一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法
【专利摘要】本发明公开了一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，该方法是先将重楼根茎上未萌发的芽体进行消毒和预培养，然后将预培养后体积明显膨大的芽体切去芽鞘，再将芽轴从中央进行纵切后接入愈伤组织诱导培养基中进行培养,接着将由芽轴产生的已愈伤化的组织进行培养获得重楼胚性组织，最后将胚性组织进行诱导培养产生白色圆球形的胚状体。本发明为重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现重楼植物短时间、低成本的大批量生产。
【专利说明】一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重楼植物的组织培养方法，特别是涉及一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法。
【背景技术】
[0002]中国药典规定的中药重楼为漠重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)和华重楼(Paris polyphylla var.chinensis)的地下莖,前者主产于云南,后者主产于四川。《神农本草经》最早记载的蚤休即华重楼。重楼具有清热解毒、消炎止痛、活血化淤、凉肝定惊的功效。
[0003]近年来因发现重楼具有抗病毒、抗肿瘤作用而需求量大增。重楼中药材历来以野生资源提供药用，近年来由于对野生资源的过度采挖，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏，现己濒临灭绝，因而大力开发重楼植物资源具有十分重要的意义。
[0004]目前制约重楼植物规模化栽种的主要问题是重楼种苗的短缺。重楼种子由于存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此播种后通常需要经历两冬一夏才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”，而且在自然状态下，即使经过了长时间休目民，重楼种子的出苗率也不高，因此目前仅靠重楼种子进行有性繁殖已无法满足重楼植物大面积栽种的需要。
[0005]植株胚状体是由构成植物体的细胞在组织培养条件下，通过类似于受精卵形成的合子发育成胚的过程而形成的体细胞胚体。胚状体具有植物胚的特性，在条件允许的情况下可快速生长为再生植株，可有效解决重楼种苗短缺的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，该方法诱导产生的胚状体，在适当的条件下可快速生长为再生植株，从而可实现重楼再生植株的快速繁殖。
[0007]本发明提供的以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法包括下列步骤:
[0008](I)取重楼根茎上生长健壮、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后进行消毒处理，接着用无菌水震荡洗涤后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于预培养基MS+6-BA0.5~3.0mg.L-1+水杨酸20~80mg.L4中，在培养温度为16~22°C、每天光照6~14小时、光照强度为1000~20001x的条件下进行预培养；
[0009](2)选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴进行纵切，将切开的芽轴的纵切面接入愈伤化诱导培养基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中，在培养温度为 12 ~26。。、每天光照4~16小时、光照强度为1000~20001x的条件下进行培养；
[0010](3)将由 芽轴产生的已愈伤化的组织切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~
2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L-1培养基中，在培养温度为16~28°C、每天光照8~12小时、光照强度为1200~25001x的条件下进行培养，培养25~45天继代一次，连续进行2~4次继代培养，获得重楼胚性组织；
[0011](4)将重楼胚性组织切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~
4.0mg.+IAA0.5~2.0mg.L—1+头孢噻肟钠100~400mg.L—1培养基中，在培养温度为5~10°C、每天光照2~6小时、光照强度为400~1000lx的条件下进行培养，培养50~70天后，在胚性组织表面产生白色圆球形的胚状体。
[0012]上述所有培养基还包括琼脂5.0~7.0g.L-1和蔗糖20~60g.?Λ培养基的pH值为5.6~6.5、
[0013]上述步骤(1)中所述消毒处理是指在超净台上先用浓度为70%~75%的酒精消毒10~60s，再用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
[0014]本发明首次提出了以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，该方法在一定程度上解决了重楼植物大规模栽种时对种源需求的问题，为重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现重楼短时间、低成本、大批量生产。
[0015]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
[0017](I)预培养:取重楼根茎上生长健壮、芽体直径在0.5cm以上、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后在超净台用浓度为70%的酒精消毒10s，再用浓度为0.1%的升汞消毒4min，接着用无菌水震荡洗涤3次后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于预培养基MS+6-BA0.5mg.I71+水杨酸20mg.L4中，在培养温度为16°C、每天光照6小时、光照强度为lOOOlx的条件下进行预培养，培养20天统计，芽体膨大率为78.93%，染菌率为20.23% ；
[0018](2)芽轴细胞愈伤化诱导:选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴从中央进行纵切，再将切开的芽轴的纵切面接入愈伤化诱导培养基 MS+6-BA0.5mg.I^+NAA0.5mg.^+2,4-01.0mg.L-1 中，在培养温度为 12°C、每天光照 4小时、光照强度为lOOOlx的条件下培养50天，观察并统计出有72.84%的芽轴产生了愈伤化；
[0019](3)胚性组织的产生:将由芽轴产生的已愈伤化的组织切成Icm3的大小接入LS+6-BA0.5mg.L-'+ΝΑΑΟ.5mg.L-1培养基中，在培养温度为16°C、每天光照8小时、光照强度为12001x的条件下进行培养，培养25天继代一次，连续进行2次继代培养，有41.31%的培养材料产生了胚性组织；
[0020](4)胚状体的产生:选取步骤(3)产生的淡黄白色、分裂能力强的重楼胚性组织，将其切成0.5cm3的大小后接入LS+6-BA2.0mg.L_1+IAA0.5mg.L-1+头孢噻肟钠IOOmg.L-1培养基中，在培养温度为5°C、每天光照2小时、光照强度为4001x的条件下进行培养，培养55天后，有61.86%的胚性组织表面产生了白色圆球形的胚状体；
[0021]上述所有培养基的pH值为5.6，琼脂5.0g.L—1，蔗糖20g.L'
[0022]实施例2
[0023](I)预培养:取重楼根茎上生长健壮、芽体直径在0.5cm以上、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后在超净台先用浓度为75%的酒精消毒40s，再用浓度为
0.1%的升汞消毒8min，接着用无菌水震荡洗涤5次后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于pH值为5.8的预培养基MS+6-BA2.0mg.L—1+水杨酸60mg.L—1+鹿糖^g-T1+琼脂6.0g -T1中，在培养温度为20°C、每天光照8小时、光照强度为15001x的条件下进行预培养，培养20天统计，芽体膨大率为90.3%，染菌率为0% ；
[0024](2)芽轴细胞愈伤化诱导:选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴从中央进行纵切，再将切开的芽轴的纵切面接入PH值为5.8的愈伤化诱导培养基 MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA1.0mg.L_1+2,4-D2.0mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 琼脂6.0g -L-1中，在培养温度为20°C、每天光照8小时、光照强度为15001x的条件下培养60天，观察并统计出有85%的芽轴产生了愈伤化； [0025](3)胚性组织的产生:将由芽轴产生的已愈伤化的组织切成2cm3的大小接入pH值为 6 的培养基 LS+6-BA1.0mg.L^+NAA2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 琼脂 6.0g.L-1 中，在培养温度为20°C、每天光照10小时、光照强度为20001x的条件下进行培养，培养30天继代一次，连续进行3次继代培养，经显微观察，有67.8%的培养材料产生了胚性组织；
[0026](4)胚状体的产生:选取步骤(3)产生的淡黄白色、分裂能力强的重楼胚性组织，将其切成2.0cm3的大小后接入pH值为6的培养基LS+6-BA3.0mg.L^+IAAl.0mg.L-1+头孢噻肟钠200mg.L-1+蔗糖30g.L-1+琼脂6.0g.L-1中，在培养温度为6~I (TC、每天光照4小时、光照强度为6001x的条件下进行培养，培养60天后，有87.6%的胚性组织表面产生了白色圆球形的胚状体，平均每个胚性组织材料上产生4~8个胚状体，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统。
[0027]实施例3
[0028](I)预培养:取重楼根茎上生长健壮、芽体直径在0.5cm以上、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后在超净台用浓度为75%的酒精消毒60s，再用浓度为0.15%的升汞消毒8min，接着用无菌水震荡洗涤6次后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于预培养基MS+6-BA3.0mg.L—1+水杨酸80mg.L-1中，在培养温度为22°C、每天光照14小时、光照强度为20001χ的条件下进行预培养，培养20天统计，芽体膨大率为82.53%,染菌率为0% ；
[0029](2)芽轴细胞愈伤化诱导:选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴从中央进行纵切，再将切开的芽轴的纵切面接入愈伤化诱导培养基 MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA2.0mg.1^+2，4-D4.0mg.L-1 中，在培养温度为 26°C、每天光照 16小时、光照强度为20001x的条件下培养70天，观察并统计出有83.54%的芽轴产生了愈伤化；
[0030](3)胚性组织的产生:将由芽轴产生的已愈伤化的组织切成3cm3的大小接入LS+6-BA2.0mg.-1+ΝΑΑ4.0mg -T1培养基中，在培养温度为28°C、每天光照12小时、光照强度为25001x的条件下进行培养，培养45天继代一次，连续进行4次继代培养，有68.26%的培养材料产生了胚性组织；
[0031](4)胚状体的产生:选取步骤(3)产生的淡黄白色、分裂能力强的重楼胚性组织，将其切成2.5cm3的大小后接入LS+6-BA4.0mg.L^+IAA2.0mg.L-1+头孢噻肟钠400mg.-1培养基中，在培养温度为10°C、每天光照6小时、光照强度为lOOOlx的条件下进行培养，培养65天后，有84.15%的胚性组织表面产生了白色圆球形的胚状体；
[0032]上述所有培养基的pH值为6.5，琼脂7.0g.L-S蔗糖60g.L-1
[0033]实施例4
[0034]将实施例2步骤(1)中所述的预培养基改为pH值为6的MS+6-BA0.5mg.l-1+水杨酸30mg.L-1+蔗糖30g.L-1+琼脂5.8g.L-1其它步骤同实施例2 ;培养20天后，芽体膨大率为81.13%。
[0035]实施例5
[0036]将实施例2步骤(2)中的芽轴愈伤化诱导培养基改为pH值为5.8的MS+6-BA2.0mg.L -1NAA0.5mg.L-1+2,4-D1.0mg.L-1+ 鹿糖 20g.L-1+ 琼脂 6.0g.L -1 其它步骤同实施例2，培养60天后，观察并统计出有77%的芽轴产生了愈伤化。
[0037]实施例6
[0038]将实施例2步骤(4)中的诱导重楼胚状体产生的培养基改为pH值为6的LS+6-BA4.0mg.L-1+IAA1.0mg.L-1+ 头抱噻月亏钠 400mg.L-1+ 鹿糖 30g.L-1+ 琼脂 6.0g.L-1,培养60天后，有85.53%的胚性组织表面产生出白色圆球形的胚状体，平均每个胚性组织材料上产生5~8个胚状体。
[0039]比较实施例1
[0040]将实施例2步骤(1)中的芽体改为采用已明显萌发的芽体，其它步骤同实施例2 ；培养20天统计，芽体膨大率40.39%，染菌率为61.71%;
[0041]比较实施例2
[0042]将实施例2步骤(1)中所述的预培养基改为pH值为5的B5+6-BA1.0mg.L-1+2，4-D1.5mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 琼脂 6g.L—1，其它步骤同实施例 2 ;培养20天统计，芽体膨大率43.15%。
[0043]比较实施例3
[0044]在实施例2步骤(2)中，采用不切去膨大芽体上的芽鞘，而是将带芽鞘的芽体纵切后接入培养基中，其它步骤同实施例2 ;培养60天统计，仅有43.52%的芽轴培养材料产生了愈伤化。
[0045]比较实施例4
[0046]将实施例2步骤(2)中芽轴的切割方式改为横切，即将芽轴切为上下两部分后，再将横切面接入培养基中，其它步骤同实施例2 ;培养60天观察发现，接入的芽轴上部分未出现愈伤化，而是表现为一定程度的抽苗；而接入的芽轴下部有35%产生了愈伤化；
[0047]比较实施例5
[0048]将实施例2步骤(3)中的胚性细胞诱导培养基改为pH值为6.5的MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 琼脂 6.0g.L—1，其它步骤同实施例 2 ;培养后经显微观察，只有23.18%的培养材料产生了胚性组织。
[0049]比较实施例6
[0050]将实施例2步骤(4)中的诱导重楼胚状体产生的培养基改为pH值为5的1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+ΙΑΑ2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 琼脂 6.0g.L-1其它步骤同实施例 2 ;培养 60天后，有9.87%的胚性组织表面产生出白色圆球形的胚状体，平均每个胚性组织材料上产生1~3个胚状体。
【权利要求】
1.一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，其特征在于包括如下步骤: (1)取重楼根茎上生长健壮、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后进行消毒处理，接着用无菌水震荡洗涤后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于预培养基MS+6-BA0.5~3.0mg ·L-1+水杨酸20~80mg *L_1中，在培养温度为16~22°C、每天光照6~14小时、光照强度为1000~20001x的条件下进行预培养； (2)选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴进行纵切，将切开的芽轴的纵切面接入愈伤化诱导培养基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中，在培养温度为 12 ~26。。、每天光照4~16小时、光照强度为1000~20001x的条件下进行培养； (3)将由芽轴产生的已愈伤化的组织切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L—1培养基中，在培养温度为16~28°C、每天光照8~12小时、光照强度为1200~25001x的条件下进行培养，培养25~45天继代一次，连续进行2~4次继代培养，获得重楼胚性组织； (4)将重楼胚性组织切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~4.0mg ?L-'+ΙΑΑΟ.5~2.0mg *L-1+头孢噻厢钠100~400mg *L_1培养基中，在培养温度为5~10°C、每天光照2~6小时、光照强度为400~lOOOlx的条件下进行培养，培养50~70天后，在胚性组织表面产生白色圆球形的胚状体。
2.根据权利要求1所述的一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，其特征在于:步骤(1)中所述消毒处理是指在超净台上先用浓度为70%~75%的酒精消毒10~60s，再用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
【文档编号】A01H4/00GK103548683SQ201310529396
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】王跃华, 张珏, 王金鹏, 陈燕, 刘银花, 宋超, 段茂华, 任鹏飞, 杨霞 申请人:成都大学