专利名称：一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法。
背景技术：
植物生物技术是一种重要和先进的技术，而组织培养则是生物技术的重要组成部分。由于大豆愈伤组织和叶片等的植株再生技术还没有确立，下胚轴成为唯一能够再生不定芽的外植体材料。但是，迄今为止下胚轴的不定芽再生效率一直不尽人意，不定芽的质量也较差，由此严重地影响了生物技术改良大豆品种的进程。在以大豆下胚轴作为外植体诱导不定芽再生时，通常是在大豆种子萌发培养基或/和下胚轴外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为苄基腺嘌呤(BA)，浓度为1-3 mg/L。在这种条件下外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。造成这种情况的原因首先是由于长时间培养外植体不能够用高浓度的细胞分裂素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的细胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不够强。其次是在不定芽形成以后残存在培养基和外植体组织中的细胞分裂素对不定芽的进一步生长有十分不利的影响。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷，提供一种高效的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法。本发明提供的方法包括如下具体步骤
(1)将大豆幼苗在MSB5培养基上培养后，进行切割获取下胚轴外植体；
(2)对下胚轴外植体的形态学上端部分用苄基腺嘌呤(BA)溶液浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后的下胚轴外植体接种至MSB5培养基上培养。优选地，步骤(I)和步骤(3)所述MSB5培养基中BA的浓度为O。不添加BA的萌发培养基上所获得下胚轴外植体再生效果最佳。优选地，步骤(2)的浸泡处理时间为20-40 min，此时外植体的不定芽再生效果最好。优选地，步骤(2)的苄基腺嘌呤溶液浓度为30mg/L，此浓度下能获得较高的不定芽再生率和单株芽数，并且再生的不定芽能够继续生长。优选地，步骤(2)浸泡处理后清除残留在下胚轴外植体表面的苄基腺嘌呤溶液，以进一步减少对不定芽生长的影响。步骤(2)的BA溶液采用一般方法配制成所需即可，具体地，可以采用如下方法配制称取一定量的BA粉末,用lmol/L NaOH充分溶解,再用去离子水定容,配制成30mg/L的BA溶液；采用lmol/L HCl调整BA溶液的pH至5. 8-6. O。步骤(I)和步骤(2)的培养条件均为室温为25°C、光照强度为20001x、光照时间为每天12小时。步骤(I)和步骤(3)的MSB5培养基中含有MS培养基配方的无机成分、B5培养基配方的有机成分、25 g/L鹿糖、100 mg/L肌醇、300 mg/L蛋白胨、7 g/L琼脂,pH为5. 8-6. O。具体来说，MS培养基配方的无机成分包括16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、I. 7 g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁；B5培养基配方的有机成分包括10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸吡哆醇、I mg/L烟酸、100mg/L肌醇。本发明还提供一种合适的处理装置，用于方便地对下胚轴外植体进行短期激素处 理，即用于步骤(2)的浸泡处理采用一块通常用于核苷酸片段扩增的4 cmX6 cm PCR板，整齐的切掉PCR板底部的小管，保留四个角上的小管作支架，放在有盖的培养皿中。该装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。本发明对通常的大豆下胚轴外植体不定芽再生培养方法进行了创新，即在为获取下胚轴外植体的萌发培养基和诱导下胚轴不定芽的再生培养基中都不添加BA，取而代之的是利用高浓度的BA溶液对从幼苗取得的下胚轴外植体的上端切口附近进行短期的浸泡处理，给予外植体上端切口附近具有分化能力的细胞相对于普通添加BA的培养基更强的刺激，诱导形成更多的不定芽。同时，由于仅是局部短时的浸泡处理，BA在细胞中的浓度随后很快降低，减少了在培养后期对所形成的不定芽的发育的负面影响，也不会影响下胚轴外植体下端切口的不定根再生，可以达到一次培养操作就可以得到完整植株的高效目的。本发明的有益效果1)方法简便，可以显著缩短整个培养周期；2)得到数量更多、质量更好的不定芽，现有方法的不定芽获得率一般为10 %-30 %，而采用本发明的方法的不定芽获得率为31. 94 %-54. 17 % ;3)由在上方形成了芽和下方形成了根的下胚轴外植体所产生的再生植株更容易炼苗和移栽成活。
图I :处理外植体的装置；
图2 :切割部位与外植体形态;A :切割部位(黑线表示齐靠幼苗子叶分叉处基部切割)；B :外植体形态学上端形态结构；
图3 :不同浓度的BA溶液处理下胚轴20分钟后的再生效果；A 0 mg/L ；B :15 mg/L ；C 30 mg/L；D 60 mg/L ；E 120 mg/L ；
图4 :下胚轴再生植株的移栽生长;A :下胚轴再生植株的驯化移栽；B :成熟植株。
具体实施例方式实施例I
一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其中使用到的溶液如下
(I)BA溶液称取一定量的BA粉末，用I mg/L NaOH充分溶解，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的BA溶液；采用I mg/L HCl调整BA溶液的pH至5. 8-6. O ;使用高压蒸汽灭菌锅，在121°C、0. I MPa的条件下，对已配制好的BA溶液进行20 min灭菌。
(2)MSB5培养基将MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7 g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、0. 83 mg/L碘化钾、0. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、0. 025mg/L五水硫酸铜、0. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)、B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)、25 g/L蔗糖、300 mg/L蛋白胨、7 g/L琼脂依次加入到容积为2 L的塑料广口容器(事先已向其中加入了 200 mL的去离子水)中充分溶解，用去离子水定容，采用I mol/L NaOH溶液调整pH至5. 8-6.0，最后把培养基分装至容积为200 mL的玻璃培养瓶中，每瓶加入20 mL培养基。培养基在121°C、0. I MPa的条件下灭菌20 min。预先制备一种处理装置，用于方便地对下胚轴外植体进行短期激素处理采用一块通常用于核苷酸片段扩增的4 cmX6 cm PCR板，整齐的切掉PCR 板底部的小管，保留四个角上的小管作支架，放在有盖的培养皿中。该装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。制备好的装置如图I所示。本实施例的方法包括如下具体步骤
(1)将大豆幼苗在MSB5培养基上培养后，进行切割获取下胚轴外植体；
(2)对下胚轴外植体的形态学上端部分用BA溶液浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后的下胚轴外植体接种至MSB5培养基上培养。其中步骤(I)中获取大豆下胚轴外植体供体材料的方法为选取大小均一的成熟大豆种子，经常规灭菌后，接种至无激素MSB5培养基上，在室温为25°C、光照强度为20001x、光照时间为每天12小时的条件下培养5天，获得大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料。步骤(I)中获取下胚轴外植体的方法为选取具有长度大于I cm的胚轴的大豆幼苗为供体材料，在齐靠幼苗子叶分叉处基部切割，获得长度为I cm左右的下胚轴切段为外植体，切口平齐。切割部位与外植体形态见图2。步骤(2)中BA溶液处理下胚轴外植体的方法为在超净工作台中，把切好的下胚轴外植体逐个插入上述处理装置的各个孔中，使外植体的形态学上端朝下，然后向该装置组成部分的培养皿中倒入上述BA处理溶液至约I mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min。倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液。步骤(3)中下胚轴外植体的再生培养方法为把经过处理后的下胚轴外植体以竖插方式接种至无激素MSB5培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养20天。经上述方法处理后，再使用如下再生苗的出瓶炼苗和种植方法从培养瓶中取出上端具有再生芽和下端具有再生根的下胚轴，洗净根上的培养基后，即可栽植到干净的细砂基质中，进行常规的保湿炼苗。几天之后，即可把再生苗种植在一般的土壤中进行常规管理。下胚轴再生植株的移栽生长见图4。实施例2
种子萌发培养基中添加不同浓度的BA对下胚轴外植体再生的影响本实施例中，采用在添加不同浓度BA的MSB5培养基上培养5天后的大豆幼苗，对其进行切割获取下胚轴外植体；对下胚轴外植体的形态学上端部分用30 mg/L BA溶液浸泡处理20 min后，接种至无激素MSB5培养基上培养20天。实验结果如表I所示。
表I萌发培养基中不同BA浓度对下胚轴外植体再生的影响
bTwl) I不定芽再生率/%I单株芽数/颗I不定根形成率/%
权利要求
1.一种诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将大豆幼苗在MSB5培养基上培养后，进行切割获取下胚轴外植体； (2)对下胚轴外植体的形态学上端部分用苄基腺嘌呤溶液浸泡处理； (3)将步骤(2)处理后的下胚轴外植体接种至MSB5培养基上培养。
2.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(1)和步骤(3)所述MSB5培养基中苄基腺嘌呤的浓度为O。
3.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤 (2)的浸泡处理时间为20-40min。
4.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(2)的苄基腺嘌呤溶液浓度为30mg/L。
5.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(2)浸泡处理后清除残留在下胚轴外植体表面的苄基腺嘌呤溶液。
6.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(2)的苄基腺嘌呤溶液配制方法为称取一定量的苄基腺嘌呤粉末，用I mol/L NaOH溶解，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的苄基腺嘌呤溶液；采用I mol/L HCl调整苄基腺嘌呤溶液的pH至5. 8-6.0。
7.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(I)和步骤(2)的培养条件均为室温为25°C、光照强度为20001x、光照时间为每天12小时。
8.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(I)的培养时间为5天。
9.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(I)和步骤(3)的MSB5培养基中含有MS培养基配方的无机成分、B5培养基配方的有机成分、25 g/L 鹿糖、100 mg/L 肌醇、300 mg/L 蛋白胨、7 g/L 琼脂，pH 为 5. 8-6. O。
10.如权利要求I所述的诱导大豆下胚轴外植体的不定芽再生的方法，其特征在于步骤(2)中浸泡处理使用的装置为采用一块用于核苷酸片段扩增的4 cmX6 cm PCR板，整齐的切掉PCR板底部的小管，保留四个角上的小管作支架，放在有盖的培养皿中。
全文摘要
本发明属于植物生物技术领域。在以大豆下胚轴作为外植体诱导不定芽再生时，一般是在大豆种子萌发培养基或/和下胚轴外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，在这种条件下胚轴外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。本发明，在种子萌发培养基和不定芽再生培养基中都不添加BA，在取得外植体后，配制显著高浓度的BA溶液对大豆下胚轴外植体形态学上端切口附近进行短期浸泡处理，给予该部位具有分化能力的细胞较强的不定芽分化刺激作用，因此，也就可以获得数量较多和质量较好的不定芽。应用本发明可以极显著地提高大豆下胚轴外植体不定芽再生的效率和质量，使下胚轴成为大豆遗传转化的理想受体。
文档编号A01H4/00GK102754597SQ20121020707
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者于磊, 刘颍, 年海, 张奇, 杨跃生, 郭振飞 申请人:华南农业大学