专利名称：凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂及其应用和饲料的制作方法
技术领域：
本发明属于水产饲料领域，具体涉及一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂及其应用和含有该饲料添加剂的饲料。
背景技术：
凡纳滨对奸(Litopenaeus vannamei ),俗称南美白对奸,是当今世界奸类养殖产量最高的三大品种之一，具有抗病力强，生长速度快，食性杂，营养要求低等特点，是“海虾淡养”的优质品种，也是中国养殖面积和产量最高的养殖品种。近年来，随着对虾养殖规模不断扩大，养殖密度的不断提高，对虾养殖面临着大量的问题，如拥挤、营养、环境、代谢等因子的激烈应激，导致对虾抗应激能力差，抗病力弱，极易爆发大规模病害，从而给对虾的养殖业造成巨大的经济损失。目前关于水产动物的疾病防治主要是依靠抗生素等药物，但是由于病原菌耐药性的形成，以及食品安全等问题的提出，正确地使用抗生素等药物及其基本的疾病防治对策尚待确立。此外，对于对虾的病毒性疾病目前尚无有效的治疗方法，只能进行诸如对养殖池的消毒和卵的清洗等一般性处理而已。研究发现，￠-葡聚糖作为单一免疫增强剂能够通过增强对虾的非特异性免疫来提高虾体的免疫力和抗病力，在生产中已得到广泛应用。但随着研究的不断深入，发现饲料中单一添加￠-葡聚糖时存在免疫刺激作用时间短，剂量大，长期使用时易出现免疫疲劳等问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能有效延长P -葡聚糖的免疫刺激时间、减少其使用剂量，同时缓解单独使用P-葡聚糖时产生免疫疲劳问题的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂。本发明的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，其特征在于，包括￠-葡聚糖 和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量计算，P -葡聚糖和硒质量比为15(T300 :0. 2。所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂进一步优选还包括维生素E，^ -葡聚糖、硒和维生素E的质量比为:150^300 :0. 2 =IOO0本发明还提供了另外一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，其特征在于，包括￠-葡聚糖和维生素E，两者质量比为150 300:100。本发明的第二个目的是提供上述凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂在作为凡纳滨对虾的饲料添加剂的应用。本发明的第三个目的是提供一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料，其特征在于，包括普通凡纳滨对虾基础饲料和凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂包括3-葡聚糖和蛋氨酸硒，3 -葡聚糖的添加量为15(T300mg/kg普通凡纳滨对奸基础饲料,蛋氨酸硒，以硒的量计算,其添加量为0. 2mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料。所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂优选还包括维生素E，维生素E的添加量为100mg/kg普通凡纳滨对奸基础饲料。本发明的另外一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料，其特征在于，包括普通凡纳滨对虾基础饲料和凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂包括￠-葡聚糖和维生素E，￠-葡聚糖的添加量为15(T300mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料，维生素E的添加量为100mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料。本发明通过实验发现，将￠-葡聚糖与蛋氨酸硒按一定的质量比联合添加，或者将￠-葡聚糖与维生素E按一定的质量比联合添加，或者将3 -葡聚糖与蛋氨酸硒、维生素E按一定的质量比联合添加到普通凡纳滨对虾基础饲料中，通过蛋氨酸硒和维生素E的抗氧化途径来提高凡纳滨对虾机体的免疫防御能力，能有效延长3-葡聚糖的免疫刺激时间、减少其使用剂量，同时缓解单独使用￠-葡聚糖时产生免疫疲劳问题。本发明可直接添加到凡纳滨对虾的基础日粮中，使用方便。
图I是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾血淋巴计数图。图2是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的血清酚氧化物酶活性的测定图。图3是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的血清溶菌酶活性的测定图。图4是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的白斑病毒感染试验测定图。图5是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的血清总抗氧化能力的测定图。图6是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的血清MDA含量的测定图。图7是投喂对照饲料和投喂添加了不同组合添加剂的饲料的凡纳滨对虾的血清SOD活性的测定图。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :一、饲养试验饲料分组GO组饲料普通凡纳滨对虾基础饲料Gl组饲料在普通凡纳滨对虾基础饲料中添加3 -葡聚糖,添加量为每千克普通凡纳滨对虾基础饲料300mg ^ -葡聚糖。G2组饲料在普通凡纳滨对虾基础饲料中添加3 -葡聚糖和蛋氨酸硒，添加量为每千克普通凡纳滨对奸基础饲料300mgP -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加。G3组饲料在普通凡纳滨对虾基础饲料中添加3 -葡聚糖和维生素E，添加量为每千克普通凡纳滨对奸基础饲料300mg P -葡聚糖，IOOmg维生素E。G4组饲料在普通凡纳滨对虾基础饲料中添加P -葡聚糖、硒和维生素E，添加量为每千克普通凡纳滨对奸基础饲料300mg ^ -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加，IOOmg维生素E。G5组饲料在普通凡纳滨对虾基础饲料中添加3 -葡聚糖、硒和维生素E，添加量为每千克普通凡纳滨对奸基础饲料150mg@ -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加，IOOmg维生素E。选取960尾初始体重为(0. 83±0. 03)g的凡纳滨对虾，随机分成6组，每组4个重复，每个重复40尾虾，分别常规投喂GO组饲料、Gl组饲料、G2组饲料、G3组饲料、G4组饲料和G5组饲料，整个养殖周期为35天。饲养试验结束时，每个缸随机取1(T15尾虾，用Iml 无菌注射器从对虾头胸甲插入心脏抽取血淋巴，合并置于无菌的Eppendorf管中，4°C下静 置3 4h，在5°C下以10000r/min离心lOmin，吸取上清液分装保存于_80°C冰箱中备用。二、效果检测I、对虾血淋巴计数血细胞总数(THC)在一定程度上反映了对虾的免疫能力或健康状况。在甲壳动物中，THC在抵抗病原入侵方面具有极其重要的作用，但因外界变化因素，如感染，环境胁迫，蜕皮期间内分泌变化等而发生较大变化。饲养试验结束时，每缸随机取5尾虾，用ImL无菌注射器于围心腔取血，合并置于无菌Eppendorf管中。吸取150 u L抗凝剂于Eppendorf管中，立即加入对奸血液100 y L,迅速混匀，取50 ii L抗凝的血液，加入IOmL pH 7. 3的PBS缓冲液，用细胞计数仪(Z2Coulter,BECKMAN COULTER)进行计数。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P <0.05表示差异性显著。结果如图I所示，从图I中可以看出，G4、G5组的血淋巴计数显著高于GO组(P〈0. 05)，略高于Gl组。由此可见，本发明的由￠-葡聚糖与蛋氨酸硒、维生素E联合组成的添加剂提高了对虾的免疫能力。2、凡纳滨对虾血清酚氧化物酶(PO)活性的测定酚氧化物酶(PO)是对虾非特异性免疫因子中具有重要作用的含铜金属酶，可以通过酶促和非酶促反应来产生黑色素，所形成的黑色素及其代谢中间产物可抑制病原菌胞外蛋白和几丁质酶的活性，从而杀死外来病原体，起到免疫保护作用。测定原理酚氧化物酶(PO)活力是以单位时间内其与底物的生成物引起吸光度的变化来确定的。本试验血清样品为实施例I中保存于_80°C冰箱中的凡纳滨对虾血清样品。以L-多巴为底物，把IOuL血清加入96孔酶标板中，然后向各孔中加入200 ii L浓度为0. lmol/L，PH为6. 0的磷酸盐缓冲液，最后向各样品孔中加入IOy L浓度为0. 01mol/L的L-多巴液(购自Sigma公司),在酶标仪(550, Bio-Rad)中震荡4次,每隔4min读取490nm处的吸光值。酶活力以实验条件下，0D490值每分钟增加0. 001为一个酶活力单位。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0. 05表示差异性显著。结果如图2所示，从图2可以看出，G4组的血清PO活性显著高于GO组。由此可见，本发明的由￠-葡聚糖与蛋氨酸硒、维生素E联合组成的添加剂对凡纳滨对虾能够起到更好的免疫保护作用。3、凡纳滨对虾血清溶菌酶(LZM)活性的测定溶菌酶是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，
4-^ -N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的P -I, 4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由 于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。测定原理溶菌酶能使革兰氏阳性菌细胞壁溶解，尤其是对腐生菌，如溶壁微球菌最为敏感，故常以溶解溶壁微球菌为指标，对溶菌酶的活性值进行测定。本试验血清样品为实施例I中保存于_80°C冰箱中的凡纳滨对虾血清样品。以溶壁微球菌冻干粉为底物，用0. lmol/LPH值为6. 4的磷酸钾盐缓冲溶液配成底物悬液(0D570=0. 3)。取3ml该悬液于试管内，置冰浴中，再加入50ul血清混匀，于570nm处测其初始光密度值AO值，然后将试液移入37°C水浴中保温30min，取出后立刻置于冰浴中IOmin终止反应，测其A值。溶菌酶活力(LZM)按下式计算U= (AO-A)/A。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0.05表示差异性显著。结果如图3所示，从图3可以看出，G2、G3、G4组的血清LSZ活性显著高于GO组和Gl组。由此可见，本发明的由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒联合组成的添加剂，或由￠-葡聚糖和维生素E联合组成的添加剂，或由3 -葡聚糖和蛋氨酸硒、维生素E三者联合组成的添加剂能够提高对虾的免疫防御功能，缓解葡聚糖单独使用时的免疫疲劳问题。4、凡纳滨对虾白斑病毒(WSSV)感染实验测定病毒粗提液制备取带有白斑病毒感染的病虾肌肉0. 3g左右，剪碎混匀，按0. Ig组织加I. OmLPH为7. 4的0. 01mol/L磷酸缓冲液于匀浆器中混匀，匀浆液以10000r/min离心lOmin，取上清液，经0. 45 ii L微孔滤膜过滤，其滤液为WSSV粗提液。粗提液于2h内制备完毕。粗提液加磷酸缓冲液稀释5倍作为注射液，用于对虾注射感染实验。感染试验实验前做预实验，摸得最适注射量为50 U L0从实施例I的每个重复中取10尾对虾进行感染实验。每尾注射WSSV粗提液50 i! L，每个重复继续投喂原来的试验饲料，记录3天内对虾的累计死亡率和相对免疫保护率。相对免疫保护率=IOOX (对照组累计死亡率一实验组累计死亡率)/对照组累计死亡率。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0.05表示差异性显著。结果如图4所示，从图4可以看出，G2、G4、G5组的累计死亡率显著低于GO组(P < 0. 05),略低于Gl组。
由此可见，本发明的由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒联合组成的添加剂，或由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒、维生素E三者联合组成的添加剂能够提高对虾的免疫防御功能，缓解3 -葡聚糖单独使用时的免疫疲劳问题。5、凡纳滨对奸血清总抗氧化能力(T-AOC)的测定机体防御体系的总抗氧化能力(T-AOC)的强弱与机体健康程度存在着密切联系，是对机体抗氧化能力评价的一个总体指标。该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、葡萄糖、铜蓝蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；并分解过氧化物，阻断过氧化链；同时除去起催化作用的金属离子。测定原理机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。 本试验血清样品为实施例I中保存于_80°C冰箱中的凡纳滨对虾血清样品。本试验所采用总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(名称总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(100管/50样)货号A015)，测定步骤按说明书进行。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0. 05表示差异性显著。结果如图5所示，从图5中看出，Gl组的T-AOC活性显著低于G3、G5组(P < 0. 05)，略低于G2、G4组。 由此可见，蛋氨酸硒和维生素E能够通过抗氧化途径提高对虾的T-AOC能力，缓解^-葡聚糖单独添加时的免疫疲劳问题。6、凡纳滨对虾血清MDA含量的测定丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的主要产物，MDA的测定常常与超氧化物歧化酶(SOD)的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。测定原理过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。通过比色即可求出各样品中丙二醛的含量。本试验血清样品为实施例I中保存于_80°C冰箱中的凡纳滨对虾血清样品。本试验所用丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(名称丙二醛(MDA)测试盒(100管/96样)货号A003-1)，按说明书进行测定。试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0.05表示差异性显著。结果如图6所示，从图6可以看出，G1、G2、G4、G5组的血清MDA含量显著低于GO组和G3组。由此可见，本发明的￠-葡聚糖或￠-葡聚糖与蛋氨酸硒二者联合添加或者葡聚糖与蛋氨酸硒，维生素E三者联合添加能够抑制脂质过氧化物的产生，从而提高机体的抗氧化能力。7、凡纳滨对虾血清SOD活性的测定
超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其可以清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害。测定原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。本试验血清样品为实施例I中保存于_80°C冰箱中的凡纳滨对虾血清样品。本试验所用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(名称超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(酶标法)(96T)货号A001-3)，测定步骤按说明书进行。
试验结果用平均值土标准差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0软件进行数据统计和分析，先对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，若差异显著再作Duncan’s多重比较，P < 0.05表示差异性显著。结果如图7所示，从图7可以看出，G1、G2、G3组的血清T-SOD活性显著高于GO组(P < 0. 05)，G2组的血清T-SOD活性显著高于其他各组。由此可见，0 -葡聚糖与蛋氨酸硒二者联合添加能有效提高机体清除自由基的能力。
权利要求
1.一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，其特征在于，包括3 -葡聚糖和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量计算，P -葡聚糖和硒质量比为15(T300 :0. 2。
2.根据权利要求I所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，其特征在于，还包括维生素E，￠-葡聚糖、硒和维生素E的质量比为:150^300 :0. 2 100o
3.—种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，其特征在于，包括3 -葡聚糖和维生素E，两者质量比为150 300 =IOO0
4.权利要求1-3任意一项所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂在作为凡纳滨对虾的饲料添加剂的应用。
5.一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料，其特征在于，包括普通凡纳滨对虾基础饲料 和凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂包括P -葡聚糖和蛋氨酸硒，^ -葡聚糖的添加量为15(T300mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料，蛋氨酸硒，以硒的量计算，添加量为0. 2mg/kg普通凡纳滨对奸基础饲料。
6.根据权利要求5所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料，其特征在于，所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂还包括维生素E，维生素E的添加量为100mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料。
7.—种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料，其特征在于，包括普通凡纳滨对虾基础饲料和凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂，所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂包括P -葡聚糖和维生素E，P -葡聚糖的添加量为15(T300mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料,维生素E的添加量为100mg/kg普通凡纳滨对虾基础饲料。
全文摘要
本发明公开了一种凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂及其应用和饲料。所述的凡纳滨对虾用复合免疫增强饲料添加剂包括β-葡聚糖和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量计算，β-葡聚糖和硒质量比为150~3000.2。本发明通过实验发现，将β-葡聚糖与蛋氨酸硒按一定的质量比联合添加，或者将β-葡聚糖与维生素E按一定的质量比联合添加，或者将β-葡聚糖与蛋氨酸硒、维生素E按一定的质量比联合添加到普通凡纳滨对虾基础饲料中，通过蛋氨酸硒和维生素E的抗氧化途径来提高凡纳滨对虾机体的免疫防御能力，能有效延长β-葡聚糖的免疫刺激时间、减少其使用剂量，同时缓解单独使用β-葡聚糖时产生免疫疲劳问题。本发明可直接添加到凡纳滨对虾的基础日粮中，使用方便。
文档编号A23K1/18GK102742729SQ20121020655
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者刘群芳, 曹俊明, 王国霞, 黄燕华 申请人:广东省农业科学院畜牧研究所, 广州飞禧特水产科技有限公司