一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法。本方法以牛大力子叶为外植体进行诱导毛状根，方法包括外植体灭菌，农杆菌活化培养，毛状根诱导培养、增殖培养等环节。本发明的优点：(1)采用牛大力子叶为外植体进行转化；(2)确立了适合牛大力毛状根诱导的预培养时间、菌液浓度、侵染时间及共培养时间；(3)确定了外植体抑菌培养最佳的抑菌剂；(4)确定了最佳的预培养、共培养、抑菌培养及继代增殖培养基；(5)本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，诱导成功率高，增殖速度快，可持续获得牛大力毛状根，用于规模化培养牛大力毛状根以提取牛大力多糖等主要化学成分，具有很好的应用前景。
【专利说明】一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属农业生物【技术领域】，具体是一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia spec1sa Champ.)，又名大力薯、山莲藕，始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》(1990年版)收载的地方药材。牛大力以根入药，味甘，平。归肺、肾经。具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。壮族民间常用于腰腿痛，发旺(风湿骨痛)，肺结核，慢性肝炎，慢性胃炎的治疗。
[0003]现代研究发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研究显示其对鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、以及结肠癌具有良好的治疗效果。同时牛大力多糖也是理想的免疫增强剂；生物碱和香豆素具有保肝、祛痰、镇咳、镇痛、镇静、解痉的作用，且对正常细胞均没有毒副作用，在开发抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等药物方面有着特殊的优势，已成为提取企业竞相开发的新目标，市场需求量巨大。自20世纪70年代起，作为主要原料被制药企业加工成壮腰健肾丸、强力健身胶囊、桂龙药膏、活络止痛丸、强力追风透骨丸、舒筋健腰丸、益智康脑丸、抗风湿液等中成药，在全国广泛应用。近年来，牛大力又成为提取企业竞相开发的新目标，提取多糖、高丽槐素等成分。
[0004]随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。为了解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一些成功的研究报道，但仍存在着许多问题制约其规模化生产，具体表现在种子苗不结薯或薯块产量很不稳定，扦插苗成活率低，组培苗生根非常困难等方面。而且牛大力生长周期长(一般3-4年才形成产量)，以常规方法育种或育苗，需要花费很长时间，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加，并且因病虫害危害严重导致退化，严重影响了药材的产量和品质。于是，如何利用高新技术研究获得大量牛大力多糖等有效成分满足临床所需，并实现资源的可持续利用已迫在眉睫。我们针对牛大力开发后出现的资源可持续发展问题，开展利用毛状根培养体系生产牛大力次生代谢产物的研究，以期探索出利用毛状根直接生产有效成分的新途径，同时为下一步建立毛状根植株再生体系以培育出容易生根结薯与有效成分含量高的新品种提供实验材料，也为实现利用毛状根进一步工厂化生产药用活性成分奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法。
[0006]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0007]—种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法，以牛大力子叶为外植体进行诱导毛状根，方法包括外植体灭菌，农杆菌活化培养，毛状根诱导培养和增殖培养，操作步骤如下:
[0008]1.外植体灭菌过程:
[0009]取牛大力成熟黑色种子，用体积浓度为0.05%洗洁精溶液浸泡lOmin，再经流水冲洗15min，在超净工作台上用质量浓度为0.1 % HgCl2溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用灭菌滤纸将水分吸干。
[0010]2.农杆菌活化培养过程:
[0011]挑取已转质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株LBA9402单克隆菌落，在液体培养基中活化，活化条件为28°C，180rpm,过夜，至0D600 = 0.6?0.8，得到活化好的菌液；所述的液体培养基为YEB培养基+卡那霉素50mg.I71,卡那霉素为载体上抗性筛选基因所对应的抗生素；所述培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟。
[0012]3.毛状根诱导培养过程:
[0013]将步骤1灭菌好的种子的子叶切下，并用解剖刀将子叶划伤，将划伤的子叶接种至预培养的固体培养基MS+30g.Γ1蔗糖+5g.Γ1琼脂上，在26±2 °C、黑暗条件下预培养2d。预培养后，将划伤的子叶放入步骤2活化好的菌液中侵染15min，在菌液中加入100 μ mo 1.L—1乙酰丁香酮以提高转化率，侵染后将划伤的子叶用无菌滤纸吸干表面菌液，转接至诱导固体培养基MS+浓度为100 μ mol.L—1乙酰丁香酮+30g.L—1鹿糖+5g.L—1琼脂上培养2d，培养条件是:26±2°C、黑暗培养，培养后，将划伤的子叶放入无菌水中清洗3?5遍，用灭菌滤纸将表面吸干，转接到抑菌固体培养基MS+500mg.L—1头孢克肟+30g.Γ1蔗糖+5g.Γ1琼脂上培养，培养条件是26±2°C、黑暗培养，每隔3d将材料用无菌水清洗干净表面菌液后用无菌滤纸吸干，然后转接到新的抑菌培养基中继续培养，直至毛状根长出。待毛状根长出，将毛状根切下，转接至抑菌固体培养基MS+500mg.Ι^头孢克肟+30g.Ι^蔗糖+5g -Γ1琼脂上培养，培养条件是26±2°C、黑暗培养，视毛状根的除菌情况逐步降低头孢克肟的浓度，当头孢克肟的浓度降低至零时，无菌生长，说明毛状根已除菌成功。待彻底除菌成功，将毛状根转接到MS固体培养基上筛选生长速度最快的根系，筛选出的根系经过PCR检测证明外源基因已转入牛大力毛状根中，转化率为67.2%。所述的培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟。
[0014](4)毛状根增殖培养过程:
[0015]将步骤(3)筛选出的毛状根转接到液体培养基MS+0.5mg.Γ1吲哚丁酸+30g.Γ1蔗糖中进行增殖培养，在26±2°C、光照强度2000Lx、光照时间10h/d，90?150rmp的摇床上培养15?25天，获得50?100倍重量的毛状根。
[0016]本发明的优点:
[0017](1)采用牛大力子叶为外植体进行转化；(2)确立了适合牛大力毛状根诱导的预培养时间、菌液浓度、侵染时间及共培养时间；(3)确定了外植体抑菌培养最佳的抑菌剂；
(4)确定了最佳的预培养、共培养、抑菌培养及继代增殖培养基；(5)本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，诱导成功率高，增殖速度快，可持续获得牛大力毛状根，用于规模化培养牛大力毛状根以提取牛大力多糖等主要化学成分，具有很好的应用前景。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施方法对本发明作进一步描述。
[0019]一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法:
[0020]1.外植体灭菌过程:
[0021]取牛大力成熟黑色种子，用体积浓度0.05%洗洁精溶液浸泡lOmin，再经流水冲洗15min。在超净工作台上用质量浓度0.1 % HgCl2溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用灭菌滤纸将水分吸干。此灭菌方法的污染率为13.33%，成活率为100.00%。
[0022]若果荚未开裂，取成熟的黑色果荚，用体积浓度0.05%洗洁精溶液浸泡lOmin，浸泡过程中用刷子刷洗表面以去除表面柔毛与污垢，再经流水冲洗15min。用手小心掰开果荚(手不能接触到种子)，然后用镊子取出种子。此灭菌方法无污染，成活率为100.00%。
[0023]2.农杆菌活化培养过程:
[0024]挑取已转质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株LBA9402单克隆菌落，在液体培养基中活化，活化条件为28°C，180rpm,过夜，至0D600 = 0.6?0.8，所述的液体培养基为YEB培养基+卡那霉素50mg.L_\卡那霉素为载体上抗性筛选基因所对应的抗生素。所述培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟。
[0025]若发根农杆菌的菌株保存在_80°C超低温冰箱中，需先在YEB固体培养基上划线培养，待单菌落长出后，再挑取单菌落接种于YEB液体培养基中活化培养。
[0026]3.毛状根诱导培养过程:
[0027]将步骤1灭菌好的种子的子叶切下(若能把种皮先剥去再切下子叶，效果更好)，并用解剖刀将子叶划伤，将划伤的子叶接种至预培养的固体培养基MS+30g.Γ1蔗糖+5g.Γ1琼脂上，在26±2°C、黑暗条件下预培养2d。预培养后，将划伤的子叶放入步骤2活化好的菌液中侵染15min，在菌液中加入100 μ mol.L—1乙酰丁香酮以提高转化率，侵染后将材料用无菌滤纸吸干表面菌液，转接至诱导固体培养基MS+100 μ mol.I71乙酰丁香酮+30g吨―1蔗糖+5g吨―1琼脂上共培养2d，培养条件是:(26±2) °C、黑暗培养。培养后，将材料放入无菌水中清洗3?5遍，用灭菌滤纸将表面吸干，转接到抑菌固体培养基MS+500mg -Γ1头孢克肟+3(^.171蔗糖+58.171琼脂上培养，培养条件是:(26±2) °C、黑暗培养。每隔3d将划伤的子叶用无菌水清洗干净表面菌液后用无菌滤纸吸干，然后转接到新的抑菌培养基中继续培养，直至毛状根长出。待毛状根长出，将毛状根切下，转接至抑菌固体培养基MS+500mg.Γ1头孢克肟+30g.Γ1蔗糖+5g.Γ1琼脂上培养，培养条件是:(26 ±2) °C、黑暗培养。视毛状根的除菌情况逐步降低头孢克肟的浓度，当头孢克肟的浓度降低至零时，无菌生长，说明毛状根已除菌成功。待彻底除菌成功，将毛状根转接到固体培养基MS上筛选生长速度最快的根系。筛选出的根系经过PCR检测证明外源基因已转入牛大力毛状根中，转化率为67.2%。所述的培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟。
[0028]4.毛状根增殖培养过程:
[0029]将步骤3筛选出的毛状根转接到继代液体培养基MS+0.5mg -L^IBA中进行增殖培养，在(26±2) °C、光照强度2000Lx、光照时间10h/d，90?150rmp的摇床上培养15?25天，获得50?100倍重量的毛状根。
【权利要求】
1.一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法，其特征在于，以牛大力子叶为外植体进行诱导毛状根，方法包括外植体灭菌，农杆菌活化培养，毛状根诱导培养和增殖培养，操作步骤如下: (1)外植体灭菌过程: 取牛大力成熟黑色种子，用体积浓度为0.05%洗洁精溶液浸泡lOmin，再经流水冲洗15min，在超净工作台上用质量浓度为0.1% HgCl2溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用灭菌滤纸将水分吸干； (2)农杆菌活化培养过程: 挑取已转质粒的发根农杆菌菌株LBA9402单克隆菌落，在液体培养基中活化，活化条件为28°C，180rpm，过夜，至0D600 = 0.6?0.8，得到活化好的菌液；所述的液体培养基为YEB培养基+卡那霉素50mg吨―1，卡那霉素为载体上抗性筛选基因所对应的抗生素；所述培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟； (3)毛状根诱导培养过程: 将步骤(I)灭菌好的种子的子叶切下，并用解剖刀将子叶划伤，将划伤的子叶接种至预培养的固体培养基MS+30g.Γ1蔗糖+5g.Γ1琼脂上，在26±2 °C、黑暗条件下预培养2d;预培养后，将划伤的子叶放入步骤(2)活化好的菌液中侵染15min，在菌液中加入10ymol.L—1乙酰丁香酮以提高转化率，侵染后将划伤的子叶用无菌滤纸吸干表面菌液，转接至诱导固体培养基MS+浓度为100 μ mo I.L—1乙酰丁香酮+30g.L—1鹿糖+5g.L—1琼脂上培养2d，培养条件是:26±2°C、黑暗培养，培养后，将划伤的子叶放入无菌水中清洗3?5遍，用灭菌滤纸将表面吸干，转接到抑菌固体培养基MS+500mg.I/1头孢克肟+30g.Γ1蔗糖+5g.L-1琼脂上培养，培养条件是26±2°C、黑暗培养，每隔3d将材料用无菌水清洗干净表面菌液后用无菌滤纸吸干，然后转接到新的抑菌培养基中继续培养，直至毛状根长出；待毛状根长出，将毛状根切下，转接至抑菌固体培养基MS+500mg 头孢克肟+30g 蔗糖+5g -L-1琼脂上培养，培养条件是26±2°C、黑暗培养，视毛状根的除菌情况逐步降低头孢克肟的浓度，当头孢克肟的浓度降低至零时，无菌生长，说明毛状根已除菌成功。待彻底除菌成功，将毛状根转接到MS固体培养基上筛选生长速度最快的根系，筛选出的根系经过PCR检测证明外源基因已转入牛大力毛状根中，转化率为67.2% ;所述的培养基配制分装后，于121°C灭菌20分钟； (4)毛状根增殖培养过程: 将步骤(3)筛选出的毛状根转接到液体培养基MS+0.5mg -T1吲哚丁酸+30g -T1蔗糖中进行增殖培养，在26±2°C、光照强度2000Lx、光照时间10h/d，90?150rmp的摇床上培养15?25天，获得50?100倍重量的毛状根。
【文档编号】C12N15/84GK104372020SQ201410652452
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】姚绍嫦, 白隆华, 翟勇进 申请人:广西壮族自治区药用植物园