多，状态好，种类纯。该技术为下一步进行组织工程学方面的研究提 供了必要的前提条件并打下了坚实的基础，也是烧伤整形临床实验的基础研究不可缺少的 重大组成部分，在此基础上，人工皮肤的研究成为可能，大面积烧伤病人无排斥的自体细胞 种植早期永久性覆盖创面成为可能，烧伤及整形病人的手术治疗由"拆东墙补西墙"的单一 模式转变为来源丰富的异体或自体皮肤封闭修补术等多种模式成为可能，因此它有着广阔 的应用前景。
【权利要求】
1. 一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，取人的包括表皮和真皮的 正常皮肤组织，进行体外消化、分离，获得人的表皮细胞；然后将表皮细胞进行体外扩增培 养；所述方法无需去除脂肪，无需将表皮和真皮进行分离。
2. 如权利要求1所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，具体步骤 如下： (1) 采集人的包括表皮和真皮的正常皮肤组织样本约〇. 5-5cm2,放入准备好的F12培 养基中，冷减保存； (2) 组织称重； (3) 组织用70 %酒精润洗一下，然后放入含200U/ml青链霉素的PBS里浸泡5分钟， PBS用量以淹没过组织为准，然后换新的含青链霉素的PBS溶液再次浸泡5分钟； (4) 将组织完全切碎成匀浆； (5) 切碎后，每lg组织加入含有20ml消化液的离心管中，混匀；37°C水浴震荡消化 90-120min ;然后加入终浓度为0. 05%的胰蛋白酶继续消化30min，最后再加100ull0mg/ml 的脱氧核糖核酸酶消化5min ; (6) 组织消化好后加相同体积的含有10% FBS的DMEM中和消化液，反复吸打50-100 次； (7) 组织悬液用过滤器过滤，过滤后的液体lOOOrpm离心5min，弃上清； (8) 细胞沉淀用DMEM洗一次，然后离心弃上清； (9) 细胞沉淀用表皮细胞培养基重悬，铺在coating matrix预处理过的培养瓶或皿里 面 37°C、5% C02 培养。
3. 如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述步骤 (5)的消化液为含2. 5mg/ml胶原酶和2. 5mg/ml分散酶的PBS溶液。
4. 如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表皮 细胞培养基，可以是MEM、DMEM、RPMI、F-12、CNT07培养基中的任意一种。
5. 如权利要求2或4所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表 皮细胞培养基中可以添加不同生长因子，包括表皮细胞生长因子EGF，表皮细胞生长因子 B27、血小板补充液。
6. 如权利要求2或4所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述培 养基中加入2-10 μ Μ蛋白激酶抑制剂。
7. 如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表皮 细胞培养的培养基ΡΗ值为6-8 ;细胞的培养温度为30°C -40°C。
8. 如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述方 法在制作人造皮肤上的用途。
9. 如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述方 法在构建结构和功能上与正常皮肤类似的人工皮肤上的用途。
10. 如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述 方法在自体细胞移植中的用途。
【文档编号】C12N5/071GK104087551SQ201410342022
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】吴训伟, 刑志青 申请人:济南磐升生物技术有限公司