专利名称：一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法
技术领域：
本发明涉及一种洋葱表皮细胞遗传转化的方法，特别涉及一种利用农
杆菌"gra^cfeWwm mme/ac/ms)介导的简便、高效地4每外源基因转化进 入洋葱鳞茎叶内表皮细胞内的转化方法。
背景技术：
洋葱鳞茎叶内表皮因具有取材方便，细胞结构明显，透明，无叶绿体 干扰，便于观察，可进行活体检测等优点，被作为植物遗传转化受体，广 泛应用于蛋白的亚细胞定位，启动子活性检测，以及细胞动态生理活动等 方面的研究，近年来，随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展，通过洋 葱表皮细胞作为受体来研究基因、蛋白质、启动子等的功能和特性逐渐成 为分子生物学研究的一个热点。
目前，对洋葱表皮细胞的遗传转化均采用的是粒子轰击转化法。但粒 子轰击转化法需要贵重的基因枪设备，需要昂贵的金粉作为载体材料，而 且，该转化方法受多种理化和生理因素影响，转化效率低，转基因植物常 出现非正常整合的嵌合体。另外，操作者所使用的组织材料和转化系统不 完全相同也增加了实验的不确定因素，难度以及成本。这些因素极大地限 制了洋葱表皮细胞在细胞生物学和分子生物学研究中的实际运用。
发明内容
为了克服现有的粒子轰击法转化洋葱表皮细胞的难度大、成本高、仪 器设备要求高等问题，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的洋葱表皮 细胞转化方法。该方法只需常规的菌株和培养基，无须昂贵的实验设备和 金粉等载体材料，而且操作简便易行，实验成本低，转化频率高，拷贝数 少，遗传表达稳定性较好，实验周期短。
本发明的目的通过下述技术方案来实现 一种农杆菌介导的洋葱表皮 细胞转化方法，包括如下步骤
(1) 在无菌环境中，除去洋葱鳞茎外层的3 5层鳞片叶，将洋葱鳞 茎消毒后用无菌水洗涤干净，切开洋葱鳞茎，取中层靠近鳞茎内部的鳞茎 叶，撕下洋葱单层内表皮块。
(2) 含有农杆菌的渗透培养基的配制将含待转化质粒的农杆菌菌株
接种至YEB液体培养液中，28'C振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌 菌体，并重悬于预冷至4'C的渗透培养基中，使该含有农杆菌的渗透培养基 浓度在OD600=0.2 1.5左右；所述渗透培养基为MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N吗啡啉乙磺酸。
(3) 转化将洋葱单层内表皮块浸浮在上述含有农杆菌的渗透培养基 中，使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触5 30分钟进行转化后，夹起 洋葱单层内表皮块，滤干菌液后平铺于MS固体培养基，于25t:, 16小时 光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养16 24小时。
为了更好地实现本发明，所述洋葱鳞茎消毒是采用75%乙醇消毒。而 且，在常规的渗透培养基成分(MS培养基+100mMol/L乙酰丁香酮)的基 础上添加了 10mM MgCl2和2-N吗啡啉乙磺酸进行优化，能进一步保存从 鳞茎剥离下来的鳞茎叶表皮细胞的生理活力，提高其转化效率。
所述农杆菌菌株为LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株，通过 上述这些农杆菌作为携带载体，在农杆菌感染带有伤口的洋葱单层内表皮 块时，将与GFP、 YFP或GUS等报告基因融合的外源基因或启动子序列导入 洋葱表皮细胞。
为了使洋葱表皮细胞的转化效果最为稳定和高效，特别优选步骤(2) 使该含有农杆菌的渗透培养基浓度为OD幼()-l.O，优选步骤(3)使农杆菌 与洋葱单层内表皮块充分接触20分钟进行转化。
所述YEB液体培养液包括YEB+125ug/ ml链霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平 霉素+100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml庆大霉素+50 ug/ml卡 那霉素+100mMol/L乙酰丁香酮。
本发明原理是农杆菌是普通存在于土壤中的一种革兰式阴性菌，在 自然条件下可以感染植物的受伤部位，产生冠瘿瘤或发状根，这是一种天 然的植物遗传转化体系。农杆菌有两种含有Ti质粒的根癌农杆菌与含有 Ri质粒的发根农杆菌。Ti质粒是存在于根癌农杆菌细胞核处的一种双链环
状DNA分子，在低于3(TC情况下，可稳定地存在于根癌农杆菌中。农杆 菌Ti质粒是一个常用的工程质粒载体，介导转化率很高。改造后的无害Ti 质粒，可以携带任何DNA序列进入被根癌农杆菌感染的植株，不会形成肿 瘤。T-DNA区和致瘤区是Ti质粒最重要的两个区域，T-DNA是Ti质粒中 唯一能与植物染色体整合的序列，而致瘤区中的一系列基因则起辅助整合 的作用。Ti质粒自身带有合成冠瘿碱的相关基因，能合成正常植物内没有 的冠瘿碱。根癌农杆菌转入植物细胞的一部分Ti质粒与植物基因组整合， 致使植物形式肿瘤。农杆菌转入植物的DNA片段称为转移DNA。只需将 目的基因插入改造的转移DNA区，通过农杆菌感染，即可以实现外源基因 向植物细胞的转移与整合，经过细胞的组织培养，即可观测到外源基因在 受体植物细胞中的表达。农杆菌介导才先在双子叶植物中应用，在单子叶 植物中运用较晚。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果
本发明所提供的方法不依赖于基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵 的实验载体材料，仅需一个超淨工作台以及相关农杆菌菌株就能在最简单 地实验环境下实现洋葱表皮细胞的高效转化，全过程4天，{氐成本，洋葱表 皮细胞的转化效率达80%。
图1为本发明的农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法用于检测pasr启 动子活性图。
图2为本发明的农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法用于检测 MpASR-GFP蛋白的亚细胞定位图。
图3为农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化与GUS报告基因联合使用研究 启动子活性。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。
实施例一农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法用于启动子活性鉴定 (1)选取新鲜而且生长状况良好的洋葱鳞茎，在超淨工作台的无菌环
境中，除去洋葱鳞茎外层的3 5层鳞片叶，将鳞茎于75%乙醇中浸泡处理 IO分钟，用无菌水洗漆3次。用无菌解剖刀十字形切开洋葱鳞茎，取中层 靠近鳞茎内部的鳞茎叶，在内表皮(凹面)用刀片轻轻划出面积约为lcm2的 小方块，然后用镊子轻轻将洋葱单层内表皮块撕下。
(2) 以启动子pasr为研究对象，检测启动子序列的启动子活性。将启 动子序列和GFP报告基因的ORF序列连入pCAMBIA1391Z载体，构建包 含启动子序列和GFP报告基因的启动子植物表达载体 pCAMBIA1391Z-pasr-g^。将该载体导入农杆菌GV3101菌株，将经鉴定为 阳性的克隆按照1 : 100的体积比接种至200ml YEB液体培养液中(含有 50ug/ml庆大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，分成三 分重悬于4。C预冷的渗透培养基中(含MS， 10mM MgCl2， 100mMol/L乙 酰丁香酮，0.01% (W/V) 2-N吗啡啉乙磺酸)，使OD柳值分别为0.2、 1.0、 1.5。
(3) 将撕下的洋葱单层内表皮块分别浸浮在OD6。o二0.2、 1.0、 1.5的 上述渗透培养基重悬的菌液(含MS， 10mMMgCl2， 100mMol/L乙酰丁香 酮，0.01% (W/V) 2-N吗啡啉乙磺酸)中，使农杆菌与洋葱单层内表皮块 充分接触进行转化后，间或轻轻摇动，接触(转化)时间^^别对应为30分 钟、20分钟和5分钟，然后用镊子轻轻夹起洋葱内表皮块一角，稍滤干菌 液，以贴近鳞片叶肉的一面朝下，平铺于MS固体培养基，将转化后并平 铺于MS固体培养基的洋葱单层内表皮块于25°C， 16小时光照/8小时黑暗 的培养条件中进行共培养。
(4) 共培养20小时后用镊子轻轻取出洋葱单层内表皮块，用无菌液 体MS培养基洗涤以去除可能附着的培养基碎块及菌液，压片法制片，采 用共聚焦荧光显微镜，在激发波长为488 nm左右，发射波长为500 570 nm 左右观察洋葱表皮细胞中GFP的表达水平，以检测启动子pasr的活性，结 果显示，启动子pasr具有启动子活性，能驱动报告基因GFP在洋葱表皮细 胞中表达，且转化效率在80%以上。检测结果如图l所示。其中，A,、 A2、 A3分别为OD6()()=0.2转化时间为30分钟；OD6(K)=1.0转化时间为20分钟； OD6Q。=1.5转化时间为5分钟条件下的转化结果。
实施例二农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法用于石开究蛋白质的亚 细胞定位
(1) 选取新鲜而且生长状况良好的洋葱鳞茎，在超淨工作台的无菌环
境中，除去洋葱鳞茎外层的3 5层鳞片叶，将鳞茎于75%乙醇中浸泡处理 IO分钟，用无菌水洗涤3次。用无菌解剖刀十字形切开洋葱鳞茎，取中层 靠近鳞茎内部的鳞茎叶，在内表皮(凹面)用刀片轻轻划出面积约为lcm2的 小方块，然后用镊子轻轻将洋葱单层内表皮块撕下。
(2) 将经鉴定为阳性携带pCAMBIA1301-MpASR-GFP质粒的农杆菌 LBA4404按照1 : 100的体积比接种至50ml液体YEB液体培养液中(含 125ug/ml链霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，并重悬 于渗透培养基(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N吗啡啉乙磺酸)中，使OD60(p1,0。
(3 )将撕下的洋葱单层内表皮块浸浮在上述含有菌体的渗透培养基的 菌液(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N吗啡 啉乙磺酸)中，间或轻轻摇动。使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触20 分钟进行转化后，用镊子轻轻夹起洋葱单层内表皮块一角，稍滤干菌液， 以贴近鳞片叶肉的一面朝下，平铺于MS固体培养基并于25"C， 16小时光 照/8小时黑暗的培养条件中进行共培养。
(4)共培养16小时后用镊子轻轻取出洋葱单层内表皮块，用无菌液 体MS培养基洗涤以去除可能附着的培养基碎块及菌液，压片法制片，采 用共聚焦荧光显微镜，在激发波长为488 nm左右，发射波长为500 570 nm 左右进行观察，发现MpASR-GFP定位于细胞核内且转化效率达80%以上， 检测结果如图2所示。其中，Bl、 B2、 B3分别为用于检测MpASR-GFP蛋 白的亚细胞定位的荧光、白光下电镜图及其叠加图。
实施例三农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化与GUS报告基因的联合使
用
(1)选取新鲜而且生长状况良好的洋葱鳞茎，在超淨工作台的无菌环 境中，除去洋葱鳞茎外层的3 5层鳞片叶，将鳞茎于75%乙醇中浸泡处理 IO分钟，用无菌水洗涤2次。用无菌解剖刀十字形切开洋葱鳞茎，取中层
靠近鳞茎内部的鳞茎叶，在内表皮(凹面)用刀片轻轻划出面积约为lcm2的 小方块，然后用镊子轻轻将洋葱单层内表皮块撕下。
(2) 将gw报告基因与启动子pfl^相连接构建植物表达载体 pCAMBIA1391Z-pasr-gus,并转入农杆菌EHA105菌株。在YEB液体培养 基(含有50mg/L卡那霉素，125mg/L链霉素和100mMol/L乙酰丁香酮) 中，28i:振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心IO分钟收集菌体， 并重悬于渗透培养基中(MS+10mMMgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01%
(W/V) 2-N吗啡啉乙磺酸)，使00600=1.0。
(3) 将撕下的洋葱单层内表皮块浸浮在上述含有菌体的渗透培养基的 菌液中，使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触20分钟进行转化后，用镊 子轻轻夹起洋葱单层内表皮块一角，稍滤干菌液，平铺于MS固体培养基， 25°C， 16小时光照/8小时黑暗的培养条件中进行共培养，共培养24小时后， 采用荧光显微镜进行观察，转化效率达80%以上，检测结果如图3所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1、一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于包括如下步骤(1)在无菌环境中，除去洋葱鳞茎外层的3～5层鳞片叶，将洋葱鳞茎消毒后用无菌水洗涤干净，切开洋葱鳞茎，取中层靠近鳞茎内部的鳞茎叶，撕下洋葱单层内表皮块；(2)含有农杆菌的渗透培养基的配制将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预冷至4℃的渗透培养基中，使该含有农杆菌的渗透培养基浓度在OD600＝0.2～1.5；所述渗透培养基为MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01％2-N吗啡啉乙磺酸；(3)转化将洋葱单层内表皮块浸浮在上述含有农杆菌的渗透培养基中，使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触5～30分钟进行转化后，夹起洋葱单层内表皮块，滤干菌液后平铺于MS固体培养基，于25℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养16～24小时。
2、 根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特 征在于所述洋葱鳞茎消毒是采用75%乙醇消毒。
3、 根据权利要求l所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特 征在于所述农杆菌菌株为LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株。
4、 根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于步骤(2)使该含有农杆菌的渗透培养基浓度为OD6oo-1.0。
5、 根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特 征在于步骤(3)使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触20分钟进行转化。
6、 根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特 征在于所述YEB液体培养液包括YEB+125ug/ ml链霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml庆大霉素+50 ug/ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，该方法将洋葱单层内表皮块浸浮在含有农杆菌的渗透培养基中，使农杆菌与洋葱内表皮块充分接触5～30分钟进行转化后，夹起洋葱表皮块，滤干菌液后平铺于MS固体培养基，于25℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养16～24小时。本发明不依赖于基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，仅需一个超淨工作台以及相关农杆菌菌株就能在最简单地实验环境下实现洋葱表皮细胞的高效转化，全过程4天，低成本，洋葱表皮细胞的转化效率达80％。
文档编号C12N15/82GK101113458SQ20071002887
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者刘海燕, 梁炫强 申请人:广东省农业科学院作物研究所