一种大鼠肝星状细胞分离方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠肝星状细胞分离方法。

背景技术：

肝星状细胞(hepaticstellatecells，hscs)是肝脏特有的一种非实质细胞，约占肝脏细胞总数的8％-13％，占肝非实质细胞总数的33％，占肝脏总体积的1.4％，为单层的贴壁生长型细胞，细胞呈星形，纺锤形，多边形，梭形，有伪足，细胞质内含较多脂滴，亦称肝贮脂细胞。肝星状细胞作为肝脏合成细胞外基质的主要细胞群，不仅能分泌蛋白多糖、糖蛋白等细胞外基质成分，还能合成一定量的胶原酶以维持正常的基底膜结构，还能通过其突起的收缩参与肝窦的微循环调节同。肝损伤导致的hscs的激活、增殖及转化是肝纤维化过程中的重要环节，因此肝星状细胞在探讨新的抗肝纤维化治疗措施，对降低慢性肝病的发生率和死亡率具有不可估量的理论意义。目前常用的肝脏原位灌注方法分离的肝星状细胞常混杂kupffer细胞，获得的星状细胞量少，活性低，而且得到的为静止状态下的肝星状细胞，不能被激活。本发明所提供得肝星状细胞的分离方法可以获得产量高、纯度高、活性高且能被激活的大鼠肝星状细胞。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种获得产量高、纯度高、活性高且能被激活的大鼠肝星状细胞分离的方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得大鼠肝星状细胞：

大鼠肝星状细胞分离方法的步骤包括：(a)腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠腹腔开口以暴露肝脏及门静脉；(b)静脉注射肝素，预热灌流液灌注肝脏；(d)取充分灌注后的肝脏，剪碎后于预热消化液中震荡消化；(e)消化后的肝组织经筛网过滤，低速离心吸取上清，再次离心获得细胞沉淀，清洗液清洗一次；(f)将获得的细胞沉淀重悬，经nycoden分离纯化；(g)细胞清洗数次，完全培养基重悬细胞沉淀，铺板培养；(h)细胞免疫荧光鉴定大鼠肝星状细胞。

可选的大鼠为体重400-600g，饲养6-8个月的sd大鼠。

可选的肝素注射位置为近左肾位置且脂肪组织较多的下腔静脉处。

可选的灌流液1、2、3分别为无ca²⁺、mg²⁺的gbss液，含0.25％-0.3％(m/v)链霉蛋白酶e的gbss液、含0.025％-0.03％(m/v)iv型胶原酶的gbss液。

可选的灌流液的流速为8-12ml/min，灌流时间为12-18min，预热温度为30-37℃。

可选的酶消化液为含0.03％-0.035％的(m/v)链霉蛋白酶e和0.0025％-0.003％的(m/v)dnasei的gbss液，消化液预热温度为30-37℃，消化时间为30-40min，震荡的速度为190-200rpm/min，消化温度为37℃。

可选的过滤用的筛网为100目的筛网，低速离心时的转速为50-100g/min，离心时间为2-5min。

可选的清洗细胞时离心的转速为1500-1800rpm/min，离心时间为4-8min。

可选的nycoden分离液的终浓度为8-11％，离心机设置为缓升缓降程序，离心转速为800-1500g/min，离心时间为20-30min，离心温度为20-25℃。

可选的完全培养基为含5％fcs和15％fbs的dmem培养基，接种时所用的细胞瓶及孔板均为未包被的细胞瓶及孔板。

本发明提供一种大鼠肝星状细胞分离的方法，三种灌流液依次灌注，灌流液使用前均预热，维持了胶原酶及链霉蛋白酶的温度，使其活性保持最佳，保证了肝脏得到充分灌注，提高了肝星状细胞的产量。

进一步的，本发明选用低速离心及nycodenz密度梯度离心结合的方法，除去混杂的肝实质细胞及kupffer细胞，提高了肝星状细胞的纯度。

本发明解决了肝星状细胞分离过程纯度低及产量少的问题，使获得的大鼠肝星状细胞产量高、纯度高、活性高且能被激活。

附图说明

图1培养1d的细胞图片(100×)

图2培养7d的细胞图片(100×)

图3培养1d的细胞免疫荧光鉴定图片

图4培养7d的细胞免疫荧光鉴定图片

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择饲养6-8个月，体重为400-600g的雄性sd大鼠，分离肝星状细胞。具体操作如下：

1、取sd雄性大鼠，腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，u型剖开大鼠腹腔以暴露肝脏及门静脉；

2、于近左肾位置且脂肪组织较多的下腔静脉处注射0.2ml的肝素(1500u/l)，并放置消毒后的棉球；

3、将静脉留置针平行插入门静脉，拔出针芯，于近肝门处结扎固定留置管，使针尖与门静脉分支及针尖与结扎线距离分别在一公分位置，将留置针针管连接至蠕动泵；

4、30-37℃预热灌流液1灌流至肝脏胀大，并迅速剪开下腔静脉放血，可见肝脏变为土黄色；灌流液1为无ca²⁺、mg²⁺的gbss液，灌流速度为8-12ml/min，灌流时间为12-18min；灌注过程中用步骤2中放置的棉球控制肝的充盈状态；

5、30-37℃预热灌流液2继续灌注；灌流液2为含0.25％-0.3％(m/v)链霉蛋白酶e的gbss液，灌流速度为8-12ml/min，灌流时间为12-18min；灌注过程中用步骤2中放置的棉球控制肝的充盈状态；

6、30-37℃预热灌流液3继续灌注；灌流液3为含0.025％-0.03％(m/v)iv型胶原酶的gbss液，灌流速度为8-12ml/min，灌流时间为12-18min；灌注过程中用步骤2中放置的棉球控制肝的充盈状态；

7、迅速分离肝脏，撕开肝包膜，剪刀充分剪碎肝脏，并转移至预热消化液中恒温震荡消化30-40min；其中消化液为含0.03％-0.035％的(m/v)链霉蛋白酶e和0.0025％-0.003％的(m/v)dnasei的gbss液，震荡速度为180-220rpm/min；

8、将消化后的肝脏组织依次经80目、100目、200目筛网过滤，收集滤液，20-25℃低速离心2min，转速为100-150g/min；

9、吸管小心吸取上层悬液，避免吸到临近沉淀的液体，并将悬液转移至新的无菌离心管中，20-25℃离心5min，转速为1500-1800rpm/min；

10、再用吸管小心吸取上层悬液，加入适量体积的清洗液，混匀后，20-25℃离心5min，转速为1500-1800rpm/min，清洗液为含0.08％的(m/v)dnasei的gbss液；

11、再用吸管小心吸取上层悬液，加入适量体积的清洗液，混匀后，20-25℃ 离心5min，转速为1500-1800rpm/min，清洗液为含0.08％的(m/v)dnasei的gbss液；

12、吸弃部分上清，剩余5-6ml液体，重悬沉淀，并加入一定体积且充分混匀的浓度为30％的nycoden至终浓度为8％-11％，在上层缓慢匀速加入2ml含dnasei的gbss液，其中30％的nycoden经0.22μm过滤除菌，使用前充分混匀，避光保存；

13、20-25℃离心20min，转速为800-1500g/min，设置离心机模式为缓升缓降；

14、取出离心管，吸管吸取中间白膜层至无菌离心管，加gbss液补足至50ml，充分混匀；

15、20-25℃离心5min，转速为1800rpm/min；

16、弃去上清，再加入50ml的gbss液，重复步骤15；

17、用电子枪充分吸弃上清，加入预热的含5％fcs和15％fbs和1％双抗的dmem完全培养基重悬细胞沉淀，接种于未包被的细胞瓶及孔板中，置于37℃、5％(m/v)的co2、饱和湿度的培养箱中培养增殖；

18、细胞免疫荧光鉴定：将大鼠肝星状细胞种到放置于24孔板内的盖玻片上，体外培养1-7天，取出盖玻片，pbs洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，pbs洗3次，0.2％渗透液triton-100室温下孵育15min，pbs洗3次，5％bsa室温封闭1h，吸去封闭液。加入α-sma抗体于4℃过夜孵育，pbs洗3次。滴加羊抗鼠pe荧光二抗igg(1∶100)，在室温下置于湿盒内孵育45min，pbs洗3次，自然晾干后在显微镜下观察。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进 等，均应包含在本发明的保护范围内。