专利名称：一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种多倍体鳞茎的诱导方法，特别是涉及一种以卷叶贝母鳞片叶为外 植体的多倍体鳞茎诱导方法。
背景技术：
川贝母药材为百合科植物卷叶贝母F. cirrhosa、暗紫贝母F. unibracteata、甘肃 贝母F.przew alskii Maxim.及梭砂贝母F. delavayiFranch.的干燥鳞莲，为著名的川产 道地药材之一，以鳞茎入药。卷叶贝母植株对生长环境要求苛刻，它喜冷阴气候条件，具有 耐寒、喜湿、喜荫蔽、怕高温的特性。气温达到30°C或地温超过25°C，植株就会枯萎，在海拔 低、气温高的地区不能生存，所以卷叶贝母在海拔3500m-4500m的高度才能正常生长。卷叶 贝母由于受生长条件的限制，再加之近年来无计划盲目的采挖，其自然资源日趋枯竭，预计 在近几十年内也难以缓解。组织培养技术生长周期短，繁殖率高，摆脱了大自然中四季、昼 夜的变化以及灾害性气候的不利影响，对植物生长极为有利，便于稳定地进行培养生产，因 此应用组织培养的方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法 之一。多倍体药用植物由于染色体的加倍，使得植物器官表现出“巨型性”的显著特征， 因而通过多倍体诱导技术可以提高植物药用部位的生物产量，同时由于药用植物染色体数 目加倍，也使得染色体上基因调控有效化学成分的含量较正常二倍体增高，因此培养的多 倍体药材其有效化学成分的含量也明显增加。王强等发表的《秋水仙素诱导川贝母愈伤组织多倍体的研究》(武汉植物学研究 2002. 20(6) :449 452) —文中公开了两种秋水仙素处理方法，一种是秋水仙素加入培养 基处理法，另一种是秋水仙素溶液浸泡处理法，他们得出的结论是秋水仙素溶液浸泡处理 法对愈伤组织的伤害较直接，其加倍效果不如秋水仙素加入培养基处理法好。事实上，只要 对产生的愈伤组织进行适当处理，可大大地减轻秋水仙素溶液对愈伤组织的伤害，其多倍 体的诱导率远高于文中所提到的70%。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法， 该方法由于对新产生的愈伤组织进行了预分化的培养处理，使得秋水仙素溶液对处理后的 愈伤组织伤害作用大大地减轻，从而提高了其多倍体的诱导率。为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤(1)选择卷叶贝母的新鲜鳞茎的鳞片叶作为外植体；(2)剥取上述鳞茎内层中无病和无机械损伤的鳞片叶，先用洗衣粉液洗净后于流 水下冲洗25 30min，再用2. 0%次氯酸钠溶液漂洗12 15min，用清水洗净并吸干水后， 将其放入0. 升汞溶液中消毒7 lOmin，然后用无菌水冲洗2 3次，再用无菌滤纸吸 干表面的水分，最后将其接入诱导愈伤组织的培养基中进行诱导培养，诱导初期采用12 15天的暗培养；(3)将(2)步骤获得的新生、质地较疏松愈伤组织接入预分化培养基 MS+6-BA2. Omg · L^+NAAO. 0 0. 3mg · Γ1中培养获得紧密愈伤组织；(4)将(3)步骤获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块，浸泡于已过滤灭菌的秋 水仙素溶液中，处理后用无菌水洗2 3次，再用无菌滤纸吸干水后，接入不含有秋水仙素 的MS+6-BA1. Omg · I^+NAAO. 0 0. 3mg · Γ1分化培养基中进行诱导多倍体鳞茎培养；上述所有培养基的配制PH值为5.6 6. 5、蔗糖30 50g · L—1、琼脂6. 0 7. Og · I71。上述培养条件均为温度15 24°C、每天光照8 16小时、光照强度为1000 18001x。上述(2)步骤中所采用的诱导愈伤组织的培养基为MS+6-BA0. 1 2. Omg · I^+IAAO. 4 1. 5mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 琼月旨 6. 0 7. Og · L-1 或 MS+6-BA2. Omg · I^+NAAO. 4 1. Omg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 琼脂 6. 0 7. Og · I71。上述⑷步骤中所采用的秋水仙素浓度为0. 01 0. 22%，处理时间为6 72h。本发明是采用秋水仙素溶液浸泡方法诱导多倍体鳞茎。其创新处在于所使用的材 料是在由鳞片叶诱导产生愈伤组织的基础上，再经预分化培养过程获得的有一定分化特征 的紧密愈伤组织，在采用秋水仙素溶液浸泡处理时，可大大减轻药液对材料的伤害，从而提 高了处理材料的存活率和多倍体的诱导率，经测试多倍体鳞茎的诱导率最高可达80.3%。
具体实施例方式实施例1(1)获得卷叶贝母紧密愈伤组织a.选择在四川康定折多山野生抚育基地栽种的卷叶贝母新鲜鳞茎，剥取内 层无病和无机械损伤的鳞片叶，用洗衣粉液洗净后于流水下冲洗30min，再用2%次氯 酸钠溶液漂洗15min，用清水洗净吸干水后，在超净工作台上将处理后的鳞片叶放入 0. 1 %升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干表面水，最后将其接入 MS+6-BAlmg · L^+IAAO. 5mg · L—1+ 蔗糖 30g · L—1+ 琼脂 6. 5g · L-1 的培养基中在温度 18 22°C、每天光照8 16小时、光照强度为12001x的培养条件下进行诱导培养，诱导初期先 进行14天的暗培养；b.将上述获得的新生、质地较疏松愈伤组织转接入 MS+6-BA2. Omg · L^+NAAO. 2mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6. 5g · L-1 的预分化培养基中在温 度18 22°C、每天光照8 16小时、光照强度为12001x的培养条件下，培养40d可获得紧 密愈伤组织；(2)多倍体鳞茎的诱导将获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块放于已过滤灭菌浓度为1500mg. Γ1的 秋水仙素溶液中浸泡处理24h，然后用无菌水洗三次，再用无菌滤纸吸干水，最后接入不含 有秋水仙素的 MS+6-BA1. Omg · L^+NAAO. 3mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6. 5g · L-1 培养基中 进行多倍体鳞茎分化培养，其多倍体鳞茎的诱导率为80. 3% ；(3)多倍体鳞茎的形态学特征
与对照组二倍体鳞茎比较，经秋水仙素诱导处理后产生的多倍体鳞茎在形态上发 生明显的变异，表现在体积明显增大，鳞片叶肥厚包裹紧密不易分开，颜色也较二倍体鳞茎 明显的加深；并且随着培养时间的延长，多倍体鳞茎不会发生明显的抽苗现象，显微观察鳞 片叶表皮细胞中气孔明显增大，但单位面积内的气孔数目却减少；(4)染色体数目测定取诱导组和对照组刚分化出的鳞茎心芽尖于0. 20%秋水仙素溶液中预处理2. 5h 左右，水洗后用甲醇-冰醋酸(3 1)固定液固定4h，再用混合酶(纤维素酶和果胶酶各占 2.5% )在25°C恒温箱内处理3h，倒去酶液，用蒸馏水洗3次，每次2min，去除蒸馏水后，制 备细胞悬液，用悬滴法制片，干燥后用Giemsa染色后观察，结果显示，对照组二倍体鳞茎细 胞的染色体数2η = 2x = 24，而经过多倍体诱导后的卷叶贝母鳞茎细胞染色体数为2η = 4χ = 48，由此可见卷叶贝母鳞茎的多倍体诱导是成功的；(5)总生物碱含量测定。以贝母素乙为标准品(购于中国生物制品检定所)，采用紫外分光光度法测得经 诱导培育的多倍体鳞茎的总生物碱含量为0. 249%，远远高于市售卷叶贝母鳞茎药材川贝 母0. 068%的含量。
权利要求
1. 一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，其特征在于包括下列步骤(1)选择卷叶贝母新鲜鳞茎的鳞片叶作为外植体；(2)剥取上述鳞茎内层中无病和无机械损伤的鳞片叶，先用洗衣粉液洗净后于流水下 冲洗25 30min，再用2. 0%次氯酸钠溶液漂洗12 15min，用清水洗净并吸干水后，将其 放入0. 升汞溶液中消毒7 lOmin，然后用无菌水冲洗2 3次，再用无菌滤纸吸干表 面的水分，最后将其接入诱导愈伤组织的培养基中进行诱导培养，诱导初期采用12 15天 的暗培养；(3)将(2)步骤获得的新生、质地较疏松的愈伤组织接入预分化培养基 MS+6-BA2. Omg · I^+NAAO. 0 0. 3mg · Γ1 中获得紧密愈伤组织；(4)将(3)步骤获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块，浸泡于已过滤灭菌的秋水仙 素溶液中，处理后用无菌水洗2 3次，再用无菌滤纸吸干水后，接入不含有秋水仙素的 MS+6-BA1. Omg · L^+NAAO. 0 0. 3mg · L—1分化培养基中进行诱导培养而获得多倍体鳞茎；上述所有培养基的配制PH值为5. 6 6. 5、蔗糖30 50g .L-1、琼脂6. 0 7. Og .L—1 ；上述培养条件均为温度15 24°C、每天光照8 16小时、光照强度为1000 18001x。
2.根据权利要求1所述的一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方 法，其特征在于上述(2)步骤中所采用的诱导愈伤组织的培养基为MS+6-BA0. 1 2. Omg · I^+IAAO. 4 1. 5mg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 琼脂 6. 0 7. Og · I71。
3.根据权利要求1所述的一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞 茎诱导方法，其特征在于上述(2)步骤中所采用的诱导愈伤组织的培养基为 MS+6-BA2. Omg · I^+NAAO. 4 1. Omg · L-1+ 蔗糖 30 50g · L-1+ 琼脂 6. 0 7. Og · I71。
4.根据权利要求1所述的一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，其 特征在于上述(4)步骤中所采用的秋水仙素浓度为0.01 0. 22%，处理时间为6 72h。
全文摘要
本发明公开了一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，该方法创新之处在于所使用的材料是在由鳞片叶诱导产生愈伤组织的基础上，再经预分化培养过程获得了有一定分化特征的紧密愈伤组织，将其切成小块后浸泡于秋水仙素溶液中进行多倍体诱变处理，可大大减轻秋水仙素溶液对处理材料的伤害，提高了卷叶贝母多倍体鳞茎的诱导率。
文档编号A01H4/00GK101999317SQ200910164339
公开日2011年4月6日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者代勇, 何宗晟, 孙雁霞, 徐世军, 王晓蓉, 王跃华, 胡胜玲, 薛永新 申请人:薛永新