一种大叶藻野生外植体获取方法
【专利摘要】本发明涉及一种大叶藻野生外植体的获取方法，步骤是：在大叶藻长势旺盛的海域将其植株挖出，就地清洗根、茎上底泥，在室内将克隆幼苗从主枝上折下，放入天然海水中，于光照培养箱中暂养，3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续培养；5天后，选出根状茎含有5个节以上幼苗，于超净工作台上进行修剪；将修剪后的幼苗先用灭菌海水洗3-5次，再放入10％的过氧化氢溶液中浸泡15分钟，灭菌海水再洗5次；将消毒过的幼苗进行再修剪以获得目的外植体，如根尖、茎尖或根状茎，用于接种。本发明保障了大叶藻组织培养中以野生植株为外植体供体时初代培养中的低污染率和低致死率，为大叶藻组织培养的成功提供了最基本的技术支持。
【专利说明】 一种大叶藻野生外植体获取方法
【技术领域】
[0001]本发明所属植物组织培养【技术领域】，涉及一种大叶藻野生外植体的获取方法。
【背景技术】
[0002]大听薇(Zostera marina L.)是全球72种海草的代表种,广泛分布于北半球温带海域，在我国山东、河北和辽宁近海也有分布。虽然许多陆生植物的组织培养技术均已成熟，但作为单子叶植物的海草的组织培养技术却历经四十多年的研究仍无大的突破，其中一个重要的原因就是无合适野生外植体的获取方法。
[0003]虽然因种子对消毒剂的耐受性较强，且实生苗生理年龄最幼，无菌实生苗被认为是大叶藻组织培养的最佳外植体选择，但大叶藻种子产量小、保存时间有限、种子萌发率也存在不确定性，因此，有必要寻求野生外植体的获取方法，以保证大叶藻组织培养外植体获取方法的多样性。
[0004]研究表明，由于大叶藻叶表皮细胞无角质层、叶和茎组织中散布有大量气道、根中也有许多气体空腔，所以以野生植株为组织培养的外植体供体时，消毒剂浓度和消毒时间极难掌握，致使外植体消毒常处于过或不及的两难境地，初代培养也因此多以失败告终。本发明通过对野生大叶藻克隆幼苗进行前期培养并加以有效的表面消毒方法，大大提高了大叶藻野生外植体的有效获得率，目前采用该技术方案的相关专利和文献未见报导。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能保证初代培养中外植体低污染率和低致死率的大叶藻野生外植体获取方法。
[0006]本发明的技术方案为:一种大叶藻野生外植体获取方法，以大叶藻新发出的克隆幼苗为外植体供体，通过对其进行室内预培养后再获取易于消毒的大叶藻野生外植体，其获取的具体步骤如下:
(1)克隆片段的野外采集:选择环境良好、大叶藻长势旺盛的海域，将大叶藻植株挖出，就地清洗根茎上的底泥，将带有多个克隆幼苗的克隆片段在冷藏条件下带回实验室；
(2)克隆幼苗的室内暂养:将克隆片段上的幼苗从主枝上折下，放入装有天然海水的100ml烧杯中，于光照培养箱中培养，3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续于培养箱中培养；
(3)外植体供体选择和修剪:灭菌海水中培养5天后即可进行外植体选择，将根状茎含有5个节以上的克隆幼苗选出，于超净工作台上进行修剪；
(4)外植体消毒:将修剪后的幼苗先用灭菌天然海水冲洗3-5次，放入10%的过氧化氢溶液中浸泡15分钟，用灭菌海水冲洗5次；
(5)外植体再修剪:在接种前，将消毒过的幼苗进行再修剪，以获得目的外植体，如根尖、茎尖或根状茎，用于接种。
[0007]本发明的优点在于:以大叶藻新发出的克隆幼苗为外植体供体，利用了克隆幼苗旺盛的生长特性；通过对其进行室内预培养，大大降低了外植体供体的带菌率，预培养中水温的缓慢变化为供体提供了适应日后培养温度的时间；表面消毒前修剪过的外植体较一般外植体大，不将根、茎和茎尖切下进行独立消毒，增加了外植体对消毒液的耐受力；过氧化氢溶液消毒前略去了常规外植体表面消毒过程中的70-75%酒精浸泡环节，减少了酒精对气孔丰富的水生植物的伤害；过氧化氢溶液残留后分解会变成氧气，无后毒。
[0008]
【具体实施方式】
[0009]本发明所述的一种有效减少污染率的大叶藻无菌实生苗的培养方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0010]实施例1:一种大叶藻茎尖外植体的获取方法，其实施步骤包括:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮时在海域采集大叶藻植株，用铁锨将大叶藻连同根茎一起从底泥中挖出，就地清洗根茎上的底泥，将带有多个克隆幼苗的克隆片段装入塑料自封带冷藏条件下带回实验室；
(2)克隆幼苗的室内暂养:将克隆片段上的幼苗从与主枝连接处折断，并将幼苗端部已开始脱落腐烂的叶片和叶鞘以及一些老根都清理掉，5个一组放入装有天然海水的100ml烧杯中，于光照培养箱中培养，培养条件为:光照强度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，温度最初与种源海域相近(如海域水温低于10°C，则培养箱最低温只能设为10°C)，日后每天升或降1°C，最终接近15°C。3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续于培养箱中培养，在将幼苗放入灭菌海水前要清理脱落叶片，并将根状茎的前端剪去一小截；
(3)外植体选择和修剪:灭菌海水中培养5天后即可进行外植体选择，将根状茎含有5个节以上的克隆幼苗选出，放入空的灭菌大烧杯中，于超净工作台上进行修剪，剪去根状茎前端一个节间，剥去外层老叶，只留里面的3-4片叶，并将叶片前端剪去，留3cm长，只留最幼的两族不定根；
(4)外植体消毒:将修剪后的幼苗放入新的灭菌培养瓶中，用灭菌天然海水冲洗3-5次，用灭菌滤纸将水吸干，再放入10%的过氧化氢溶液(加0.1%吐温,过氧化氢溶液用灭菌海水来稀释配制)中消毒15分钟，再用灭菌天然海水冲洗5次；
(5)外植体再修剪:将根状茎前端的根茎切除一个茎节，可取其茎的节间、节或带节的节间为外植体进行茎培养。
[0011]本实施例所用光照培养箱为上海博讯SPX-250B-G型光照培养箱。
[0012]实施例2:—种大叶藻茎外植体的获取方法，其步骤为:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮时在海域采集大叶藻植株，用铁锨将大叶藻连同根茎一起从底泥中挖出，就地清洗根茎上的底泥，将带有多个克隆幼苗的克隆片段装入塑料自封带冷藏条件下带回实验室；
(2)克隆幼苗的室内暂养:将克隆片段上的幼苗从与主枝连接处折断，并将幼苗端部已开始脱落腐烂的叶片和叶鞘以及一些老根都清理掉，5个一组放入装有天然海水的100ml烧杯中，于光照培养箱中培养，培养条件为:光照强度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，温度最初与种源海域相近(如海域水温低于10°C，则培养箱最低温只能设为10°C)，日后每天升或降1°C，最终接近15°C。3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续于培养箱中培养，在将幼苗放入灭菌海水前要清理脱落叶片，并将根状茎的前端剪去一小截；
(3)外植体选择和修剪:灭菌海水中培养5天后即可进行外植体选择，将根状茎含有5个节以上的克隆幼苗选出，放入空的灭菌大烧杯中，于超净工作台上进行修剪，剪去根状茎前端一个节间，剥去外层老叶，只留里面的3-4片叶，并将叶片前端剪去，留3cm长，只留最幼的两族不定根；
(4)外植体消毒:将修剪后的幼苗放入新的灭菌培养瓶中，用灭菌天然海水冲洗3-5次，用灭菌滤纸将水吸干，再放入10%的过氧化氢溶液(加0.1%吐温,过氧化氢溶液用灭菌海水来稀释配制)中消毒15分钟，再用灭菌天然海水冲洗5次；
(5)外植体再修剪:将叶片进行剥离后，留3-5_长的茎尖为外植体进行培养。
[0013]本实施例所用光照培养箱为上海博讯SPX-250B-G型光照培养箱。
[0014]实施例3:—种大叶藻根外植体的获取方法，其步骤为:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮时在海域采集大叶藻植株，用铁锨将大叶藻连同根茎一起从底泥中挖出，就地清洗根茎上的底泥，将带有多个克隆幼苗的克隆片段装入塑料自封带冷藏条件下带回实验室；
(2)克隆幼苗的室内暂养:将克隆片段上的幼苗从与主枝连接处折断，并将幼苗端部已开始脱落腐烂的叶片和叶鞘以及一些老根都清理掉，5个一组放入装有天然海水的100ml烧杯中，于光照培养箱中培养，培养条件为:光照强度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，温度最初与种源海域相近(如海域水温低于10°C，则培养箱最低温只能设为10°C)，日后每天升或降1°C，最终接近15°C。3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续于培养箱中培养，在将幼苗放入灭菌海水前要清理脱落叶片，并将根状茎的前端剪去一小截；
(3)外植体选择和修剪:灭菌海水中培养5天后即可进行外植体选择，将根状茎含有5个节以上的克隆幼苗选出，放入空的灭菌大烧杯中，于超净工作台上进行修剪，剪去根状茎前端一个节间，剥去外层老叶，只留里面的3-4片叶，并将叶片前端剪去，留3cm长，只留最幼的两族不定根；
(4)外植体消毒:将修剪后的幼苗放入新的灭菌培养瓶中，用灭菌天然海水冲洗3-5次，用灭菌滤纸将水吸干，再放入10%的过氧化氢溶液(加0.1%吐温,过氧化氢溶液用灭菌海水来稀释配制)中消毒15分钟，再用灭菌天然海水冲洗5次；
(5)外植体再修剪:将消毒过的两簇幼叶在无菌培养皿中切下，再切取根尖3-5mm长进行培养。
[0015]本实施例所用光照培养箱为上海博讯SPX-250B-G型光照培养箱。
【权利要求】
1.一种大叶藻野生外植体获取方法，其特征在于获取的具体步骤如下: (1)克隆片段的野外采集:选择海域环境良好、大叶藻长势旺盛的海域，将大叶藻植株挖出，就地清洗根茎上的底泥，将带有多个克隆小苗的克隆片段在冷藏条件下带回实验室; (2)克隆小苗的室内暂养:将克隆幼苗从与主枝上折下，放入装有天然海水的100ml烧杯中，于光照培养箱中培养，3-5天后将天然海水换为灭菌天然海水继续于培养箱中培养; (3)外植体供体选择和修剪:灭菌海水中培养5天后即可进行外植体选择，将根状茎含有5个节以上的克隆幼苗选出，于超净工作台上进行修剪； (4)外植体消毒:将修剪后的小苗先用灭菌天然海水冲洗3-5次，再放入10%的过氧化氢溶液中浸泡15分钟，用灭菌海水冲洗5次； (5)外植体再修剪:在接种前，将消毒过的幼苗进行再修剪，以获得目的外植体，如 根尖、茎尖或根状茎，用来接种。
【文档编号】A01H4/00GK104126503SQ201310431214
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】郑凤英, 李乐乐, 陈玉, 金艳梅, 韩晓弟, 刘雪芹, 窦国栋 申请人:山东大学（威海）