人胚胎干细胞的分化的制作方法
本申请是分案申请，其母案的中国申请号是201180023585.3，国际申请号是pct/us2011/036043，申请日是2011年5月11日。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2010年5月12日提交的美国临时专利申请no.61/333,831的权益，其全文以引用的方式并入本文以满足所有的目的。
本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体地讲，本发明提供了一种制备表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群的方法，其大于50％的细胞共表达pdx1和nkx6.1。
背景技术：
用于i型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标记物，诸如hnf3β、gata4、mixl1、cxcr4和sox17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠的同源盒基因pdx1。在不存在pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，lumelsky等人(science292:1389,2001(《科学》，第292卷，第1389页，2001年))报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构分化。soria等人(diabetes49:157,2000(《糖尿病》，第49卷，第157页，2000年))报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
在一个实例中，hori等人(pnas99:16105,2002(《美国国家科学院院刊》，第99卷，第16105页，2002年))公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(ly294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与β细胞相似的细胞。
又如，blyszczuk等人(pnas100:998,2003(《美国国家科学院院刊》，第100卷，第998页，2003年))报道，从组成型表达pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成pdx1阳性胰腺内胚层。胚胎干细胞分化第4天即对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，诱导pdx1表达最有效的方式是向培养物中加入视黄酸(diabetes54:301,2005(《糖尿病》，第54卷，第301页，2005年))。
miyazaki等人报道了过表达pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源pdx1表达明显增强所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin)3、p48、pax6和hnf6基因的表达(diabetes53:1030,2004(《糖尿病》，第53卷，第1030页，2004年))。
skoudy等人报道，激活素a(tgf-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nm激活素a时观察到了最大效应。他们也观察到胰岛素和pdx1的mrna表达水平并未受到视黄酸的影响；然而，3nmfgf7处理导致了pdx1转录物的水平增加(biochem.j.379:749,2004(《生物化学杂志》，第379卷，第749页，2004年))。
shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，tgf-β2可再现地产生更高比例的pdx1阳性细胞(genescells.2005jun；10(6):503-16(《基因到细胞》，2005年6月，第10卷第6期，第503-516页))。
gordon等人阐明了在没有血清存在而有激活素连同wnt信号传导抑制剂存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/hnf3β[阳性]内胚层细胞(us2006/0003446a1)。
gordon等人(pnas,vol103,page16806,2006(《美国国家科学院院刊》，第103卷，第16806页，2006年))提出“前原条的生成需要同时伴有wnt和tgf-β/nodal/激活素信号”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
thomson等人从人胚泡分离出了胚胎干细胞(science282:114,1998(《科学》，第282卷，第114页，1998年))。同时，gearhart及同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(heg)细胞系(shamblottetal.,proc.natl.acad.sci.usa95:13726,1998(shamblott等人，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13726页，1998年))。与可简单通过与白血病抑制因子(lif)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利no.6,200,806；wo99/20741；wo01/51616)。
d’amour等人描述了在高浓度激活素和低浓度血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(naturebiotechnology2005(《自然生物技术》，2005年))。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入fgf-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成pdx1阳性细胞(us2005/0266554a1)。
d’amour等人(naturebiotechnology-24,1392-1401(2006)(《自然生物技术》，第24卷，第1392-1401页，2006年))声称：“我们研究出了一种分化方法，其可将人胚胎干(hes)细胞转化成能够合成胰激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和葛瑞林(ghrelin)的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过通向能表达内分泌激素的细胞的类似定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的各阶段，来模拟体内胰腺器官发生”。
又如，fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(us2006/0040387a1)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。使用丁酸钠和激活素a混合物将人类胚胎干细胞首先分化为内胚层细胞。随后将该细胞用tgf-β拮抗剂例如成头蛋白与egf或乙胞素的混合物培养以产生pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，benvenistry等人声称：“我们得出结论：pdx1的过量表达增强胰腺丰富基因的表达，诱导胰岛素表达可能需要仅在体内存在的额外信号”(benvenistryetal,stemcells2006；24:1923-1930(benvenistry等人，《干细胞》，2006年，第24卷，第1923-1930页))。
在另一个实例中，grapin-botton等人声称：“ngn3的早期活化几乎完全诱导胰高血糖素+细胞，同时耗尽胰腺祖细胞的库。从el1.5开始，pdx-1祖细胞具备了分化成胰岛素[阳性]和pp[阳性]细胞的能力”(johanssonkaetal,developmentalcell12,457-465,march2007(johanssonka等人，《发育细胞》，第12卷，第457-465页，2007年3月))。
例如，diez等人声称；“在9周和10周，大部分胰高血糖素阳性细胞共表达胰岛素，尽管在这些阶段可清楚地检测到明显只表达胰岛素的细胞。在整个研究期间(9至21周)观察到共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞，但是它们仅代表一小部分表达胰岛素和胰高血糖素的总体细胞”(jhistochemcytochem.2009sep；57(9):811-24.2009apr13(《组织化学与细胞化学杂志》，2009年9月；第57卷第9期，第811-824页。2009年4月13日))。
在一个实例中，chen等人声称“(-)-indolactamv-[(ilv)]活化蛋白激酶c信号传导并且指导已经定型成内胚层谱系的hesc的胰特化ilv和视黄酸通过相关的机制发挥作用ilv显示比视黄酸更强烈地诱导表达pdx-1的细胞(表达pdx-1的细胞的百分数)”(naturechemicalbiology5,195-196(april2009)(《自然化学生物》，第5卷，第195-196页(2009年4月))doi:10.1038/nchembio0409-195)。
lyttle等人声称：“nkx6-1仅与胰岛素细胞共定位，这表明nkx6-1仅参与人β细胞发育”(diabetologia2008jul:51(7):1169-80,2008(《糖尿病学》，2008年7月，第51卷第7期，第1169-1180页，2008年))。
因此，仍特别需要开发产生表达胰岛素的功能细胞的体外方法，所述细胞与β细胞更为密切地相似。本发明采取替代方法，通过产生表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群来提高使人胚胎干细胞向胰岛素表达细胞分化的效率，其中所述细胞群中超过50％的细胞共表达pdx-1和nkx6.1。
技术实现要素：
在一个实施例中，本发明提供了一种表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中细胞群中大于50％的细胞共表达pdx1和nkx6.1。
在一个实施例中，本发明提供将多能干细胞群分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞群，
b.使该多能干细胞群分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，和
c.使用补充了蛋白激酶c活化剂的培养基处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，可以使表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群。
在一个实施例中，在通过本发明的方法产生的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群中，大于50％的细胞共表达pdx-1和nkx6.1。
附图说明
图1a和1b表示实例1概述的分化方案阶段4第4天的pdx1、nkx6.1和isl-1的表达。图1a表示pdx1和nkx6.1的表达。图1b表示nkx6.1和isl-1的表达。
图2a和2b表示pkc活化剂处理对表达pdx1、nkx6.1和cdx2的细胞的百分比的影响(经incellanalyzer1000分析，图2a)，并比较了不同pkc活化剂及其对表达pdx1和nkx6.1的细胞的百分比的影响(经incellanalyzer分析，图2b)。
图3a、3b和3c表示在肾囊下植入本发明细胞的scid-beige小鼠的血循环c-肽(图3a)，在皮下植入theracyte装置时的血循环c-肽(图3b)。在标示的时间检测了c-肽水平。图3c表示在肾囊下植入细胞的组和利用皮下theracyte装置植入细胞的组在移植12周后观察到的c-肽水平比较。
图4a、4b、4c和4d示出了根据实例3所述方法处理过的细胞中，pkc活化剂处理对pdx1、nkx6.1、ngn3和ptf1α表达的影响。
图5a、5b、5c和5d示出了根据实例4所述方法处理过的细胞中，fgf7对nkx6.1、pdx1、ptf1α和cdx2表达的影响。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数的组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
干细胞根据其发育潜能分类为：(1)全能性，意指能够产生全部胚胎细胞和胚外细胞类型；(2)多能性，意指能够产生全部胚胎细胞类型；(3)多潜能，意指能够产生细胞系的子类，但是均处于特定组织、器官或生理学系统内(例如，造血干细胞(hsc)可以产生子代，其包括(自我更新性)hsc、血液细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的全部细胞类型和要素(例如，血小板)；(4)寡潜能，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞系的子类；和(5)单潜能，意指能够产生单一细胞谱系(例如，精子发生干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：sox17、gata4、hnf3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、短尾蛋白、mix样同源盒蛋白、fgf4cd48、脱中胚蛋白(eomes)、dkk4、fgf17、gata6、cxcr4、c-kit、cd99或otx2。表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：pdx1、nkx6.1、hnf1β、ptf1α、hnf6、hnf4α、sox9、hb9或prox1。表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标记物：hnf3β、gata4、sox17、cerberus、otx2、goosecoid、c-kit、cd99和mixl1。
如本文所用，“标记物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标记物的水平增加，而阴性标记物的水平降低。标记物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
本文所用的“胰内分泌细胞”或“胰激素表达细胞”或“表达胰内分泌谱系特征性标记物的细胞”指能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可以表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(ssea)3和4，以及可使用称为tra-1-60和tra-1-81的抗体检测的标记物(thomsonetal.,science282:1145,1998(thomson等人，《科学》，第282卷，第1145页，1998年))。多能干细胞体外分化导致丧失ssea-4、tra1-60和tra1-81的表达(如果存在的话)，并增加ssea-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用vectorred作为底物显影来检测，如生产商(加利福尼亚州伯林盖姆的媒介实验室(vectorlaboratories,burlingamecalif))所描述。未分化的多能干细胞通常也表达oct4和tert，这可通过rt-pcr检测。
增殖的多能干细胞的另一期望表型是有潜能分化成所有三个胚层的细胞：内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(scid)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标记物的存在来确定多能性。
可以使用标准g带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系h1、h7和h9(wicell)。也可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如bg01v(乔治亚州雅典bresagen(bresagen,athens,ga))。
在一个实施例中，人胚胎干细胞如thomson等人所述进行制备(美国专利no.5,843,780；science282:1145,1998(《科学》，第282卷，第1145页，1998年)；curr.top.dev.biol.38:133ff.,1998(《发育生物学当代课题》，第38卷，第133ff.页，1998年)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:7844,1995(《美国国家科学院院刊》，第92卷，第7844页，1995年))。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上培养多能干细胞：reubinoff等人(naturebiotechnology18:399-404(2000)(《自然生物技术》，第18卷，第399-404页，2000年))。作为另外一种选择，可以根据如下文献中公开的方法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上培养多能干细胞：thompson等人(science6november1998:vol.282.no.5391,pp.1145-1147(《科学》，1998年11月6日，第282卷，第5391期，第1145-1147页))。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的任何一种饲养细胞层上培养多能干细胞：richards等人(stemcells21:546-556,2003(《干细胞》，第21卷，第546-556页，2003年))。
在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法在人饲养细胞层上培养多能干细胞：wang等人(stemcells23:1221-1227,2005(《干细胞》，第23卷，第1221-1227页，2005年))。在一个替代实施例中，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞：stojkovic等人(stemcells200523:306-314,2005(《干细胞》，第23卷，第306-314页，2005年))。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞：miyamoto等人(stemcells22:433-440,2004(《干细胞》，第22卷，第433-440页，2004年))。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞：amit等人(biol.reprod68:2150-2156,2003(《生殖生物学》，第68卷，第2150-2156页，2003年))。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞：inzunza等人(stemcells23:544-549,2005(《干细胞》，第23卷，第544-549页，2005年))。
在一个实施例中，可以在根据us20020072117公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据us6642048公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据w02005014799公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据如下文献公开的方法所得培养基中培养多能干细胞：xu等人(stemcells22:972-980,2004(《干细胞》，第22卷，第972-980页，2004年))。作为另外一种选择，可以在根据us20070010011公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据us20050233446公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据us6800480公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据w02005065354公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。
在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法培养多能干细胞：cheon等人(bioreproddoi:10.1095/biolreprod.105.046870,october19,2005(《生殖生物学》，doi:10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日))。作为另外一种选择，可以根据如下文献公开的方法培养多能干细胞：levenstein等人(stemcells24:568-574,2006(《干细胞》，第24卷，第568-574页，2006年))。作为另外一种选择，可以根据us20050148070公开的方法培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以根据us20050244962公开的方法培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以根据w02005086845公开的方法培养多能干细胞。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可由下列组分制成，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium,dmem)，gibco#11965-092；敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(knockoutdulbecco'smodifiedeagle'smedium,kodmem)，gibco#10829-018；ham'sf12/50％dmem基础培养基；200mml-谷氨酰胺，gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，gibco11140-050；β-巯基乙醇，西格玛公司(sigma)#m7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)，gibco#13256-029。
由多能干细胞形成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞
在一个实施例中，本发明提供了由多能干细胞制备表达胰内胚层谱系特征性标记物的细胞群的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞群，
b.使该多能干细胞群分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，和
c.使用补充了蛋白激酶c活化剂的培养基处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，可以使表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群。
在本发明的一个方面，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于50％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于60％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于70％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于80％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于90％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。
在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群还可以进行处理以形成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由表达所需细胞类型特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标记物和核酸标记物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)、northern印迹、原位杂交(参见，例如，currentprotocolsinmolecularbiology(《精编分子生物学实验指南》)(ausubel等人编辑，2001增刊))以及免疫测定(例如切片材料的免疫组织化学分析)、western印迹和在完整细胞中可接近的标记物的流式细胞术分析(facs)(参见，例如，harlow和lane，usingantibodies:alaboratorymanual,newyork:coldspringharborlaboratorypress(1998)(《抗体技术实验指南》，纽约冷泉港实验室出版社，1998年))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续辨别。多能干细胞标记物包括(例如)一种或多种下列标记物的表达：abcg2、cripto、foxd3、connexin43、connexin45、oct4、sox2、nanog、htert、utfi、zfp42、ssea-3、ssea-4、tra1-60、tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物(如cxcr4)来纯化分化的细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括(例如)人胚胎干细胞系h9(nih代码：wa09)、人胚胎干细胞系hi(nih代码：wa01)、人胚胎干细胞系h7(nih代码：wa07)以及人胚胎干细胞系sa002(瑞典的cellartis公司(cellartis,sweden))。表达下列多能细胞特征性标记物中的至少一种的细胞也适用于本发明：abcg2、cripto、cd9、foxd3、connexin43、connexin45、oct4、sox2、nanog、htert、utfi、zfp42、ssea-3、ssea-4、tra1-60和tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标记物选自sox17、gata4、hnf3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、brachyury、mix样同源盒蛋白、fgf4、cd48、脱中胚蛋白(eomes)、dkk4、fgf17、gata6、cxcr4、c-kit、cd99和otx2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标记物的细胞为原条前体细胞。
在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是定形内胚层细胞。
胰内胚层谱系特征性标记物选自pdx1、nkx6.1、hnf1β、ptf1α、hnf6、hnf4α、sox9、hb9和prox1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标记物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰内分泌谱系特征性标志物选自ngn3、neurod、nkx2.2、pdx1、nkx6.1、pax4和pax6。在一个实施例中，胰内分泌细胞能够表达至少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰内分泌谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标记物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可以是表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可以是分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标记物的细胞。表达β细胞系特征性标记物的细胞表达pdx1以及至少一种以下转录因子：ngn3、nkx2.2、nkx6.1、neurod、sl1、hnf3β、mafa、pax4和pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标记物的细胞是β细胞。
多能干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标记物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标记物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据d’amouretal,naturebiotechnology23,1534-1541(2005)(d’amour等人，《自然生物技术》，第23卷，第1534-1541页，2005年)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据shinozakietal,development131,1651-1662(2004)(shinozaki等人，《发育》，第131卷，第1651-1662页，2004年)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据mcleanetal,stemcells25,29-38(2007)(mclean等人，《干细胞》，第25卷，第29-38页，2007年)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据d’amouretal,naturebiotechnology24,1392-1401(2006)(d’amour等人，《自然生物技术》，第24卷，第1392-1401页，2006年)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.11/736,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.11/779,311中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.60/990,529中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.61/076,889中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.61/076,900中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.61/076,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请no.61/076,915中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞向表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞的分化
在一个实施例中，本发明提供了由多能干细胞制备表达胰内胚层谱系特征性标记物的细胞群的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞群，
b.使该多能干细胞群分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，和
c.使用补充了蛋白激酶c活化剂的培养基处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，可以使表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群。
在本发明的一个方面，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于50％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于60％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于70％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于80％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。在一个替代实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中大于90％的细胞群共表达pdx-1和nkx6.1。
在一个实施例中，蛋白激酶c活化剂选自(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺、indolactamv(ilv)、佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(pma)和佛波醇12,13-二丁酸酯(pdbu)。在一个实施例中，蛋白激酶c活化剂是(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺。(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺可以按约20nm至约500nm的浓度使用。(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺在本文中称作“tpb”。
在一个实施例中，在补充了蛋白激酶c活化剂的培养基中再加入选自以下的至少一种因子：能够抑制bmp的因子、tgfβ受体信号传导抑制剂和成纤维细胞生长因子(fgf)。
在一个实施例中，能够抑制bmp的因子为成头蛋白。成头蛋白可以按约50ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白按100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，tgfβ受体信号传导抑制剂是alk5的抑制剂。在一个实施例中，alk5的抑制剂是alk5抑制剂ii。alk5抑制剂ii可以按约0.1μμ至约10μμ的浓度使用。在一个实施例中，alk5抑制剂ii按1μμ的浓度使用。
在一个实施例中，成纤维细胞生长因子是fgf7。在一个替代实施例中，成纤维细胞生长因子是fgf10。
在一个实施例中，成纤维细胞生长因子可以按约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成纤维细胞生长因子按50ng/ml的浓度使用。
使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系标记物的细胞
在一个实施例中，可采用本领域的任何方法使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
例如，可以根据如下文献中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群：d’amouretal,naturebiotechnology,2006(d’amour等人，《自然生物技术》，2006年)。
例如，可以根据如下文献中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群：d’amouretal,naturebiotechnology,2006(d’amour等人，《自然生物技术》，2006年)。
例如，可以根据美国专利申请no.11/736,908中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
例如，可以根据美国专利申请no.11/779,311中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
例如，可以根据美国专利申请no.60/953,178中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
例如，可以根据美国专利申请no.60/990,529中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
例如，可以根据美国专利申请no.61/289,671中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
形成本发明的细胞群
人胚胎干细胞系hl的细胞在
a.dmem/f12+2％fbs+50ng/mlfgf7处理三天(阶段2)，随后
b.dmem-高葡萄糖+1％b27+0.25μμ环巴胺-kaad+2μμ视黄酸
(ra)+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段3)，随后要么
c.进行处理1：dmem-高葡萄糖+1％b27处理四天(阶段4-基础培养基-bm)，或
d.进行处理2：dmem-高葡萄糖+1％b27+100ng/ml成头蛋白+1μμalk5抑制剂ii处理四天(阶段4)，或
e.进行处理3：dmem-高葡萄糖+1％b27+100ng/ml成头蛋白+1μμalk5抑制剂ii+20nm佛波醇12,13-二丁酸酯(pdbu)(calbiochem，目录号524390)处理四天(阶段4)。
在阶段4第4天一式二份对培养物取样，然后使用incellanalyzer1000(通用电气医疗集团(gehealthcare))进行成像。从每孔100个视野获取图像，以补偿生物测定和后续染色过程中的任何细胞损失。使用incelldeveloper工具箱1.7(通用电气医疗集团(gehealthcare))软件从每个孔获得总细胞数、表达pdx1的总细胞、表达nkx6.1的总细胞和表达cdx-2的总细胞的测量值。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。表达pdx1、nkx6.1和cdx-2的总细胞将以总细胞群百分比报告。
如图2a所示，在阶段4第4天结束时，在所有实验细胞群中占细胞群大约92％±4％的细胞表达了pdx1。然而，与经基本培养基处理(处理1)或者经alk5抑制剂ii和成头蛋白处理(处理2)的细胞群相比，pdbu(一种蛋白激酶c活化剂)处理引起了表达pdx1的细胞群中表达nkx6.1的细胞百分比显著增加(图2a)。pdbu处理组中，总细胞群中88％±4.2％表达了nkx6.1，而接受处理2的细胞中62％±8％表达了nkx6.1，接受处理1的细胞中46.7±0.2％表达了nkx6.1。在阶段4，大部分表达nkx6.1的细胞也表达pdx1。通过叠加从给定细胞群获得的pdx1表达和nkx6.1表达图像确认了这些观察结果(图1a)。这些数据表明，补充了蛋白激酶c活化剂的培养基对细胞进行处理，能增加表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群中共表达pdx1和nkx6.1的细胞百分比。
在接受处理1的细胞群中，10％的细胞表达cdx2(肠标记物)(图2a)。接受处理2或3的细胞群中，少于5％的细胞表达cdx2。在任何情况下，表达cdx2的大多数细胞并不共表达pdx1和nkx6.1。
用以下蛋白激酶c活化剂对阶段3的平行细胞群进行处理：浓度为20nm的佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(pma)(calbiochem#524400)，或浓度为50nm的[(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺](tpb)(calbiochem#565740)，替换上述处理3中的pdbu。在阶段4第4天结束时，经pma处理的细胞群中91％的细胞表达nkx6.1，经tpb处理的细胞群中90％的细胞表达nkx6.1。在所有处理中并未观察到表达pdx1的总细胞有显著差异。参见图2b。
本实例表明，蛋白激酶c活化剂可按相对较低的浓度使用，以便上调nkx6.1的表达，并增加表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群内共表达pdx1和nkx6.1的细胞百分比。
实例2
本发明细胞植入重度联合免疫缺陷(scid)-beige(bg)小鼠
人胚胎干细胞系hl的细胞在
a.dmem/f12+2％fbs+50ng/mlfgf7处理三天(阶段2)，然后
b.dmem-高葡萄糖+1％b27+0.25μμ环巴胺-kaad+2μμ视黄酸(ra)+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段3)，随后
c.dmem-高葡萄糖+1％b27+100ng/ml成头蛋白+1μμalk5抑制剂ii+50nmtpb处理四天(阶段4)。
从塔科尼克农场(taconicfarms)购买五至六周龄的雄性scid-beige小鼠(c.b-igh-ib/gbmstac-prkdcscid-lystbgn7)。将小鼠圈养在微隔离笼(microisolatorcage)中，自由获得无菌食物和水。在手术准备中，小鼠通过耳部加标签来辨别，称量其体重，并使用手持式血糖仪(理康公司的稳捷型血糖仪(onetouch,lifescan))来测定其血糖。
用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，用小型动物剪毛剪给手术部位剃毛。在手术前经小鼠皮下给予0.1mg.kg丁丙诺啡(buprenex)。使用70％异丙醇和10％聚维酮-碘进行连续清洗，以准备好手术部位。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板上培养过夜。在小鼠的手术前准备期间，将这些细胞在1.5ml离心管中离心，移除大部分上清液，留下的量刚好足以收集细胞沉淀物。将细胞收集进瑞宁(rainin)pos-d正位移移液器中，并倒置该移液器以让细胞通过重力沉降。弃去过量的培养基，留下用于移植的浓集细胞制剂。
为了移植，将24g×3/4"静脉留置管用于穿透肾囊，移除针头。然后在肾囊下推进导管至肾脏的远极。将pos-d移液枪头牢固置于导管的插孔中，将5百万个细胞从移液器通过肾囊下的导管分配，并递送至肾脏的远极。通过低温烧灼而封闭肾囊，使肾回复至其初始解剖位置。平行地，用post-d移液枪头将含有5百万个细胞的细胞聚集体加载至50μl装置中。该50μl装置购自加利福尼亚州欧文的theracyte公司(theracyte,inc(irvine,ca))。加入之后，用a型医用聚硅氧烷粘合剂(道康宁(dowcorning)，目录号129109)对装置进行密封，然后皮下植入sicd/bg小鼠(第3和4号动物)。通过用5-0vicryl缝线连续缝合来闭合肌肉，并用缝合夹闭合皮肤。在手术后给小鼠皮下给予1.0mg.kg美洛昔康(metacam)。使小鼠脱离麻醉并让其完全恢复。
在移植之后，每周称重小鼠一次，每周测量血糖两次。在移植之后的多个时间间隔，给小鼠腹膜内给予3g/kg葡萄糖，并在注射葡萄糖后60分钟经由眶后窦抽取血液进装有少量肝素的离心管中。将血液离心，将血浆置于第二微量离心管中，在干冰上冷冻，然后在-80℃下保存直至进行人c肽测定。使用mercodia/alpco诊断试剂公司(alpcodiagnotics)超敏c肽elisa(目录号80-cpthu-e01，新罕布什尔州的alpco诊断试剂公司(alpcodiagnostics,nh))根据制造商的说明测定人c肽水平。
早在肾囊组和接纳theracyte装置的组植入后的4到6周就能同时从两个组的动物血清中检测到人c-肽，其含量随着时间的推移而增加(图3a和3b)。三个月结束时，对肾囊组和植入theracyte装置的组的所有动物施用葡萄糖后，我们能够检测到数量显著的血循环人c-肽。三个月之后，肾囊组中葡萄糖激发的人c-肽血清水平为1.7±0.5ng/ml(n＝4)，接受theracyte装置移植的小鼠中葡萄糖激发的人c-肽血清水平为1±0.5ng/ml(n＝2)(图3c)。
本实例表明，蛋白激酶c活化剂生成的共表达pdx1和nkx6.1的细胞群，在体内有进一步分化成胰岛素分泌细胞的能力。进一步分化成胰岛素分泌细胞的潜能并不取决于局部环境。我们证实在肾囊中及在皮下位点的免疫保护装置内，共表达pdx1和nkx6.1细胞能进一步分化成胰岛素分泌细胞。
实例3
形成本发明细胞群的替代方法
人胚胎干细胞系h1的细胞在
a.dmem/f12+2％fbs+50ng/mlfgf7处理三天(阶段2)，随后
b.dmem-高葡萄糖+1％b27+0.25μμ环巴胺-kaad+2μμ视黄酸(ra)+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段3)，随后要么
c.进行处理4：dmem-高葡萄糖+1％b27+20nmpdbu+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段4)，或
d.进行处理5：dmem-高葡萄糖+1％b27+100ng/ml成头蛋白+1μμalk5抑制剂ii+20nmpdbu处理四天(阶段4)，或
e.进行处理6：dmem-高葡萄糖+1％b27+50ng/mlfgf10+20nmpdbu处理四天(阶段4)。
研究了其它因子对蛋白激酶c活化剂介导的共表达pdx1和nkx6.1的细胞百分比增加的影响。如以上实例1所述在阶段4第4天一式二份对培养物取样并进行图像分析。也记录了isl1和neurod1的表达。
在本研究中，大部分表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群对pdx1表达是阳性的。大多数表达pdx1的细胞同样对nkx6.1表达也是阳性的。如表1所示，仅添加pkc活化剂便有利于表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群中形成表达nkx6.1的细胞(处理4)。到阶段4第4天为止，总细胞群中93％是nkx6.1阳性的，几乎所有表达nkx6.1的细胞对pdx1表达是阳性的。
向补充了蛋白激酶c活化剂的培养基中添加alk5抑制剂ii(处理5)不会影响观察到的nkx6.1表达量增加。细胞群中57.1％的细胞表达neurod1，细胞群中52.4％的细胞表达isl1，表明在进行该处理后，细胞群中内分泌前体细胞的百分比增加了。参见表1。
对本实例中获得的样品进行pcr分析发现，与接受处理5的细胞相比，接受处理4的细胞群中pdx1、nkx6.1和ptf1α的表达量增加了。参见图4a-4d。
另一方面，在接受alk5抑制剂2和pdbu(处理5)的细胞中观察到ngn3表达量显著增加。参见图4a-4d。
也研究了向补充了蛋白激酶c活化剂的培养基添加fgf10(处理6)的影响。加入浓度为50ng/ml的fgf10并结合pdbu(处理6)，产生了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，该细胞群中90％的细胞表达nkx6.1，然而大部分表达nkx6.1的细胞也是cdx2阳性的。参见表l。与经pdbu和成头蛋白处理的细胞内的观察值相比，pdx1、nkx6.1和ptf1α的mrna水平并未增加。参见图4a-4d。
本实例证实，可使用相对较低浓度(大约20nm)的蛋白激酶c活化剂并结合bmp抑制剂，以制备表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，该细胞群中大于90％的细胞共表达pdx1和nkx6.1。
表1
实例4
形成本发明细胞群的替代方法
人胚胎干细胞系hl的细胞在
a.dmem/f12+2％fbs+50ng/mlfgf7处理三天(阶段2)，随后要么
b.进行处理7(t7)：dmem-高葡萄糖+1％b27+0.25μμ环巴胺-kaad+2μμ视黄酸(ra)+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段3)，或
c.进行处理8(t8)：dmem-高葡萄糖+1％b27+0.25μμ环巴胺-kaad+2μμ视黄酸(ra)+100ng/ml成头蛋白+fgf750ng/ml处理四天(阶段3)，随后要么
d.进行处理9(t9)：dmem-高葡萄糖+1％b27+100ng/ml成头蛋白+1μμalk5抑制剂ii+20nmpdbu处理四天(阶段4)，或
e.进行处理10(t10)：dmem-高葡萄糖+1％b27+50ng/mlfgf10+20nmpdbu处理四天(阶段4)，或
f.进行处理11(t11)：dmem-高葡萄糖+1％b27+20nmpdbu+100ng/ml成头蛋白处理四天(阶段4)。
在阶段4第4天一式二份对培养物取样，然后使用incellanalyzer1000(gehealthcare)进行成像。从每孔100个视野获取图像，以补偿生物测定和后续染色过程中的任何细胞损失。使用incelldeveloper工具箱1.7(gehealthcare)软件从每个孔获得总细胞数、表达pdx1的总细胞、表达nkx6.1的总细胞和表达cdx2的总细胞的测量值。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。表达pdx1、nkx6.1和cdx-2的总细胞将以总细胞群百分比报告。
在先用t7培养基处理再用t9培养基处理的细胞群中，细胞群中大约80％的细胞表达nkx6.1。参见表2。在先用t7培养基处理再用t10培养基处理的细胞群中，90％的细胞表达nkx6.1，然而在该处理中观察到更多表达cdx2的细胞。参见表2。先用t7培养基处理再用t11培养基处理细胞群，产生了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中该细胞群中93％的细胞表达nkx6.1。细胞群中表达nkx6.1的大多数细胞也表达pdx1。
先用t8培养基处理再用t9培养基处理的培养物产生了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中该细胞群中56.7％的细胞表达nkx6.1。参见表2。先用t8培养基处理再用t10培养基处理的培养物产生了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中该细胞群中63.5％的细胞表达nkx6.1，经过该处理我们观察到更多表达cdx2的细胞。参见表2。先用t8培养基处理再用t11培养基处理的培养物产生了表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，其中该细胞群中74％的细胞表达nkx6.1。参见表2。表达nkx6.1的大多数细胞也表达pdx1。
pcr分析结果也支持incell分析结果，即在阶段3用视黄酸、环巴胺和成头蛋白处理，然后在阶段4添加pkc活化剂，结果导致到阶段4第4天时nkx6.1和ptf1α的mrna水平增加(图5a-5d)。
表2
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。
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