人工表皮片、其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物制品领域；具体地，涉及共同培养表皮细胞与黑素形成细胞以形成人工表皮片的方法，以及上述人工表皮片在医疗、美容和/或物质筛选中的应用。

背景技术：

皮肤指身体表面包在肌肉外面的组织，是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能。皮肤覆盖全身，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。由于外界原因和/或生物体自身原因，皮肤可能会发生各种损伤和/或病变，其中有些损伤或病变不仅涉及皮肤表皮细胞，还涉及皮肤中的黑素细胞的缺失或损伤(例如白癜风)。

普通白癜风是一种因皮肤黑素细胞缺失所致的疾患。其主要病因是黑素细胞自毁，从而被视为一种自身免疫疾病。白癜风的患部会因黑色素缺失而形成白斑，从而与身体其它部位产生明显色差。

目前，针对白癜风一般会采用涂抹甾类化合物软膏、活性型维他命软膏等药物的治疗方式，有时也会采用他克莫司等免疫抑制剂来进行治疗。此外，现有疗法还包括：puva疗法、短波长紫外线疗法，以及症状发展至全身时采用的内服甾类化合物的疗法。然而，上述疗法均存在疗效不足、治疗后患部仍逐步扩大等问题。

然而，当身体开始对药物产生耐药性时，上述疗法无法达到预期效果，且症状将逐步扩大。在此情况下，可采用另一种疗法，即从患者正常部位获取皮肤，并进行移植。这种疗法的缺点在于，无法进行大面积的移植¹。

还可采用的另一种疗法是：从患者患部以外的、不明显的正常身体部位采集一小块皮肤，利用该皮肤进行角质形成细胞培养，并将培养获得的表皮皮片移植到患部。研究结果表明，这种疗法对于节段型白癜风有效。其之所以有效，主要是基于白癜风的病理学：攻击自身黑素细胞的免疫细胞侵入表皮，这不仅造成黑素细胞的死亡，连周边的角质形成细胞也一同被杀灭²。许多报告表明，白癜风中，患部的角质形成细胞也受到损伤^3-7。

据研究报道，正常情况下，角质形成细胞在uvb的照射下会释放出多种物质，这些物质会促进毛囊部黑素形成细胞的增殖和分化^8,9。然而，受损的角质形成细胞则缺失上述能力，这也是大多数uvb疗法失效的原因。相反，只要将患部的角质细胞替换成正常的表皮角质细胞，就能够治疗白癜风。这就是移植正常表皮皮片能够治愈白癜风的原因之一。

然而，上述这种疗法的有效性仅限于针对节段型白癜风的治疗，其对于出现在两侧的全身型白癜风是无效的。

根据如前文献报道，白癜风患部的黑素细胞会因受到免疫细胞的攻击而死亡。不过，在毛囊根部区域可能仍存在一些不具有被免疫细胞识别的抗原的黑素形成细胞，因为未受到攻击而得以生存。由此，多数的uvb疗法也正是利用该原理，使该部位的表皮细胞活化，分泌对黑素形成细胞的移动、分化和/或成熟有利的细胞因子，使黑素形成细胞产生黑色素。但是，如果该部位的黑素形成细胞也受到伤害，则不仅uvb疗法会失效，移植正常的角质形成细胞也仍然达不到治疗效果。而在仅仅移植黑素细胞的情况中，若免疫细胞活动频繁，黑素细胞的存活率也会受到免疫细胞攻击的影响而低下¹⁰。

目前，虽然已报道了几种无血清、无饲养层细胞的皮肤角质形成细胞培养方法，但是在无血清的状态下使细胞分化，并由此获得可以进行移植的皮片的培养方法至今无报道。并且，本领域中也从未曾尝试并开发出使这样的皮片中含有黑素形成细胞，并使其与表皮细胞共同增殖、分化的培养方法。

因此，本领域仍需要用以治疗白癜风的高安全性新型产品和技术手段。并且，除了针对白癜风之外，本领域也仍需要用于治疗或美化其他涉及皮肤表皮以及黑素形成细胞受损的皮肤症状和/或疾病(例如皮肤烧伤、灼伤、疤痕等)的高安全性新型产品和技术手段。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种人工表皮片，所述人工表皮片的培养与制备过程安全性高。并且，所制得的人工表皮片还包含黑素形成细胞，这对于需要皮肤移植和/或皮肤修补的疾病(如白癜风)和/或状况(如美容相关状况)而言是极为有利的。

本发明的第一方面提供一种人工表皮片，其包含：活的黑素形成细胞和表皮细胞，其中，所述人工表皮片不包含动物源性的血清和蛋白质以及营养支持细胞。

在一些实施方式中，所述人工表皮片不包含脑衍生物质和动植物源性的过敏原物质；在另一实施方式中，所述人工表皮片还包含用于支持所述黑素形成细胞和表皮细胞的支持材料，例如纤维蛋白凝胶。

本发明的第二方面提供一种制备人工表皮片的方法，其包括如下步骤：

(i)皮肤组织预处理：用酶溶液处理以分解皮肤组织，获得包含活细胞的制备物；

(ii)细胞增殖与分化：使所得制备物中的细胞增殖，并分化为黑素形成细胞和表皮细胞，进一步使所述细胞多层化以形成含有黑素形成细胞的人工表皮片；

其中，所述方法不采用动物源性的血清、蛋白质以及营养支持细胞。

在一些实施方式中，所述方法还包括：在用酶溶液分解皮肤组织之后，采用酶抑制剂完全抑制胰蛋白酶活性，随后进行细胞增殖与分化。

在另一些实施方式中，所述方法还包括在细胞增殖与分化之后进行调配步骤，所述调配步骤将分化的细胞或碎片化的细胞皮片包埋进入适当载体，获得含有分化细胞的载体。

在一些具体实施方式中，所述载体是纤维蛋白。

在另一些实施方式中，所述酶溶液包含蛋白水解酶，所述蛋白水解酶包括中性蛋白酶(例如，分散酶)、胰蛋白酶、胶原酶中的一种或多种。

在另一些实施方式中，所述分化过程中，逐步将分化培养液相对于增殖培养液的占比提高。

在一些具体实施方式中，细胞分化过程中添加的分化培养液与增殖培养液的体积比从1:2逐步过渡至全部为分化培养液。例如，从1:1到2:1，再到3:1，最终达到全部为分化培养液。

在一些具体实施方式中，所述分化培养液在基础培养液的基础上还包含：胰岛素、促肾上腺皮质激素、全铁转铁蛋白和维生素d。

在一些实施方式中，所述细胞增殖的过程中，对所述细胞的传代不超过5代。

在一些实施方式中，传代后采用的增殖培养液在传代前采用的增殖培养液的基础上另添加干细胞培养因子scf和wnt-3a。

本发明的第三方面提供采用本发明方法制备获得的人工表皮片。

本发明的第四方面提供本发明的人工表皮片在制备针对以皮肤黑素细胞缺失为特征的疾病(例如，白癜风)或状况的产品中的应用。

本发明的第五方面提供本发明的人工表皮片在筛选用于皮肤疾病或状况的药物或化妆品中的应用。

在本发明的方法中，既不使用含有危险因子的培养液，例如，含有动物源性(例如，人源性)血清、脑衍生物质、牛或猪源性的蛋白质，或者动植物源性的过敏原物质的培养液，又不使用营养支持细胞(例如，小鼠源性的支架细胞)。所述方法安全性高，并且，所制得的人工表皮片还包含黑素形成细胞，这对于需要通过人工皮肤来治疗和/或美化的疾病或状况，尤其是以皮肤黑素细胞缺失为特征(例如白癜风)疾病或状况的治疗和/或美化而言是极为有利的。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：界面培养vd3的浓度影响(实施例5)。(a)：1α,25(oh)2vd3:10^-11m；(b)：1α,25(oh)2vd3:10^-9m。

图2：将含有细胞的纤维蛋白凝胶从培养皿中取出放置到手背上并拍摄的照片(实施例9)。

图3：分化方法的研究1：多阶分化、vd3浓度和传代次数对于黑色素形成细胞数的影响(实施例11)。

图4：分化方法的研究2：细胞因子和vd3对于黑素形成细胞成熟的影响(实施例12)。(a)：对照；(b)：添加细胞因子；(c)：添加细胞因子+vd3。

图5：分化方法的研究3：细胞因子和vd3对于黑素形成细胞数量的影响(实施例13)。(a)：对照；(b)：添加细胞因子；(c)：添加vd3。

图6：分化方法的研究4：acth对于角质形成细胞的维持作用(实施例14)。分化时维持基底细胞：(a)acth(+)，(b)acth(-)；上下图放大倍率相同。

图7：分化方法的研究5：胰岛素、全铁转铁蛋白对于分化的影响(实施例15)。分化时添加acth基础上再加胰岛素与转铁蛋白(即it)，获得的多层化结果与应用血清时所得结果相同。

图8：分化方法的研究6：细胞因子对于酪氨酸酶活性的影响(实施例16)。(a)：wnt+scf；(b)：scf+内皮素。

图9：不同的采集部位，对于黑素形成细胞出现数量的差异确认。(a)胸部皮肤；(b)包皮皮肤。

具体实施方式

通过长期而深入的研究，发明人发现了一种细胞培养的新式方法。通过该方法，能够在无血清、无滋养层的环境中培养出皮肤表皮细胞，并使其形成人工表皮片。同时，所述人工表皮片中还包含与表皮细胞共同增殖的黑素形成细胞。通过本发明安全且低成本的方法获得的人工表皮片能够用于多种应用，例如，针对以皮肤黑素细胞缺失为特征的疾病(如白癜风)的治疗、针对皮肤疾病相关的药物或化妆品进行的研发筛选等等。本发明就是在此发现的基础上完成的。

具体而言，本发明的方法涉及从收集的皮肤样品中分离(例如通过蛋白分解酶处理)包含表皮细胞和黑素形成细胞的细胞群，培养所述细胞群使其增殖和/或传代以获得所需的细胞数量，使得所述培养细胞分化形成含有表皮细胞和黑素形成细胞的人工表皮片或使得分化细胞与适当载体材料结合以形成适于移植的皮片材料。

本发明的方法与现有技术中常用方法的不同之处主要在于：在本发明的方法中，既不使用含有危险因子的培养液，例如，含有动物源性(例如，人源性)血清、脑衍生物质、动物源性(例如，牛或猪源性)的蛋白质，或者动植物源性的过敏原物质的培养液，又不使用营养支持细胞(例如，小鼠源性的支架细胞、饲养层细胞等)。所述方法安全性高，并且，所制得的人工表皮片还包含黑素形成细胞，这对于需要皮肤移植和/或皮肤修补的疾病如(白癜风)和/或症状(如美容相关症状)而言是极为有利的。

术语说明

本文中所用的术语“白癜风”指一种常见的色素性皮肤病，以皮肤、粘膜和/或毛发的色素脱失为特征。其由于黑素细胞功能缺失所引起，表现为皮肤、粘膜和/或毛发上大小和形状各异的脱色性白斑，周围皮肤颜色正常或有色素增加。白癜风的皮损可出现在全身各部位，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。

术语“节段型白癜风”是白癜风的一种亚型，沿皮神经节段分布。与其它类型的白癜风相比，其在临床上具有发病早、皮损不对称、进展迅速的特点。

术语“泛发型白癜风”是白癜风的一种亚型，其皮损为边界清楚的白斑，呈圆形、卵圆形或不整形。可发生于身体任何部位，无自觉症状，白斑超过体表总面积的50％以上，多由久病发展而来。

本文中所用术语“黑素细胞”也即“黑色素细胞”，是主要位于皮肤和粘膜的特殊细胞，其能够合成并分泌黑色素，并将黑色素传递给周围的角质形成细胞，以产生抵抗光线辐射的保护作用。“黑素干细胞”主要存在于毛囊隆突(bulge)部分，其具有多种分化潜能和高度增殖能力，在合适的环境条件下能够分化成黑素细胞。本文中，“黑素干细胞”和“黑素细胞”统称为“黑素形成细胞”。

本文中所用的术语“表皮细胞”主要指动物皮肤的上皮细胞，其除了具有一般的上皮细胞的特征之外，还可产生角质，具有很强的角质化特点，起到保护皮肤的作用。

术语“角质形成细胞”是一种能够合成角质蛋白的表皮细胞，其为表皮的主体，由表皮深层开始逐渐增殖、分化。本领域已知，角质形成细胞最终产生角质蛋白，并且，在其向角质细胞演变的过程中，一般可大致分为四层，即基底层、棘层、颗粒层以及角质层，这一形成两个或更多层的过程在本文中称作“多层化”。在角质化的角质细胞中，细胞核与细胞器完全消失，细胞亦失去生理功能。

本文中所用的术语“皮片”指一种用于修复体表组织的浅层缺损的片状材料，其通常不含皮下脂肪组织。一般而言，皮片可经移植或以敷料形式施加于需要修复、填补的皮肤、粘膜处。

本文中所用的术语“营养支持细胞”或“饲养层细胞”(feedercells)指本领域已知的、已在体外培养的细胞，其常用于辅助或促进目标细胞的生长与增殖。常用的营养支持细胞的示例有：小鼠源性的胎儿纤维芽细胞、3t3细胞、皮肤纤维芽细胞、cho细胞、cos-7细胞、vero细胞、mdbk细胞、sto细胞、brl细胞，sl-10细胞等。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

人工表皮片

本发明提供一种人工表皮片，其包含：活的黑素形成细胞和表皮细胞。其中，所述人工表皮片不包含动物源性的血清和蛋白质以及营养支持细胞。

在本发明的人工表皮片中，不包含脑衍生物质和动植物源性的过敏原物质。

在本发明的一个实例中，所述人工表皮片还包含用于支持所述黑素形成细胞和表皮细胞的支持材料。在一个具体实例中，所述支持材料是纤维蛋白凝胶。

人工表皮片的制造方法

本发明提供一种制造人工表皮片的方法。

在本发明的上述制造人工表皮片的方法中，包括皮肤组织预处理：用酶溶液处理以分解皮肤组织，以获得包含活细胞的制备物。

在本发明的方法中，所述皮肤组织预处理包括酶溶液浸渍步骤。

在本发明的方法中，酶溶液浸渍涉及：将通过组织采集获得的组织浸入含有蛋白水解酶的酶溶液。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液处理在0℃～37℃的环境温度下进行。在一个实例中，酶溶液处理在4℃～37℃的环境温度下进行。

在本发明的方法中，酶溶液处理不采用动物源性的蛋白水解酶。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液浸渍处理采用遗传重组的蛋白水解酶。在一个实例中，可用的蛋白水解酶包括但不限于：胰蛋白酶、tryple酶、中性蛋白酶(例如，分散酶)、胶原酶、释放酶、酶、明胶酶b、金属弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等，或其任意组合。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液浸渍处理也可采用市售的酶溶液。所述市售的酶溶液例如但不限于：trypzean(sigma公司)、trypleselect(gibco公司)、trypleexpress(gibco公司)、dispase分散酶(三光纯药株式会社)、胶原酶i、ii、iii、iv、v或vi型(和光纯药株式会社)等，或其任意组合。

在本发明的一个示例性方法中，可采用两种或更多种酶溶液，依次或同时浸渍皮肤组织。在一个实例中，分散酶溶液在tryple溶液之前使用。在又一个实例中，采用tryple溶液的酶溶液浸渍不采用分散酶溶液。在另一个实例中，先采用分散酶和tryple依次或同时处理组织，最后添加胶原酶进行消化处理。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液中的蛋白水解酶浓度随所采用的酶的种类不同而变化。一般而言，所采用的蛋白水解酶在缓冲溶液(如pbs)中的浓度是0.001％～0.7％w/v)。在一个实例中，所述蛋白水解酶的浓度可以是：0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、0.7％，或以上述任意两个数值为端点形成的范围。在一个具体实例中，若酶溶液中采用tryple，则tryple可根据需要在原有的母液浓度基础上稀释一定倍数(例如1～10倍)后使用。

在本发明的一个示例性方法中，为了避免细胞死亡，可任选地在酶溶液中添加防止细胞死亡的试剂，例如rock抑制剂。在一个实例中，这类抑制剂包括但不限于：y-27632、thiazovivin、fasudil、gsk429286a、rki-1447等。在一个优选实例中，添加1μm～20μm浓度范围的y-27632或asudil。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液处理持续0.1小时～24小时的时间长度。在一个实例中，酶溶液处理持续1小时～16小时的时间长度。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液处理步骤还包括：对经过酶溶液处理的物料进行过滤，以去除未消化的大块组织残渣。在一个实例中，过滤采用未消化的大块组织残渣无法通过的尺寸的过滤网进行。在另一个实例中，过滤采用40～100μm的滤网进行。

在本发明的一个示例性方法中，酶溶液处理步骤还包括：从所得滤液分离并回收细胞与组织小碎片。在一个实例中，所述分离通过离心方式进行。

必要时，回收未被消化的残渣并以残渣用酶溶液对其重复浸渍处理。所述残渣用酶溶液包含的蛋白水解酶与先前在酶溶液处理步骤中所用的酶溶液中的蛋白水解酶相同或不同。然后，可将所得细胞和/或组织小碎片与之前所得细胞和/或组织小碎片合并，用于后续处理。

在本发明的方法中，所述皮肤组织预处理还任选地包括组织采集步骤。所述组织采集步骤在酶溶液处理步骤之前进行。

在本发明的方法中，组织采集涉及：从皮肤采集含有细胞的组织。

在本发明的一个示例性方法中，所述组织采集是自体组织采集。

对于组织采集的区域没有特殊限制，其可以选自对象全身皮肤的任何部位。

在本发明的一个示例性方法中，选择对象颈部以上区域，例如面部、头颈部的皮肤组织。因为据文献报道，颈部以上的皮肤组织中的干细胞的含量较高，而干细胞具有分化成各种皮肤所需细胞的潜能。例如，可选择头部毛发部位的皮肤作为组织采集区域，因为该区域中含有毛囊干细胞。

在本发明的一个示例性方法中，选择对象腹股沟的皮肤作为组织采集区域，因为该区域中含有大量黑素形成细胞，这同样有利于形成本发明的人工表皮片。

在本发明的一个示例性方法中，采集的组织是皮肤组织全层。在一个实例中，采集的组织至少包括皮肤的表皮层和真皮层。

对于组织采集的对象的年龄没有特殊限制，优选采集的组织来源于对象自体。

在本发明的方法中，所述皮肤组织预处理还任选地包括抑制剂溶液处理步骤。

在本发明的方法中，抑制剂溶液处理涉及：将经过酶溶液处理的混合物与含有蛋白水解酶抑制剂的抑制剂溶液接触。其主要目的是：抑制先前酶溶液处理步骤所用的蛋白水解酶溶液中存在的易引起细胞死亡和/或引起对后续培养和/或分化产生不利影响的蛋白酶(主要为胰蛋白酶)活性。

在本发明的一个示例性方法中，所述蛋白水解酶抑制剂可以是，例如，胰蛋白酶抑制剂(大豆源性、利马豆源性等)、抑酶肽(aprotinin)等。在一个实例中，还可采用市售的蛋白水解酶抑制剂，例如但不限于，trypsininhibitor(大豆)(wako公司)、trypsininhibitor(利马豆)(sigma公司)、重组aprotinin(烟草)(sigma公司)等。

在本发明的方法中，蛋白水解酶抑制剂的用量需要考虑以下方面。一方面，本发明的抑制剂溶液处理步骤和细胞培养步骤中均不采用血清，从而对于具有胰蛋白酶活性的蛋白水解酶，需尽快使其完全失活。因此，含有大量蛋白水解酶抑制剂的抑制溶液是必要的。另一方面，如果蛋白水解酶抑制剂的用量过多，则会对后续的细胞增殖产生不利影响(例如，阻碍后续的细胞增殖)。

在本发明的一个示例性方法中，为了同时满足上述两方面的要求(即，使胰蛋白酶活性完全失活，同时不造成对于后续细胞增殖的抑制)，抑制剂溶液用量只需达到本领域常规技术和常识中所揭示的完全抑制胰蛋白酶活性的用量即可。例如，抑制剂溶液处理步骤中所用的蛋白水解酶抑制剂的用量是酶溶液处理步骤中所用胰蛋白酶的2倍～10倍(体积比)。在一个实例中，抑制剂溶液处理步骤中所用的蛋白水解酶抑制剂的用量是酶溶液处理步骤中所用胰蛋白酶的2倍～5倍。在一个实例中，抑制剂溶液处理步骤中所用的蛋白水解酶抑制剂的用量是酶溶液处理步骤中所用胰蛋白酶的2倍～3倍。

在本发明的一个示例性方法中，抑制剂溶液处理步骤在0℃～37℃的温度范围内进行。在一个实例中，抑制剂溶液处理步骤在4℃～25℃的温度范围内进行。

在本发明的一个示例性方法中，抑制剂溶液处理持续10分钟～6小时的时间长度。在一个实例中，抑制剂溶液处理持续10分钟～2小时的时间长度。

在本发明的一个示例性方法中，抑制剂溶液处理还包括：从经过抑制剂溶液浸渍处理的物料去除抑制剂。在一个实例中，所述抑制剂通过离心去除。

在本发明的一个示例性方法中，在所述抑制剂溶液处理之后，可将未消化的组织残渣经回收并以残渣用酶溶液处理，所述残渣用酶溶液包含的蛋白水解酶与酶溶液处理步骤的酶溶液中所用的蛋白水解酶不同，然后将通过残渣酶溶液处理所得的细胞和通过抑制剂溶液处理得到的细胞共同用于细胞培养步骤。

在本发明的上述制造人工表皮片的方法中，包括细胞增殖与分化：使所得制备物中的细胞增殖，并分化为黑素形成细胞和表皮细胞，进一步使所述细胞多层化以形成含有黑素形成细胞的人工表皮片。

在本发明的方法中，细胞增殖与分化过程中不使用含有危险因子的培养液。所述危险因子包括非临床级异体或异种源性的、可能会对后续的细胞培养造成污染或影响，或者可能会在后续的移植过程中引起不希望的免疫反应(例如过敏、排斥等)的组分，但应注意，此处不包括无热源的重组蛋白。示例性的危险因子包括：动物源性血清、脑衍生物质、动物源性的蛋白质，或者动植物源性的过敏原物质。

具体而言，所述动物源性的血清通常包括(但不限于)：人血清、猴血清、猿血清、胎牛血清、牛血清、猪血清、马血清、驴血清、鸡血清、鹌鹑血清、绵羊血清、山羊血清、狗血清、猫血清、兔血清、小鼠血清、豚鼠血清以及老鼠血清等。

所述脑衍生物质通常包括(但不限于)：脑下垂体提取物、脑提取物、以及脑源性提取脂质等。

所述动物源性蛋白质(例如牛或猪)指来源于动物(例如牛或猪)的任何蛋白质，其特定示例包括但不限于动物(例如牛或猪)来源的：白蛋白、铁传递蛋白、胶原蛋白、明胶、酶等。

所述动植物源性的过敏原物质通常包括(但不限于)：花生、面粉、贝壳类、小麦、牛乳和鸡蛋等衍生的物质，以及任何其它能够引起过敏反应的物质。应注意，此处不包括无热源的重组蛋白。

在本发明的方法中，细胞培养步骤不使用营养支持细胞。

组织工程领域常规的细胞培养中，多数会采用营养支持细胞(例如，饲养层细胞)来支持目标细胞的生长与增殖。本领域中常用的营养支持细胞类型包括但不限于：小鼠源性的胎儿纤维芽细胞、3t3细胞、皮肤纤维芽细胞、cho细胞、cos-7细胞、vero细胞、mdbk细胞、sto细胞、brl细胞、sl-10细胞，以及其它一般培养株细胞。但是，在本发明方法中，不使用任何类似的外来营养支持细胞。因此，最终获得的细胞中没有混入营养支持细胞，可以保证其安全性。同时，优选培养所采用的是自体细胞，以保证培养的细胞具有高移植率。

在本发明的方法中，可在本发明的基础培养液中分别加入合适的组分以分别形成本发明的增殖培养液、传代培养液和/或分化培养液。根据本发明的不同培养阶段需求，可采用不同的基础培养液，并在此基础上添加适当组分。对于基础培养液没有特别的限制，只需要选用的培养液含有细胞生存所必要的维生素、矿物质、氨基酸，且不含有任何危险因子即可。

在一个实例中，可选用的基础培养液例如但不限于：mcdb151培养液(sigma公司)、mcdb153培养液(sigma公司)、mcdb154培养液(sigma公司)、角质形成细胞基础培养液(keratinocytebasalmedium，stemline公司)、限定成分的角化细胞无血清培养液(definedkeratinocyte-sfm，invitrogen公司)、dmem/f-12培养液(invitrogen公司)或它们的适当组合等。

在本发明的方法中，细胞增殖所用的增殖培养液通过向所选的基础培养液中添加适合和/或促进细胞培养和增殖的添加剂来配制。适合细胞培养的添加剂包括，例如，细胞增殖促进剂、防止或减少细胞死亡的保护剂(例如脂质添加剂、自由基清除剂)，及其任意组合。

在一个实例中，增殖培养液中具有细胞增殖促进剂。在一个具体实例中，所述细胞增殖促进剂包括但不限于如下物质中的一种或多种：kgf(角质形成细胞生长因子，例如fgf7)、胰岛素、人全铁转铁蛋白、亚硒酸盐、乙醇胺、脂质、维生素c，以及维生素c诱导物。上述物质中，kgf的添加浓度优选在0.1～100ng/l范围内，而除了kgf以外的其它添加剂的添加浓度优选在1～2000nm/l范围内。

在一个实例中，增殖培养液中具有脂质添加剂。在一个具体实例中，所述脂质添加剂包括但不限于如下物质中的一种或多种：花生四烯酸、胆固醇、dl-α-醋酸生育酚、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、维生素a棕榈酸酯、硬脂酸、吐温-80、pluronicf68(可购自sigma公司、invitrogen公司等)，及其本领域常用的其它脂质添加剂。所述脂质添加剂的浓度优选在1/10000～1/1000(体积比，基于培养液终体积)。

在一个实例中，增殖培养液中具有自由基清除剂。在一个具体实例中，所述自由基清除剂包括但不限于如下物质中的一种或多种：还原型谷胱甘肽、维生素e，维生素e诱导物、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(sod)等。其中，所述自由基清除剂的添加浓度优选在1～1000nm/l范围内。

在本发明的一个具体实例中，增殖培养所用的增殖培养液在基础培养液的基础上另添加，例如，胰岛素、人全铁转铁蛋白、cd脂质浓缩物、维生素、角质细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、rock抑制剂、促肾上腺皮质激素、抗生素等。

在一个实例中，还可向增殖培养液中添加如下物质中的一种或多种：表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf2)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、干细胞因子(scf)、wnt-1、wnt-3a、促肾上腺皮质激素(acth)、内皮素-1(et-1)、活性型维生素d3、前列腺素e2(pge2)、作为细胞死亡保护剂的rho相关激酶(rock)抑制剂的法舒地(fasudi)、y-27632等。上述添加剂按照常规的添加量范围使用即可，优选是1nm/l～0.1mm/l。

在本发明的一个示例性方法中，细胞开始培养时，将细胞以适当的密度，例如1×10^2-6个细胞/cm²或1×10^2-6个细胞/ml的密度，接种于细胞培养容器内的增殖培养液中，然后将其置于37℃的二氧化碳培养箱或自动培养装置内进行培养。

在本发明的一个示例性方法中，所述细胞培养容器包括但不限于，培养皿、培养瓶、微板等。在一个实例中，为了提高细胞与培养容器之间的附着性，可采用胶原、凝胶、l型多聚赖氨酸、d型多聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、多聚-l-鸟氨酸、纤维蛋白、透明质酸等的中的一种或多种细胞支持用基材对培养容器进行涂覆预处理。在另一个实例中，采用适合无血清培养液用的专用培养容器。

在本发明的一个示例性方法中，本发明的细胞培养采用驯化培养方式。应理解，常规的细胞培养一般每隔几日就需要更换全部的培养液，而所谓的“驯化培养”则是在更换培养液的时候要部分或全部保留原培养液中能使细胞自我生长的成分。具体而言，驯化培养表示在更换培养液时，不是把旧的培养液全部除去并更换成新的培养液，而是保留部分或全部旧培养液，且在此基础上添加新的培养液。若在此过程中有部分旧培养液被弃去，则对该部分待弃去的旧培养液的进行提取。例如，将待弃去的旧培养液放入离心管离心，除去上清液，向离心管中沉淀团块(包括残留细胞)添加新培养液，使其重悬，然后再将其添加回原来的培养容器中。在一个实例中，更换培养液时保留培养物质体积5～50％的旧培养液。在另一个实例中，保留培养物质体积10～30％的旧培养液。

在本发明的一个示例性方法中，本发明的细胞增殖包括初代增殖培养。在一个实例中，所述初代增殖培养采用增殖培养液进行。

在本发明的一个具体实例中，初代增殖培养所用的增殖培养液在基础培养液的基础上另添加，例如，胰岛素、人全铁转铁蛋白、cd脂质浓缩物、维生素、角质细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、rock抑制剂、促肾上腺皮质激素、抗生素等。

在一个实例中，从细胞培养开始，持续约3～10天的时间进行第一次培养液更换。在另一个实例中，从细胞培养开始，持续约3～8天的时间进行第一次培养液更换。在另一个实例中，从细胞培养开始，持续约3～6天的时间进行第一次培养液更换。在一个具体实例中，所述第一次培养液更换不去除旧培养液，而是仅添加新鲜培养液。

在一个实例中，本发明的初代增殖培养持续10～16天。在另一个实例中，本发明的初代增殖培养持续10～14天。在另一个实例中，本发明的初代增殖培养持续10～12天。

在本发明的一个示例性方法中，本发明的细胞增殖还包括细胞传代，所述细胞传代可在初代增殖培养的细胞达到融合时进行。在一个具体实例中，对增殖培养的细胞传代少于5代。在一个具体实例中，对增殖培养的细胞传代少于4代。在一个具体实例中，对增殖培养的细胞传代少于3代。在一个具体示例中，对增殖培养的细胞传代少于2代。在一个具体示例中，对增殖培养的细胞传代不超过1代。

在本发明的一个示例性方法中，本发明的细胞增殖还包括传代后增殖培养。在一个实例中，传代后增殖培养采用传代培养液。在一个具体实例中，所述传代培养液在前述增殖培养液的基础上另添加干细胞培养因子scf和wnt-3a。

在一个实例中，所述传代后增殖培养持续3～10天。在另一个实例中，所述传代后增殖培养持续5～7天。

在本发明的一个示例性方法中，本发明的细胞分化采用分化培养液进行。在一个实例中，分化培养液在基础培养液的基础上配置。

在一个实例中，所述分化培养液中包含胰岛素。在一个实例中，分化培养液中的胰岛素含量为1～10mg/l。在另一个实例中，分化培养液中的胰岛素含量为3～8mg/l。在另一个实例中，分化培养液中的胰岛素含量为5～7mg/l。

在一个实例中，所述分化培养液中包含促肾上腺皮质激素(acth)。在一个实例中，分化培养液中acth含量为0.5～3μm。在另一个实例中，分化培养液中acth含量为0.8～2μm。在另一个实例中，分化培养液中的acth含量为1～1.5μm。

在一个实例中，所述分化培养液中包含全铁转铁蛋白。在一个实例中，分化培养液中的全铁转铁蛋白含量为1～10mg/l。在另一个实例中，分化培养液中的全铁转铁蛋白含量为3～8mg/l。在另一个实例中，分化培养液中全铁转铁蛋白含量为5～7mg/l。

在一个实例中，所述分化培养液中包含维生素d3。在一个实例中，分化培养液中的维生素d3含量为5×10^-12m～5×10^-11m。在另一个实例中，分化培养液中的维生素d3含量为7×10^-12m～3×10^-11m。分化培养液中的维生素d3含量为9×10^-12m～2×10^-11m。在一个实例中，所用的维生素d3是1α,25-二羟基维生素d3。

在一个实例中，细胞分化过程中所用的培养液中不含角质细胞生长因子(kgf)和表皮细胞生长因子(egf)。

在本发明的一个示例性方法中，所述分化培养液中的钙含量高于所述增殖培养液中的钙含量。在一个具体实例中，增殖培养液中的钙含量为0.05～0.15mm。在另一个具体实例中，增殖培养液中的钙含量为0.08～0.12mm。在另一个具体实例中，增殖培养液中的钙含量为0.09～0.1mm。在一个具体实例中，分化培养液中的钙含量为1～2mm。在另一个具体实例中，分化培养液中的钙含量为1.5～1.8mm。

在一个实例中，所述细胞分化采用多阶分化方式进行。具体地，所述“多阶分化方式”指，在分化过程中，逐步将分化培养液相对于增殖培养液的占比提高，以实现所需的细胞分化。

在一个实例中，细胞分化过程中添加的分化培养液与增殖培养液的体积比从1:2逐步过渡至全部为分化培养液。在另一个实例中，细胞分化过程中添加的分化培养液与增殖培养液的体积比从1:1.5逐步过渡至全部为分化培养液。在另一个实例中，细胞分化过程中添加的分化培养液与增殖培养液的体积比从1:1逐步过渡至全部为分化培养液。

在一个实例中，分化培养液相对于增殖培养液的体积比分四个阶段逐步提高。在一个具体实例中，分化培养液与增殖培养液的体积比以：0.8:1～1.2:1、1.5:1～2.5:1、2.8:1～4:1、全部为分化培养液，分四个阶段逐步提高。在另一个具体实例中，分化培养液与增殖培养液的体积比以：1:1、2:1、3:1、全部为分化培养液，分四个阶段逐步提高。在本发明的一个示例性方法中，上述各阶段持续2～4天。

在本发明的方法中，细胞增殖与分化还包括使所述细胞多层化以形成含有黑素形成细胞的人工表皮片。在一个实例中，细胞群可形成片状结构，优选多层片状结构，其中包含表皮细胞和黑素形成细胞。收集该片状物，即为本发明的人工表皮片。可选地，将所述人工表皮片转移到医用载体上，以备应用。

在本发明的上述制备人工表皮片的方法中，出于进一步提高移植率的考虑，还可包括调配步骤。所述调配步骤中，可使细胞培养步骤中获得细胞或人工表皮片碎片包埋进入适当载体(例如纤维蛋白)中，获得含有分化细胞的人工表皮片(例如纤维蛋白凝胶皮片)。

在本发明的一个示例性实例中，将通过本发明方法培养获得的人工表皮片，再次通过酶处理进行剥离，并将其包埋到纤维蛋白中，制成纤维细胞皮片。

在本发明的一个示例性实例中，将通过本发明方法培养获得的人工表皮片，通过酶处理进行剥离，并将其转移到适当支持物上以在保存和/或运输中支持所述皮片。

人工表皮片的应用

本发明还涉及通过本发明方法制备获得人工表皮片的应用。

在本发明的一个示例性实例中，涉及由本发明方法制备获得的人工表皮片在制备用于治疗以皮肤黑素细胞缺失为特征的疾病的施用套件的应用。在一个实例中，所述以皮肤黑素细胞缺失为特征的疾病是白癜风。在一个具体实例中，所述白癜风是节段型白癜风。在另一个具体实例中，所述白癜风是全身型白癜风。

在一个实例中，所述施用套件通过如下方式施用：先对患者的患部表皮进行打磨，然后将此人工表皮片移植到该患部。

在本发明的另一个示例性实例中，涉及由本发明方法制备获得的人工表皮片在针对皮肤疾病相关的药物或化妆品所进行的研发筛选中的应用。

在一个实例中，将用于皮肤疾病相关的药物或化妆品的测试化合物或组合物施加至由本发明方法制备获得的人工表皮片，并通过判断该化合物或组合物能否促使皮片中的表皮细胞或黑素形成细胞的增殖(或减少)，来对所述测试化合物或组合物进行研发筛选。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.组织采集

以下操作均在完全无菌的状态下进行。

组织来源为一名62岁女性。获取其美容整形手术时从脸部切除的废弃皮肤组织中面积约2.0cm²的全层，将其浸渍在碘消毒剂中消毒30秒，然后用pbs(上海源培生物科技股份有限公司)溶液清洗3次。洗干净后放置于采用孔径<1μm的滤网滤过的70％酒精溶液中，持续30秒，再次灭菌。然后使用pbs溶液(ph7.4)另清洗3次。洗干净后的组织用灭菌手术剪和镊子切割，只保留含有毛囊的区块，进一步除去皮下及真皮结缔组织，再用手术剪剪碎成约1mm²大小的碎片。

实施例2.酶溶液浸渍处理

(i)酶溶液浸渍工程1

制备包含10μm的rock抑制剂(y-27632，和光纯药工业株式会社)和22u/ml的分散酶(diapase，gibco)的pbs溶液，制得工程1酶溶液。将如上所述采集并经预处理的组织浸入预先冷却到4℃的5ml如上制备的工程1酶溶液中，在4℃静置过夜，进行采集组织的酶处理。

(ii)酶溶液浸渍工程2

将trypleexpress酶溶液(1×)(购自thermofisherscientific公司)用pbs5倍稀释，并以10μm的浓度添加y-27632，制得工程2酶溶液。将工程1得到的酶处理掺混物离心，弃去上清液，随后立即添加5ml工程2酶溶液使组织沉淀重悬，37℃放置20分钟。

(iii)酶溶液浸渍工程3

在dmem培养液中制备i型胶原酶(collagensetypei，gibco)溶液(1400u/ml)，并添加抗菌剂1μg/ml的红霉素erythromycinabbot公司)和10u/ml的gentasin(辰欣药业)，制得工程3抗菌剂-酶溶液。将上述酶溶液浸渍工程2得到的酶处理掺混物离心，弃去上清液，随后立即添加20ml的工程3抗菌剂-酶溶液(37℃温热)，并用磁力搅拌器(500rpm)37℃搅拌1.5小时，获得均匀掺混物。

实施例3.抑制剂溶液浸渍处理

抑制剂溶液：在pbs中以2mg/ml调配胰蛋白酶抑制剂(trypsininhibitor(大豆)，sigma)溶液。

采用100μm的尼龙滤网过滤经过酶溶液浸渍处理所得的均匀掺混物，保留滤液，清除未消化残渣。用40mlpbs漂洗先前所用的酶处理容器，并进一步漂洗过滤网，将所得漂洗液和上述滤液合并，离心，取得细胞沉淀。

用40ml的pbs对所得细胞沉淀进一步漂洗，随后离心。然后将得到的细胞沉淀浸入5ml预先配制的抑制剂溶液中，重悬，并常温放置10分钟。

实施例4.细胞培养

(i)初代增殖培养

以下是增殖培养液的具体配方：将基本培养用的mcdb153颗粒状培养液(sigma公司)置入1l注射用蒸馏水中溶解，添加1.8g的碳酸氢钠后进行过滤灭菌。然后，添加33.3ml的液体培养液dmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium，sigma公司)。之后，添加经过灭菌处理的以下物质至所示浓度：

rh-胰岛素(version16公司)(5mg/l)、人全铁转铁蛋白(holo-humantransferrin，sigma公司)(5mg/l)、cd脂质浓缩物(gibco公司)(1ml/l)、l-抗坏血酸-2-磷酸酯(sigma公司)(50mg/l)、rhkgf/fgf7(prospec公司)(10μg/l)、rhegf(r&d系统公司)(20μg/l)、rhfgf2(peprotech公司)(10μg/l)、y-27632(wako公司)(5mg/l)、b-27supplementxenofreects(gibco公司)(10ml/l)、acth(1-24)(人)(wako公司)(1nm)、1α,25-二羟基维生素d3(sigma公司)(10^-11m)、红霉素(erythromycin，wako公司)(0.5mg/l)、硫酸庆大霉素(gentamicinsulfate，10,000u/l，辰欣药业)、制霉菌素(nystatin，1μg/l，lkt-lab)。

初代培养时使用6孔板(costar3335：corningcellbind表面)。离心去除上述抑制剂溶液，向沉淀添加12ml培养液，使细胞重悬。所述培养液含有10μm的y-27632。然后，以2ml细胞悬液/孔将细胞接种至6孔板的孔中。接种2天后，每孔添加包含10μmy-27632的2ml培养液。培养第4天，再次向每孔添加2ml的包含10μmy-27632的培养液。培养第6天，各孔保留1ml培养液，将剩余旧培养液吸出并离心，弃去上清后，加入18ml的新鲜培养液使细胞重悬。将所得重悬液以3ml/孔接种。之后的3天按照与上述相同的方法换液。培养到第12天时出现融合，进行以下的传代培养工程。

(ii)细胞传代

以终浓度10μm将y-27632添加至已达到融合的细胞的培养液中，37℃静置30分钟。然后将培养液去除，以2ml/孔添加2％edta/pbs溶液，37℃静置10分钟。然后，以0.5ml/孔添加trypleexpress酶溶液(1×)，37℃静置5分钟。通过正置显微镜确认细胞从孔底部脱离后，使用移液器采集细胞。采集的细胞用离心管收集，用20ml的pbs清洗2次。洗净后，将得到的细胞浸入5ml的抑制剂溶液(胰蛋白酶抑制剂(大豆):2mg/mlpbs)中，常温放置10分钟以上。

(iii)传代后增殖培养

离心去除抑制剂溶液后，将细胞重悬于添加至40ml传代后增殖培养液中。所用传代后增殖培养液是在初代增殖培养液的基础上另添加以下两组分：rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)、rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)。然后以4ml/皿的体积接种到十个细胞培养皿(corning3295细胞培养皿：60mm×15mm；cellbind表面)中。37℃放置3天，保留1ml/孔培养液，旧培养液经离心去除上清，将细胞重悬

在4ml/孔的新鲜传代培养液中，对重悬液进行再接种，再培养。培养第7天达到融合，进行界面培养(具体于实施例5中描述)。保留两个培养皿进行分化培养。

(iv)分化培养工程1

分化培养液配方：在dmem培养液(sigma公司)中添加acth(wako公司)1μm、胰岛素(version16公司)(5mg/l)、人全铁转铁蛋白(sigma公司)(5mg/l)、1α,25-二羟基维生素d3(sigma公司)(10^-11m)，调制而成。

增殖培养液(-)：按照与上文关于初代增殖培养液所述相同的方式配制，不同之处在于不含kgf和egf(即不含先前所用的rhkgf/fgf7(prospec公司)(10μg/l)、rhegf(r&d系统公司)(20μg/l))。

去除达到融合的细胞培养皿中的旧培养液，将分化培养液:增殖培养液(-)按照1:1的体积比以总添加体积4ml/皿添加至培养皿中，开始分化培养。观察到分化第1天细胞出现间隙，分化第2天增殖细胞的间隙消失。

(v)分化培养工程2

分化第3天，确认皿底部细胞间隙消失。去除旧培养液后，将分化培养液:增殖培养液(-)按照2:1的体积比以总添加体积4ml/皿添加至培养皿中，进行分化。

(vi)分化培养工程3

分化第5天，除去旧培养液。将分化培养液:增殖培养液(-)按照3:1的体积比以总添加体积4ml/皿添加至培养皿中，再进行分化。

(vii)分化培养工程4

分化第7天，除去旧培养液。将分化培养液:增殖培养液(-)按照全部为分化培养液的体积比以总添加体积4ml/皿添加至培养皿中，进行最终分化。分化第8天终止分化。

实施例5.界面培养工程和分化时的1α,25-二羟基维生素d3浓度的研究

传代培养时，使用与先前记载的传代培养工程相同的方法从融合的两个培养皿中获取细胞，接种至两个界面培养滤网上。进行上文记载的分化培养工程。其中，分化培养工程1是在界面下进行培养；从分化培养工程2开始在界面进行培养；分化培养工程4的培养时间有所延长(即从第7天-第8天延长为第7天-第11天)，共计进行了11天的分化培养工程，进行比较研究。

结果表明，在界面培养分化时，将1α,25-二羟基维生素d3浓度值设定在10^-9m也可培养出皮片，但在10^-11m的情况下，可以培养出较为理想的较厚的人工表皮片(参见图1，图1所示为皮片截面，左右二图放大倍数相同)。

实施例6.人工表皮片的采取

除去最终分化完结的细胞的培养液，然后将剩余的细胞皮片物质浸入分散酶(dispase)溶液(4ml/皿，gibco)中，37℃放置1小时。当细胞皮片物质处于可剥离状态时，使用经灭菌的镊子和尼龙膜将皮状物剥离。然后，将其转移至医用纱布上，即可作为移植用表皮进行移植。

实施例7.重悬分化细胞的采集

向残留有分化细胞的皿(2ml/皿)中添加y-27632达10μm浓度，37℃静置30分钟以上。去除旧培养液，然后添加trypleexpress酶溶液(1×)(0.5ml/孔)，37℃静置10分钟。然后继续添加trypleexpress酶溶液(1×)(0.5ml/孔)，37℃静置10分钟。随后，通过正置显微镜确认细胞能从底部脱离后，使用移液器采集细胞。将采集到的细胞收集到离心管中，用20ml的pbs清洗2次。洗净后，将获得的细胞浸入5ml的抑制剂溶液中(胰蛋白酶抑制剂(大豆):2mg/mlpbs)，常温放置10分钟以上。

然后，可通过离心分离获得细胞，并使获得的细胞重悬于pbs溶液，作为分化细胞悬液备用。

实施例8.纤维蛋白凝胶预配制

采用医用的fibringluraas-fibrinsealant(人)试剂盒(上海莱士)，配制以下两种液体。

将纤维蛋白原和注射用水置于37℃温热15分钟，然后，将2ml的注射用水添加至纤维蛋白原中，使其溶解。37℃静置20分钟以上，直至确认完全溶解为止，作为纤维蛋白原溶液备用。

将凝血酶原和cacl2溶液在37℃放置15分钟，然后，将2ml的注射用水添加至凝血酶原中，并用移液器反复柔和吹打直至溶解。然后，取该液体的一部分，用pbs稀释500倍，作为经稀释的凝血酶原溶液备用。

实施例9.含有细胞的纤维蛋白凝胶制备

将上文所述获得和采集的分化细胞悬液细胞(如实施例7所述重悬于pbs的细胞悬液)接种于培养皿中(1×10³个细胞/cm²)，向各皿中的细胞添加1920μl的经稀释的凝血酶原溶液(如实施例8所述配制)，使其与皿中细胞混合。然后加入120μl纤维蛋白原制成2ml溶液(如实施例8所述配制)轻轻添加至所有皿中。将皿放置在4℃冷藏过夜。第二天，使用镊子和尼龙膜将含有细胞的纤维蛋白凝胶从皿剥离，其随后可用于移植。图2的照片中显示了置于手背上拍摄的从的培养皿中取出的含有细胞的纤维蛋白凝胶。

实施例10.对细胞皮片中的黑素形成细胞进行dopa染色确认

通过dopa染色确认细胞皮片(如实施例6制备)中的黑素形成细胞是否存在。

首先，将3.3g的nah2po4·2h2o和28.7g的na2hpo4·12h2o添加至1l的蒸馏水中，溶解后制成dopa用缓冲液。然后，将0.1g的dopa(3,4-二羟基-l-苯丙氨酸，sigma公司)添加至100ml的dopa用缓冲液中，并使用搅拌器进行30分钟搅拌直至完全溶解。将剥离获得的细胞皮片样品浸入该dopa溶液中，37℃静置2小时。接下来使用dopa用缓冲液清洗样品3次，然后再次将样品浸入dopa用缓冲液中，50℃静置2小时。完成后，使用显微镜观察确认黑素形成细胞的情况。

实施例11.分化方法的研究1

将按上文记载的经扩增培养的细胞分为两组：第一组为多阶分化组(g)，其按照实施例4的分化培养工程1-4的顺序培养；第二组为单阶分化组(s)，其仅采用分化培养工程4中的培养液培养。然后，通过观察dopa染色阳性细胞的出现数来比较判断上述培养方式对于黑素形成细胞的形成是否有影响。

结果可参见图3。图3显示了多阶分化、vd浓度和传代次数对于黑色素形成细胞数的影响。其中，多阶分化组中的dopa阳性细胞远多于单阶分化组中的dopa阳性细胞，说明按实施例4中所述的多阶分化(分化培养工程1-4)的顺序培养所获得的黑素细胞数量明显居多。并且，分化时，无论是10^-11m还是10^-9m浓度的1α,25(oh)2vd3均未对黑素细胞数量产生显著影响。仅多阶分化的角质形成细胞发生多层化。且p1代培养物的黑素细胞数量大于p2代培养物。

此外，还确认了在多阶分化组中，传代1代(p1)的细胞中观察到的角化细胞多层化明显多于传代2代(p2)的细胞。而在单阶分化组中未出现角化细胞多层化。

实施例12.分化方法的研究2

使用按上文记载的培养至完成实施例4的步骤(i)的细胞。以只采用按照上文所述培养传代1代细胞作为“对照样品”；采用培养中添加rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)和rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)这两种细胞因子的细胞作为“细胞因子添加样品”；以在添加了上述两种细胞因子之外另添加10^-11m的维生素d3(vd3)的细胞作为“细胞因子+维生素d(vd)添加样品”。细胞融合时，使用与上文所述多阶分化相同的条件进行分化培养。分化培养后，使用dopa染色和he染色对各样品的黑素形成细胞的成熟度进行比较。

结果如图4显示，相比对照样品(a)，细胞因子添加样品(b)中黑素形成细胞的成熟度更高，而细胞因子+vd添加样品(c)中的结果比细胞因子添加样品更好。另外，显示对照样品中的未成熟黑素细胞形成了球状体，由此可以判断，在形成成熟的黑素细胞时，向传代1代的细胞添加细胞因子和vd是很有效的。

实施例13.分化方法的研究3

使用按上文记载的培养至完成实施例4的步骤(i)的细胞进行分化。以只采用培养液培养的传代1代细胞作为“对照样品”；以培养中添加rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)和rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)这两种细胞因子的细胞作为“细胞因子添加样品”；以在添加了10^-11m的vd3的细胞作为“vd添加样品”。细胞融合时，使用与上文所述多阶分化相同的条件进行分化培养。分化培养后，使用dopa对各样品的黑素细胞进行染色，在实体显微镜下拍照，并观察经染色的黑素细胞的出现频率。

结果如图5所示，按照黑素细胞数量的多少排序为：细胞因子添加样品＞vd添加样品＞对照样品，这表明添加细胞因子和vd3的均有利于提高黑素细胞的出现频率。

实施例14.分化方法的研究4(acth的效果)

使用按上文记载培养的细胞。分化时，将细胞分为1μmacth添加样品和无添加样品(对照样品)，使用倒置显微镜观察分化工程1阶段的细胞。

结果显示，acth添加样品的细胞尺寸比无添加样品的细胞小1/4以上(参见图6)，这表明acth维持角质形成细胞的基底细胞状态。

实施例15.分化方法的研究5(胰岛素、全铁转铁蛋白对分化的影响)

使用按上文记载的培养至完成实施例4的步骤(i)的细胞。分化时，在添加1μmacth的基础上，共同添加5mg/l胰岛素(version16公司)和5mg/l人全铁转铁蛋白(sigma公司)至分化培养液中。

实验结果表明，上述物质的添加得到的结果(图7)与应用血清所得的结果(未显示)相同。因此，采用本发明的细胞培养法能够实现通过无血清培养形成角质形成细胞多层化的效果。

实施例16.分化方法的研究6(细胞因子对酪氨酸酶活性的影响)

根据上文所述方法处理获自人胸部和包皮区域的皮肤，分离并获得黑素形成细胞。研究来自以下这三种细胞因子rhscf(gibco公司)(10μg/l)、rhwnt-3a(stemrd公司)(10μg/l)、内皮素-1(wako公司)(10μg/l)对酪氨酸酶活性的影响。

结果如图8((a)：wnt+scf；(b)：scf+内皮素)所示，表明添加wnt+scf的效果更佳。此外，dopa染色实验显示，细胞因子添加的效果优异程度排序为：wnt+scf>单独添加scf、内皮素或wnt>wnt+内皮素>scf+内皮素。

实施例17.比较不同部位采集的皮肤组织的黑素细胞的数量

按照前文记载的方法对源自人包皮或胸部的皮肤进行处理、培养、分化。通过dopa染色研究黑素细胞的数量差异。

结果表明，源自包皮皮肤的黑素细胞明显多于源自胸部皮肤的黑素细胞。因此，可以判定从身体不同部位采集的皮肤进行培养的结果是有差异的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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