一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明为一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，结合DNA滚 环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大。
[0002]
【背景技术】
[0003] 表面增强拉曼检测技术具有制样过程比较简单、非入侵和无损等独特的优点。表 面增强拉曼检测手段作为高灵敏的检测技术，越来越受到了科学界的关注，广泛应用于特 定序列DNA、检测蛋白质、体内原位检测、单碱基错配等生物分析中。由于其光学透明性，使 用二氧化硅壳在表面增强拉曼散射（SERS)为基础的生物传感应用提供了许多优势，能够稳 定存在于环境介质中，并改善生物相容性。
[0004] 我们报告了一种新的层层组装法，由二氧化硅、金纳米粒子（AuNP)和SERS信号分 子组成。金纳米粒子因为它们通过粒子结构的针孔的表面电磁场定位能力从单个颗粒强增 强效果，这种层层组装方法的提出，使得硅胶封装AuNP标签表现出较强的表面增强拉曼光 谱信号以及出色的多路复用功能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是：结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实 现双重信号放大检测凝血酶。在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成 双链DNA探针。在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链DNA探针结合，释放其中的一条 链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构 纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，通过检测拉曼信号实现凝血酶的检测。
[0006] 本发明采用的技术方案为： 制备了金纳米粒子（AuNP)，通过层层组装的方法将罗丹明异硫氰酸酯封装在AuNP和Si02壳之间。由于一个纳米粒子可封装大量的拉曼信号分子，增大了拉曼信号。制备的核 壳结构的纳米粒子表面修饰两种DNA链，形成生物条码探针，减少交叉反应。
[0007] 用磁珠作为载体，在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双 链DNA探针。凝血酶与其适体结合释放到溶液中，磁珠表面留下单链DNA探针作为引物。加 入锁扣式DNA，在T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶作用下，留下的DNA链发生滚环复制 反应，生成长链DNA。与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，从 而检测拉曼信号（附图1)。
[0008] 其具体步骤如下： 1)通过柠檬酸钠还原HAuC14的方法制备了纳米金，通过层层组装的方法将罗丹明异 硫氰酸酯封装在AuNP和Si02壳之间。再与比例为10:1的DNA链结合形成生物条码探针。
[0009] 2)通过羧基与氨基的共价键将一端带有氨基的探针信标固定在羧基功能化的磁 性纳米颗粒上，再与凝血酶适体杂交，获得识别探针。
[0010] 3)将目标凝血酶分子与识别探针混合，在磁珠表面进行杂交后，释放其中的一条 链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构 纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针。
[0011] 4)在外加磁场的作用下将多余的信号纳米粒子探针清洗干净，检测拉曼信号。利 用凝血酶的标准溶液获得检测的工作曲线，从工作曲线进行凝血酶实际样品的分析。
[0012] 本发明与现有技术相比，具有以下特点： 本发明用制备的核壳结构纳米探针包含大量拉曼信号分子，结合DNA滚环复制形成利 用双重信号放大，通过拉曼光谱检测，建立了一种高灵敏的拉曼光谱检测凝血酶的方法。相 对于现有的检测方法，有以下特点： (1)通过表面增强拉曼光谱检测，操作简单，灵敏度高。
[0013] (2)设计了一种核壳结构纳米探针，包含大量拉曼信号分子，可通过金增强作用进 行拉曼信号放大。制备的核壳结构的纳米粒子表面修饰两种DNA链，形成生物条码探针，减 少交叉反应。
[0014] (3)DNA滚环复制可形成具有重复碱基序列的DNA长链，一个靶分子可以结合大量 纳米粒子探针。
[0015] (4)双重信号放大提高了检测灵敏度。
[0016] 四、【附图说明】 图1.拉曼光谱检测凝血酶方法的示意图 五、【具体实施方式】 实施例1 :核-壳结构的拉曼信号标记纳米粒子制备 在快速搅拌下，将混合拉曼标签（罗丹明异硫氰酸酯）6yL(1.0XKT4M)加入到3mL的金胶溶液，使该混合物平衡反应20分钟。接下来，加入3mLPAA溶液Ug.L4)，用0. 1M 的NaOH调节pH值至7.0,在剧烈搅拌下逐滴加入，并搅拌3小时。聚合物包封的纳米 球的溶液，进行离心分离两次，以除去过量的聚合物分子，并再分散到水中。加偶联剂3 -氨基丙基三甲氧基硅烷加入到该溶液中至终浓度为3XKT7M，平衡反应20分钟。然后二 氧化硅壳长大使用改进的St€ober's方法，即通过使用氨作为催化剂在醇溶液中的正硅 酸乙酯（TE0S)的水解和缩合。简单地说，依次加入17mL异丙醇和200yL氨水（25%)。在 温和搅拌下，加入8yL正硅酸乙酯，把它分成四个部分平均每个部分1小时。正硅酸乙 酯添加完成后，使该混合物进行反应12小时，在4500rpm的转速下，将混合物离心分离 15分钟，清洗三次。最后，析出的染料编码拉曼标签再分散到水中。
[0017] 实施例2 :核-壳结构的拉曼信号标记纳米粒子的DNA功能化 把200yL3-三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐（TEPSA，200mM)加入到400yL上 述核-壳结构水溶液中，反应过夜。羧基修饰的核-壳结构离心洗涤三次，分散到200yL PBS(0? 1M，pH7.4)中以供以后使用。把 100yL含有 50mMNHSand200mMEDC溶液 加入到核-壳结构的溶液中来激活-C00H基团。孵育2小时后，加入50yL的氨基修饰的 生物条码探针溶液，静置过夜后，将溶液离心，并用PBS洗涤三次，得到洗涤适配体官能化 的颗粒，将其分散在800yL的PBS溶液，放在4°C下以备将来使用。
[0018] 实施例2 :磁珠表面探针的固定 用0. 1M，咪唑-HC1缓冲溶液（pH6. 8, 3X100yL)将50yL羧基修饰的磁珠的悬浮液 (10mg?mL-1)洗涤三次。然后把0. 1M的EDC溶液（100yL)加入到该MB溶液中，将混合 物在室温下震荡反应20分钟，以激活磁性纳米颗粒的羧酸酯基团。然后加入将氨基修饰的 捕获探针和凝血酶适体链（1.0X10-10mol?L，溶液，将所得混合物于37 °C下震荡反应 12小时。磁性分离后，用0.1MPBS缓冲液把磁性纳米颗粒洗涤三次。洗涤后的MNP/Si 再分散到200yL的PBS溶液。
[0019]实施例3 :拉曼检测凝血酶 在10yL探针修饰的磁性纳米颗粒分散液中滴入10yL不同浓度的凝血酶溶液反应 40分钟。加入10yL锁扣式DNA(10nM)，然后加入T4DNA连接酶Buffer(400U/凡，10 禮！'1^8-11(：1，？117.4，含1〇11111%(：12、1〇111101'1'和11111六了？），室温下孵育30分钟，最后 加入T4DNA连接酶（10X)和去离子水混合，在22 °C条件下反应1小时。锁扣DNA连接成 环状，并把修饰在磁珠上的DNA(Si)捕获。磁性分离以除去未被捕获的锁扣DNA，加入Phi 29 0嫩聚合酶的缓冲溶液（40禮1'1^8 11(：1，？117.5，含5〇11111((：1、1〇11111%(：12和5 1111 (NH4)2S04)、Phi29DNA聚合酶（0.5A，10U/Z〇，dNTPs(5A，1 禮)，在 37。。下反应 1 小时。反应完成后将反应液加热到65°C10分钟至Phi29聚合酶失活以此终止RCA反应。 记录不同浓度凝血酶溶液与样品的拉曼信号，获得凝血酶检测的工作曲线，并求出样品中 的凝血酶浓度。
【主权项】
1. 一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，其特征在于：制备了一 种携带有大量拉曼信号分子的核-壳结构的生物条码作为拉曼信号探针；在凝血酶存在 下，与固定在磁珠表面的双链脱氧核糖核酸（以下简称DNA)探针结合，释放其中的一条链； 留在磁珠上的探针发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的 DNA杂交，捕获拉曼信号探针，从而检测拉曼信号。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法在磁珠表面结合滚环复制 和核-壳结构的纳米粒子信号探针来实现双重信号放大。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法用磁珠作为载体，在磁珠 表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针；凝血酶与其适体结合 释放到溶液中，磁珠表面留下单链DNA探针作为引物；加入锁扣式DNA，在T4 DNA连接酶和 Phi 29 DNA聚合酶作用下，留下的DNA链发生滚环复制反应，生成长链DNA。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于制备了金纳米粒子（AuNP)，通过层层 组装的方法将罗丹明异硫氰酸酯封装在AuNP和Si02壳之间；由于一个纳米粒子可封装大 量的拉曼信号分子，增大了拉曼信号。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于制备的核壳结构的纳米粒子表面修饰 两种DNA链，形成生物条码探针，减少交叉反应。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于检测靶标为凝血酶。
【专利摘要】本发明涉及一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大。在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针。在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链DNA探针结合，释放其中的一条链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，通过检测拉曼信号实现凝血酶的检测。该方法具有广泛的适用性，适体与靶蛋白质结合引起的DNA分子机器过程相对比较简单，因此经过改变靶蛋白适体的序列的方法，来间接的检测相应的靶蛋白，此方法可以得到较为广泛的应用。
【IPC分类】G01N21-65
【公开号】CN104614358
【申请号】CN201410741458
【发明人】李雪梅, 王琳琳, 罗捷
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月9日