本发明涉及肿瘤细胞领域，具体为一种基于脂类分子探针的外泌体分离方法。
背景技术：
外泌体是细胞主动向外分泌的，带有磷脂双分子层的囊泡。其大小不一，外观呈托盘状，直径在30nm～150nm之间。研究证实，多种细胞都能分泌外泌体，在血液，尿液，泪液，唾液，乳汁，腹水等多种体液中均可发现。虽然外泌体的形成机制及过程还不完全清楚且存在争论，但研究发现外泌体携带有蛋白，各种rna，甚至全基因组dna。这些分子，经外泌体可以被递送到邻近或远处的细胞周围再通过膜融合过程进入受体细胞。因此外泌体可以通过转移这类分子来调节受体细胞的功能和生理状态。在肿瘤研究中，越来越多的证据显示，外泌体能够调节肿瘤的免疫反应，参与形成肿瘤的前转移灶，决定肿瘤转移往何器官，还与肿瘤的化疗耐受直接相关。因此，外泌体可能是新型的肿瘤治疗靶点，也可以作为药物载体用作肿瘤治疗。在肿瘤检测中，其携带的蛋白和核酸则被认为是新型的肿瘤分子标志物。
目前，外泌体研究最大的障碍在于外泌体的分离收集。目前常用分离技术包括：基于密度的超高速离心分离、基于抗体的免疫富集分离、基于大小的过滤分离，和基于溶解度的沉积分离。这些方法存在各种缺点。举例来说，超高速分离，需要极其昂贵的超高速离心机，分离时间长达4hour～19hour，蛋白杂质污染严重造成纯度低，且在高达十多万个g（g指重力加速度）的离心力下，会造成外泌体的破裂。免疫分离通常使用epcam、cd9、hsp的相关抗体去捕获外泌体，但若细胞自身不表达这些蛋白时，则无法分离。此外外泌体之间也存在异质性，例如，即使肿瘤细胞表达epcam，也不意味着所有外泌体都携带epcam。总之，基于抗体的免疫分离极易造成分离的低效和假阴性。利用大小分离，效率极低，已报道的效率仅有不到2%。主要问题在于外泌体大小不一，又呈类似于红细胞一样的结构，即其厚度有时10nm都不到。过滤分离用的孔径过小时蛋白污染严重，过大时又分离不到。而利用溶解度沉积分离法，则主要是利用高浓度盐溶液，将外泌体从水相中逼出，其过程中很多蛋白也同时析出，造成蛋白污染严重，且该方法往往需要过夜沉积。综上，目前外泌体分离技术有限，效率低下，无法满足研究需要。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，提供一种耗时短、效率高的分离方法，本发明公开了一种基于脂类分子探针的外泌体分离方法。
本发明通过如下技术方案达到发明目的：
一种基于脂类分子探针的外泌体分离方法，其特征是：按如下步骤依次实施：
a.收集分离样品：对样品实施离心、超速离心或过滤操作以除去样品中的碎片，随后从样品中分离出外泌体；外泌体可以从新鲜收集的样品或从已冷冻或冷藏存储的样品中分离，对流体状的外泌体样品可以先通过离心、超速离心或过滤的方法中除去一些碎片，这样可以获得更高纯度的外泌体。
b.脂质探针peg化处理：peg是polyethyleneglycol的缩写，即聚乙二醇，对单酰基或二酰基的脂质探针实施peg化处理，使脂质探针的每个脂肪酸链含有的碳原子数为［12,24］区间内的正整数；peg可能含有6～48个环氧乙烷（缩写为eo），经过peg化的脂质探针可以直接固定在固体基底表面，用于从悬浮液中捕获外泌体，也可以和包含有外泌体的样本混合进行分离捕获。
c.制备脂质探针的储备溶液：将10µg脂质探针粉末转移到一个5ml的小玻璃瓶，然后加入无水醇或二甲亚砜至1mol/l浓度配制成储备溶液，储备溶液的存储温度不高于20℃；存储温度可以选用20℃室温、4℃或-20℃，如有长期储存的要求，存储温度可以选用-20℃或-80℃。
d.确定含量：用于分离外泌体的脂质探针的量由样品中的外泌体的量来确定，当样品中外泌体的量很多，或者样品的量比较大，可以使用多种脂质探针，通常，用于分离外泌体的脂质探针的量从1pmol～1µmol。
e.孵育：脂质探针样品的孵育在不高于20℃的温度下进行，孵育时间是任意的，可以在1sec～24hour之间，孵育时间主要由分离方法决定，如果脂质探针被固定在固体基底表面上，只有外泌体移动到足够接近表面时才可以被捕获，则需要相对较长的孵育时间，如果脂质探针直接与含有外泌体的样品混合，则孵育时间可缩短。
f.分离外泌体：将细胞培养物的上清液以800rpm的转速离心分离5min或以2000rpm的转速离心分离30min以去除细胞碎片，将200µl细胞培养物的上清液加入1ml稀释剂制得溶液a，同时将10nmol脂质探针也加入1ml稀释剂制得溶液b，将溶液a和溶液b混合制得混合溶液，将混合溶液通过涡旋震荡仪在4℃温度下轻轻混合1min～1hour以实施孵化，孵化后脂质探针标记出外泌体，利用脂质探针上的生物素和抗生物素蛋白包被的磁珠进行结合，从而分离出外泌体；
稀释剂选用pbs缓冲溶液，pbs是phosphatebuffersaline的缩写，即磷酸缓冲盐溶液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，由于na2hpo4和kh2po4在水中具有两级电离，因此pbs缓冲的ph值范围很广，nacl和kcl主要作用是增加离子浓度；如有需要pbs还可以补加1mmol/l的cacl2和0.5mmol/l的mgcl2，以提供两价阳离子。
g.固定：将从磁珠上捕获到的外泌体分别浸入质量百分比浓度为20%、30%、50%、70%、85%、95%和100%的乙醇梯度溶液各15min，随后将外泌体在不高于20℃的温度下用金溅射镀膜，冻干过夜，从而将从磁珠上捕获到的外泌体固定，外泌体的形态可以通过电镜扫描。
所述的基于脂类分子探针的外泌体分离方法，其特征是：脂质探针选用如下i～vi脂质分子中的任意一种：
i.单链脂质分子，碳链长度为c12～c24；
ii.双链脂质分子，碳链长度为c12～c24；
iii.碳链带有c=c双键；
iv.碳链的末端连接有亲水基团，所述亲水基团选用极性的磷酸基团；
v.碳链的任意位连接有活性基团，所述活性基团选用氨基、羧基、巯基和生物素中的任意一种，生物素又称维生素h，是b族维生素之一，生物素的结构中含有羧基、亚氨基等活性基团，用于脂质探针便于后续分离富集有外泌体的脂质分子；
vi.胆固醇。
所述的基于脂类分子探针的外泌体分离方法，其特征是：
步骤b脂质探针peg化处理时，脂质探针直接固定在固体基底表面以用于从悬浮液中捕获外泌体，或者脂质探针和包含有外泌体的样本混合进行分离捕获；
步骤e孵育时，如果脂质探针被固定在固体基底表面上，脂质探针样品的孵育时间不短于1hour；如果脂质探针直接和含有外泌体的样品混合，脂质探针样品的孵育时间为1min～8min。
本发明可在短时间内高效分离出外泌体，本发明利用peg脂质衍生物，例如peg化单酰基脂质、二酰基脂质或胆固醇来标记和分离外泌体，利用外泌体的脂质双分子层和应用peg化脂质探针标记分离外泌体。单链、双链、或胆固醇这些脂类物质能够自行插入到外泌体磷脂双分子层，脂质探针的亲脂性尾巴可以自发并即时插入到目标脂质膜，而与生物素结合的亲水头留在外面。采用本发明可以在数分钟内完成对外泌体的标记及分离，更重要的是，该方法允许各种后续分子分析，包括elisa，westernblot，基因组的提取，鉴定，扩增和测序。
本发明的有益效果是：耗时短，效率高。
附图说明
图1是本发明使用时的示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明。
实施例1
一种基于脂类分子探针的外泌体分离方法，按如下步骤依次实施：
a.收集分离样品：对样品实施离心、超速离心或过滤操作以除去样品中的碎片，随后从样品中分离出外泌体；外泌体可以从新鲜收集的样品或从已冷冻或冷藏存储的样品中分离，对流体状的外泌体样品可以先通过离心、超速离心或过滤的方法中除去一些碎片，这样可以获得更高纯度的外泌体。
b.脂质探针peg化处理：peg是polyethyleneglycol的缩写，即聚乙二醇，对单酰基或二酰基的脂质探针实施peg化处理，使脂质探针的每个脂肪酸链含有的碳原子数为［12,24］区间内的正整数；peg可能含有6～48个环氧乙烷（缩写为eo），经过peg化的脂质探针可以直接固定在固体基底表面，用于从悬浮液中捕获外泌体，也可以和包含有外泌体的样本混合进行分离捕获。
脂质探针选用如下i～vi脂质分子中的任意一种：
i.单链脂质分子，碳链长度为c12～c24；
ii.双链脂质分子，碳链长度为c12～c24；
iii.碳链带有c=c双键；
iv.碳链的末端连接有亲水基团，所述亲水基团选用极性的磷酸基团；
v.碳链的任意位连接有活性基团，所述活性基团选用氨基、羧基、巯基和生物素中的任意一种，生物素又称维生素h，是b族维生素之一，生物素的结构中含有羧基、亚氨基等活性基团，用于脂质探针便于后续分离富集有外泌体的脂质分子；
vi.胆固醇。
c.制备脂质探针的储备溶液：将10µg脂质探针粉末转移到一个5ml的小玻璃瓶，然后加入无水醇或二甲亚砜至1mol/l浓度配制成储备溶液，储备溶液的存储温度不高于20℃；存储温度可以选用20℃室温、4℃或-20℃，如有长期储存的要求，存储温度可以选用-20℃或-80℃。
d.确定含量：用于分离外泌体的脂质探针的量由样品中的外泌体的量来确定，当样品中外泌体的量很多，或者样品的量比较大，可以使用多种脂质探针，通常，用于分离外泌体的脂质探针的量从1pmol～1µmol。
e.孵育：脂质探针样品的孵育在不高于20℃的温度下进行，孵育时间是任意的，可以在1sec～24hour之间，孵育时间主要由分离方法决定，如果脂质探针被固定在固体基底表面上，只有外泌体移动到足够接近表面时才可以被捕获，则需要相对较长的孵育时间，通常不短于1hour，如果脂质探针直接与含有外泌体的样品混合，则孵育时间可缩短至1min～8min。
f.分离外泌体：将细胞培养物的上清液以800rpm的转速离心分离5min或以2000rpm的转速离心分离30min以去除细胞碎片，将200µl细胞培养物的上清液加入1ml稀释剂制得溶液a，同时将10nmol脂质探针也加入1ml稀释剂制得溶液b，将溶液a和溶液b混合制得混合溶液，将混合溶液通过涡旋震荡仪在4℃温度下轻轻混合1min至1hour以实施孵化，孵化后脂质探针标记出外泌体，利用脂质探针上的生物素和抗生物素蛋白包被的磁珠进行结合，从而分离出外泌体；
稀释剂选用pbs缓冲溶液，pbs是phosphatebuffersaline的缩写，即磷酸缓冲盐溶液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，由于na2hpo4和kh2po4在水中具有两级电离，因此pbs缓冲的ph值范围很广，nacl和kcl主要作用是增加离子浓度；如有需要pbs还可以补加1mmol/l的cacl2和0.5mmol/l的mgcl2，以提供两价阳离子。
g.固定：将从磁珠上捕获到的外泌体分别浸入质量百分比浓度为20%、30%、50%、70%、85%、95%和100%的乙醇梯度溶液各15min，随后将外泌体在不高于20℃的温度下用金溅射镀膜，冻干过夜，从而将从磁珠上捕获到的外泌体固定，外泌体的形态可以通过电镜扫描。
图1是本实施例分离外泌体的示意图，外泌体1置于容器内，脂质分子2包括由碳链21连接的亲油基团22、亲水基团23和活性基团24，其中活性基团24修饰在亲水基团23的一端。