基于dna快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法；通过在小粒径纳米金表面快速组装DNA序列和小分子后，继续在纳米金核表面再生成一定厚度的金壳，并由于此结构的特殊性而得到高效的SERS信号。该探针相较于其他方法组装快速，拉曼小分子存在于纳米金核壳之间固定尺寸的间隙中，从而每个分子所在的区域即“热点”区域产生的SERS信号基本一致，且有着很好的重复性，可用于生物传感器、生物分子检测及细胞成像等领域。
【专利说明】基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料的功能化及应用领域，涉及一种基于DNA快速组装技术的核 壳拉曼探针的制备方法。
【背景技术】
[0002] 表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)效应是指位于粗 糙金属表面的小分子本身的拉曼信号得到增强的现象。这种现象已在表面科学、分析科学 和生物科学等领域得到广泛的应用，为深入表征各种表面（界面）的结构和过程提供分子 上水平的信息，如鉴别分子或离子在表面上的键合、构型和取向以及材料的表面结构。关 于SERS的增强机制，目前较为认可的是电磁场增强机理，该机理中涉及到的"热点"（hot pot) -般是指在一些纳米粒子组成的聚集体中，相邻纳米粒子之间的空隙处区域，此区域 的SERS效应最强。但在金、银、铜等具有强SERS效应金属需要表面粗糙化处理后才具有高 SERS活性，这就要求所用金属基底的高重复性和均一性。
[0003] 纳米金颗粒可与氨基发生非共价的静电吸附，或与巯基形成强的Au-S共价键，从 而使得胶体金能够与生物活性分子相互结合，以形成生物体系检测的探针，目前被广泛应 用于免疫组织染色的电镜观察研究。然而在胶体金溶液的应用过程中，还存在着纳米金溶 胶稳定性受环境因素影响严重的问题，在电解质溶液中易形成不可逆聚集，影响其后续使 用。研究表明，DNA修饰的金溶胶可以稳定地存在于离子缓冲溶液中，将在盐离子存在的核 酸分子变性、复性、杂交等实验研究中有极好的应用前景。
[0004] 关于DNA修饰的核壳纳米金生物探针及制备的专利已有报道，通过对现有文献的 检索发现，中国发明专利CN103048306A公开了一种具有高SERS效应的核壳纳米金生物探 针及制备和应用；但这种制备方法中，参考了美国西北大学的Mirkin等将SH-DNA组装到纳 米金表面的技术，具体为：将SH-DNA加于纳米金溶液中，室温过夜后，逐次滴加磷酸盐缓冲 液，并使盐的终浓度在〇. 15M左右；结束后，再次室温过夜，通过长时间的盐老化步骤来实 现SH-DNA在纳米金颗粒表面的组装；组装过程较为繁琐（滴加次数至少6次，时间间隔至 少30min)耗时较长（需要约48h)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于DNA快速组装技 术的核壳拉曼探针的制备方法；除了本身具有纳米材料的一切特性，具备高的SERS效应 夕卜，还能够实现探针的快速制备，应用于生物分子检测及细胞成像等领域。具体而言，在本 发明中，通过酸溶液调节纳米金溶液的pH，催化等量SH-DNA在纳米金表面的吸附反应，实 现DNA在纳米金表面的组装只需约30min，组装快速，操作简单；这将大大提高核壳拉曼探 针制备效率。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 本发明公开了一种基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，在小粒径 纳米金核表面快速组装DNA后，修饰一层小分子，再继续在表面生成一层金壳，即得所述核 壳拉曼探针；所述核壳之间缝隙间存在具有拉曼信号的小分子。
[0008] 优选的，所述核壳拉曼探针的制备包括如下步骤：
[0009] A、纳米金核表面组装DNA ;
[0010] B、调节pH催化吸附反应；
[0011] C、离心洗涤后得溶液I;
[0012] D、纳米金核表面吸附小分子；
[0013] E、离心洗涤得溶液II;
[0014] F、纳米金核表面进行金壳的生长；
[0015] G、金壳结构离心洗涤。
[0016] 优选的，所述纳米金核为粒径为5?15nm的纳米金粒子。使用纳米金核过小，可 能导致其表面组装拉曼小分子量少以及制备核壳拉曼探针尺寸较小，从而影响探针的SERS 效率；使用纳米金核过大时，则导致所制备核壳拉曼探针过大，而造成聚集现象或是影响后 期应用（如应用于生物检测系统）等。
[0017] 优选的，所述组装DNA具体为：在纳米金核溶液（溶剂为磷酸缓冲液；纳米金核的 浓度为1〇ηΜ)中加入SH-PolyA DNA，至SH-PolyA DNA的终浓度为0. 1?5 μ M，混合溶液中 DNA与纳米金核的摩尔比约为300:1 ;室温下轻微震荡。DNA浓度过低时，不足以形成核壳 探针中间的缝隙，直接影响探针的SERS效率；DNA浓度过高则造成不必要的浪费。
[0018] 优选的，步骤Β具体为：边震荡边缓慢滴加0. 1?2Μ HC1溶液，调节步骤Α所得溶 液pH至2?4。更优选调节pH至2. 5?4。适合的pH值促进DNA的高效率组装，过低或 过高可能引起组装过程中纳米金的聚集。
[0019] 优选的，步骤C中，所述离心洗漆条件为：4°C，12000?15000rpm/min，20min，一 次，洗涤液为PH7. 4的10mM磷酸盐缓冲液（PB)溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸盐缓冲生理 盐水（PBS)重悬浮。转速过低造成探针的损失，过高可能会引起探针的聚集。
[0020] 优选的，步骤D具体为：每5 μ L?5mL溶液I中加入1?100 μ L，0. 1?1M小分 子溶液，吸附室温过夜；所述小分子是具有明显特征峰的小分子，选自5, 5'-二硫双（2-硝 基苯甲酸）（DTNB)、酞嗪（PL)、2, 3-二氮杂萘（ΡΗΤΗ)、花青类燃料、联二吡啶、荧光素异硫氰 酸酯（FITC)中的一种或几种。
[0021] 优选的，步骤Ε中，所述离心洗漆条件为：25°C，12000?15000rpm/min，20min，三 次，洗涤液为PH7. 4的10mM的PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸盐缓冲生理盐水（PBS)重 悬浮。
[0022] 优选的，步骤F具体为：溶液II中依次加入0. 1?5%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液 (PVP)，0. 1?1M的盐酸羟胺水溶液（ΝΗ20Η ·Η(：1)，边震荡边加入0. 01?1 %的氯金酸水溶 液（HAuC14)，混匀震荡lmin ;所述溶液II、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、盐酸羟胺水溶液、氯金 酸水溶液的体积比为10:5:2:2。
[0023] 优选的，步骤G中，所述离心洗漆条件为：20°C，3000?10000rpm/min，6min，三次， 洗涤液为Milli-Q水（超纯水），后用10?1000 μ L Milli-Q水重悬浮。
[0024] 本发明还涉及一种前述的方法制备得到的具有高SERS效应的核壳拉曼探针，所 述核壳拉曼探针粒径为40?50nm，浓度为0. 1?InM。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过在小粒径纳米金表面快 速组装一段DNA序列及拉曼小分子，通过还原法在金核表面生成一定厚度的金壳，核壳之 间存在一定尺寸的间隙，拉曼小分子就存在于此间隙中，并由于此结构的特殊性而得到高 效的SERS信号。此外，本发明组装快速，拉曼小分子存在于纳米金核壳之间固定尺寸（约 lnm)的间隙中，从而每个分子所在的区域即"热点"区域产生的SERS信号基本一致，且有着 很好的重复性。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0027] 图1为纳米金核壳探针结构的TEM图片；
[0028] 图2为制得的纳米金核壳拉曼探针的高效SERE效果示意图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0030] 实施例1
[0031] 10(^1^、1011]\1的粒径为1311111的纳米金溶液中加入4 4 1^，10(^]\^!11〇17六0嫩，室 温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为2. 5 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ LO. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过夜； 过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，边震荡边加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震荡lmin后，2(TC，4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液为 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径在40?50nm， 浓度为InM，具备DTNB高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0032] 图1为本实施例制得的纳米金核壳探针结构的TEM图片，由图1知，通过该方法 有效制备了纳米金的核壳结构，且可在核壳之间观察到明显的缝隙结构，此缝隙尺寸约为 lnm ;拉曼小分子DTNB，组装在纳米金核表面即位于核壳探针的缝隙处；DTNB所在的位置为 "热点"，从而引发高效的SERS效应。
[0033] 图2为本实施例制得的纳米金核壳拉曼探针的高效SERS结果，图中所出现的峰位 与DTNB的特征峰相吻合。
[0034] 实施例2
[0035] 100yL、10nM 的粒径为 13nm 的纳米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA， 室温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为3 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过夜； 过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH2OH.HCl，边震荡边加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震荡lmin后，2(TC，4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液为 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径在40?50nm， 浓度为InM，具备DTNB高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0036] 实施例3
[0037] 100 μ L、10nM的粒径为13nm的纳米金溶液中加入4 μ L，100 μ M SH-polyA DNA，室 温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为3. 5 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过夜； 过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，边震荡边加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震荡lmin后，2(TC，4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液为 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径在40?50nm， 浓度为InM，具备DTNB高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0038] 实施例4
[0039] 100yL、10nM 的粒径为 13nm 的纳米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA， 室温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为4 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过夜； 过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB (10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬浮；取 100μ L上述溶液，加入50μ L1%的PVP，25y LlOmM的NH20H.HC1，边震荡边加入20μ L0. 2% 的HAuC14，混勻震荡lmin后，2(TC，4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所用洗漆液为 Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径在40?50nm， 浓度为InM，具备DTNB高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0040] 实施例5
[0041] 100yL、10nM 的粒径为 13nm 的纳米金溶液中加入 4μ?，100μ M SH-polyA DNA， 室温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为4 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ L0. 1M的DTNB小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过 夜；过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬 浮；取l〇〇yL上述溶液，加入100yLl%的PVP，25yL10mM的NH20H*HC1，边震荡边加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震荡lmin后，20°C, 4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所 用洗涤液为Mi 11 i-Q水，后用100 μ L Mi 11 i-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径 在40?50nm，浓度为InM，具备DTNB高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0042] 实施例6
[0043] 100yL、10nM 的粒径为 13nm 的纳米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA， 室温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为4 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ LO. 1M的吡啶小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过 夜；过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬 浮；取l〇〇yL上述溶液，加入lOOyLl%的PVP，25yL10mM的NH20H*HC1，边震荡边加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震荡lmin后，20°C, 4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所 用洗涤液为Milli-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径 在40?50nm，浓度为InM，具备批陡高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0044] 实施例7
[0045] 100yL、10nM 的粒径为 13nm 的纳米金溶液中加入 4μ?，100μΜ SH-polyA DNA， 室温轻微震荡；后加入1M的HC1调节溶液pH，逐滴边震荡边加入，直至溶液pH为4 ;4°C， 12000rpm/min，20min条件下进行离心洗漆一次，洗漆液为PB(10mM，pH7. 4)，后用lmlO. 1M 的PBS重悬浮；100 μ L0. 1M的ΡΗΤΗ小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中，吸附室温过 夜；过夜溶液离心洗涤三次，所用洗涤液为PB(10mM，pH7.4)，后用lmlO. 1M的PBS重悬 浮；取1〇〇μ L上述溶液，加入100μ L1%的PVP，25y LlOmM的ΝΗ20Η · HC1，边震荡边加入 20 μ L0. 2%的HAuC14,混勻震荡lmin后，20°C, 4000rpm/min，离心洗漆三次，每次6min，所 用洗涤液为Milli-Q水，后用100 μ L Milli-Q水重悬浮；该方式制备得到的金壳结构粒径 在40?50nm，浓度为InM，具备ΡΗΤΗ高增强特征峰的一种核壳纳米金拉曼探针。
[0046] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【权利要求】
1. 一种基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在于，在小粒径纳 米金核表面快速组装DNA后，修饰一层小分子，再继续在表面生成一层金壳，即得所述核壳 拉曼探针；所述核壳之间缝隙间存在具有拉曼信号的小分子。
2. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，所述核壳拉曼探针的制备包括如下步骤： A、 纳米金核表面组装DNA; B、 调节pH催化吸附反应； C、 离心洗涤后得溶液I ; D、 纳米金核表面吸附小分子； E、 离心洗涤得溶液II ; F、 纳米金核表面进行金壳的生长； G、 金壳结构离心洗涤。
3. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，所述纳米金核为粒径为5?15nm的纳米金粒子。
4. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，所述组装DNA具体为：在纳米金核溶液中加入SH-PolyA DNA，至SH-PolyA DNA的终浓度 为0. 1?5 μ M，混合溶液中DNA与纳米金核的摩尔比约为300:1 ;室温下轻微震荡。
5. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，步骤Β具体为：边震荡边缓慢滴加0. 1?2MHC1溶液，调节步骤Α所得溶液pH至2?4。
6. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征 在于，步骤C中，所述离心洗漆条件为：4°C，12000?15000rpm/min，20min，一次，洗漆液为 PH7. 4的10mM PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸盐缓冲生理盐水重悬浮。
7. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，步骤D具体为：每5 μ L?5mL溶液I中加入1?100 μ L，0. 1?1M小分子溶液，吸附室 温过夜；所述小分子是具有明显特征峰的小分子，选自5,5' -二硫双（2-硝基苯甲酸）、酞 嗪、2, 3-二氮杂萘、花青类燃料、联二吡啶、荧光素异硫氰酸酯中的一种或几种。
8. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，步骤Ε中，所述离心洗涤条件为：25°C，12000?15000rpm/min，20min，三次，洗涤液为 pH7. 4的10mM的PB溶液，后用pH7. 4的0. 1M磷酸盐缓冲生理盐水重悬浮。
9. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征在 于，步骤F具体为：溶液II中依次加入0. 1?5%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，0. 1?1M的盐 酸羟胺水溶液，边震荡边加入0. 01?1 %的氯金酸水溶液，混匀震荡lmin ;所述溶液II、聚 乙烯吡咯烷酮水溶液、盐酸羟胺水溶液、氯金酸水溶液的体积比为10:5:2:2。
10. 如权利要求1所述的基于DNA快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法，其特征 在于，步骤G中，所述离心洗涤条件为：20°C，3000?10000rpm/min，6min，三次，洗涤液为 Mi 11 i-Q水，后用10?1000 μ L Milli-Q水重悬浮。
11. 一种如权利要求1?10中任意一项所述的方法制备得到的具有高SERS效应的核 壳拉曼探针，所述核壳拉曼探针粒径为40?50nm，浓度为0. 1?InM。
【文档编号】G01N21/65GK104062276SQ201410251096
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】胡冲娅, 颜娟, 何丹农, 宋世平, 樊春海, 余震 申请人:上海交通大学, 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司