PD‑1敲除EGFRvIIICAR‑T细胞的制备的制作方法

本发明涉及利用crispr-cas9系统制备pd-1敲除egfrviiicar-t细胞。

背景技术：

egfr是一个170kd的跨膜糖蛋白受体，在egf(epidermalgrowthfactor，表皮生长因子)刺激的作用下能够行使酪氨酸激酶的功能，引导下游通路如mapk，akt和jnk的激活并促进基因转录。egfr通路的失调会导致多种人类上皮恶性肿瘤的发生。造成egfr通路失调的原因包括egfr的过表达，以及自身突变产生的持续激活。在egfr的各种突变类型中，最常见的是egfrviii(也被称为de2-7egfr或δegfr)。这种突变型缺失了正常egfr第2到第7个外显子之间801个碱基对，即丢失了膜外区的267个氨基酸，缩小为145kd。这样产生的截短了的受体不再能与任何配体结合，却能够持续活化，导致了egfr通路的过度激活。

目前比较一致的观点认为egfrviii是一种肿瘤特异性的膜受体，而在正常的组织里是没有的。大部分关于其的研究工作都是着眼于多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme，gbm)。gbm是一种常见且致死性很高的脑瘤，在世界卫生组织who的肿瘤分级中为iv级。根据2014年的数据，诊断为gbm的病人一年存活率为43％，平均存活时间为诊后15个月。由于egfrviii在大约30％的gbm中都有表达，并且在肿瘤组织中的37％-86％细胞上都有表达，因此，egfrviii被选择成为gbm免疫治疗的一个理想靶点。早期使用egfrviii作为靶点的免疫疗法包括了使用疫苗、免疫检查点抑制剂以及使用人工嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)编辑过的自身t细胞，即car-t，都取得了可喜的成果。

car分子主要包括胞外抗原结合区(singleantibodyvariablechain,scfv)、跨膜区和胞内信号区。第一代car的胞内信号区由cd3ζ(zeta)链或fcεriγ(gamma)链组成。第二、三代car则在第一代的基础上分别引入一个或者两个共刺激因子结构域(如cd28、4-1bb、icos等)，显著提高了car-t细胞的增殖能力和抗肿瘤作用，延长了car-t细胞在体内的持续存在时间。二代car的临床使用已经在对抗白血病(egfrviiicar)和神经母细胞瘤(gd2car)上取得了显著的效果。

尽管如此，car-t在对抗实体瘤的临床效果普遍不尽人意。在众多的临床实验中，car-t暴露出很多包括增殖及持久能力有限、肿瘤滤过能力差、在肿瘤微环境中被抑制等问题。其中对于细胞如何在抑制性的肿瘤微环境保持其在体外的增殖与持续能力，继续发挥其杀伤与分泌功能尤为重要，而考虑如何利用car-t以及其他治疗手段比如抗体、疫苗等相结合，改善局部微环境，破坏肿瘤固有结构成为研究的热点之一。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种安全高效的pd-1敲除egfrviiicar-t细胞的制备方法。

根据本发明的第一方面，提供了一种(非治疗目的)制备pd-1敲除egfrviiicar-t细胞的方法，包括以下步骤：

准备pbmc细胞；

准备egfrviii嵌合抗原受体(car)，即图中的139car；

准备与egfrviiicar配合使用的转座酶质粒，用于将egfrviiicar整合到pbmc细胞的基因组上；

准备用于敲除pd-1基因的sgrna质粒；

准备与sgrna质粒配合使用来敲除pd-1基因的cas9质粒；

将准备的egfrviiicar质粒及其转座酶质粒、用于敲除pd-1基因的sgrna质粒及cas9质粒与电转试剂混合，加入准备的pbmc细胞中进行电转染；

采用偶联cd3或cd3+cd28抗体的磁珠作为t细胞活化剂并培养扩增转染后的t细胞以获得pd-1敲除egfrviiicar-t细胞。

根据本发明的一个优选实施例，egfrviiicar可以是利用piggybac-transposon载体依次串联人ef1α启动子、csf2ra嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和t2a短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

根据本发明，胞膜外抗原结合区优选为用于结合egfrviii蛋白的egfrviii单链抗体(scfv，克隆编号139，也称为139car)，依次串联c-myc表位标记、cd8hinge嵌合受体铰链、cd8transmembrane嵌合受体跨膜区。

胞内信号传导区优选为cd28-4-1bb-cd3ζ，cd28和4-1bb为嵌合受体共刺激分子。其与转座酶质粒一起成功转染cd3阳性t细胞，介导外援基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达，有效的解决了egfrviiicar-t制备成功率不高的问题。

根据本发明的优选实施例，可以将两个特异性靶向pd1基因的sgrna同时连接在线性化的pgl3-u6-sgrna质粒上，与pst1374-nls-flag-cas9-zf质粒一起转染cd3阳性t细胞即可实现pd1基因的敲除。本发明因此实现快速、简单、高效、特异性敲除pd1的策略，有效的解决了egfrviiicar-t在体内受肿瘤微环境中肿瘤细胞通过pd1-pdl1通路的抑制作用。

根据本发明的一个具体实施例，准备pbmc细胞包括：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合，并用磷酸盐缓冲液pbs1：1稀释；(2)外周血稀释液与淋巴细胞分离液等体积混合，慢升慢降离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与pbs或者无血清细胞培养基(例如rpmi1640)混合后离心，继续用pbs或1640清洗三遍，沉淀后获得pbmc细胞。

本发明的另一目的是提供一种用于制备pd-1敲除egfrviiicar-t细胞的装置，其包括：

pbmc细胞准备系统；

amaxa电转试剂盒；

电转染系统，接收来自amaxa电转试剂盒的电转试剂并将其与egfrviiicar质粒及其转座酶质粒、用于敲除pd-1基因的sgrna质粒及cas9质粒混合后形成混合物；并接收来自pbmc细胞准备系统的pbmc细胞且在其中加入所述混合物进行电穿孔转染；

cd3阳性t细胞刺激富集系统，包含用于偶联cd3或cd3+cd28抗体的磁珠；以及

筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的t细胞以获得pd-1敲除egfrviiicar-t细胞。

本发明的又一目的是提供一种根据上述方法获得的分离的t细胞或细胞系或其次代培养物。

本发明选用piggybac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化cart的制备程序，增强了系统的负载量。另外，本发明敲除pd-1基因时避免了使用病毒载体，安全性更高。

本发明将基因敲除与car的装备放在同一个步骤里完成，提高了car-t细胞的制备效率和存活率，降低了多次操作的成本；同时缩短了car-t细胞在体外的培养周期，保证了其在体外扩增的活性。

附图说明

图1为根据本发明的pb-egfrviiicar-bbz-puro表达载体的基因结构图；

图2为根据本发明的pd1-koegfrviiicar-t细胞和egfrviiicar-t细胞中car表达率的对比结果图；

图3为根据本发明的pd1-koegfrviiicar-t细胞和egfrviiicar-t细胞中pd-1的敲除结果图；

图4为根据本发明的pd1-koegfrviiicar-t细胞和egfrviiicar-t细胞，分别与过表达egfrviii的人胶质瘤细胞u251(u251-oe)和野生型的u251(u251-wt)共培养后，细胞因子ifn-γ，gm-csf，il-2以及tnf-α的分泌量柱形图；

图5为根据本发明的pd1-koegfrviiicar-t细胞和egfrviiicar-t细胞，分别与过表达egfrviii的人胶质瘤细胞u251(u251-oe)和野生型的u251(u251-wt)共培养后，细胞毒性检测的对比图。

具体实施方式

pbmc细胞制备

用抗凝管采集健康人或患者外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合，并用磷酸盐缓冲液pbs1：1稀释。将外周血稀释液缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(ficoll)的50ml离心管中，450g，慢升慢降离心25min；

离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的50ml离心管中，加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入pbs，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到pbmc。

制备car-t细胞

1.将pbmc用含10％fbs的rpmi1640培养基稍加培养1至2个小时后进行电转，分别转染以下两组：

(1)将pgl3-pd1sg(1+2)、pst1374-nls-flag-cas9-zf、pb-egfrviiicar-bbz-puro(图1所示并参见序列表1)和转座酶四个质粒各5μg与amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该四种质粒的大约110μl电转混合液；

(2)以包含原始质粒pgl3-u6-sgrna、pst1374-nls-flag-cas9-zf、pb-egfrviiicar-puro和转座酶四个质粒的电转混合液作为对照；

另留一部分细胞不进行电转。

2.将所述两组电转混合液加入1-2×10⁷个pbmc细胞中进行电转，2个小时后换液；

3.12小时后加入100iu/ml的il-2的rpmi1640培养液，用偶联有cd3/cd28抗体的磁珠(lifetechnologies,11132d)刺激激活cd3阳性t细胞；

4.每2至3天半量更换培养液，同时观察细胞扩增状况。根据其增殖状况决定其刺激时长，但刺激时间不超过一周。

5.分离去除beads后,继续培养5至7天。收取少量细胞用于检测，其余细胞可继续使用快速扩增法进一步大量扩增。

利用流式细胞术检测car的表达

将扩增得到的car-t细胞用pbs清洗两次后重悬于facs液中(含0.1％叠氮化钠和0.5％bsa的pbs)，将alexa647conjugatemyc-tag(9b11)mousemab加入细胞悬液中，4℃孵育10分钟，清洗细胞两次后bdfortessa用于获取染色细胞，flowjo用于分析结果。如图2所示，car的表达可以达到90％以上。

细胞基因组提取与切割效果分析

使用含蛋白酶k的细胞裂解液消化细胞(0.1-1×10⁶)，并用酚氯仿法提取car-t细胞基因组dna。并用提前设计好检测on-target引物(引物未列出)，用高保真taq酶(如takara的primerstar)pcr扩增目的片段，使用axygenpcr产物回收试剂盒纯化回收。使用t7en1酶切检测pcr退火产物，3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切，结果如图3凝胶电泳图所示。将pcr产物连接进pmd19-t载体中，转化至dh5α感受态细菌中，随机挑取20个以上的单菌落，使用通用引物m13-47进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。如图3所示，pd-1的敲除效率可以达到59％以上。

pd-1敲除egfrviii-car-t细胞因子释放结果评估

分别培养u251-oe细胞、u251-wt细胞和效应细胞egfrviiicar-t以及pd-1敲除的egfrviiicar-t细胞。

将靶细胞u251-oe和u251-wt分别以每孔1x10⁵种于96孔板中，将效应细胞egfrviiicar-t和pd1-ko；egfrviiicar-t分别以2x10⁵与靶细胞混合，以总体积200μl的培养液(rpmi1640培养基+10％fbs)在37℃5％co2培养箱中共培养24个小时。每组3个复孔。之后离心取上清10μl用perkinelmer的alphalisaassay系列试剂盒(al208、al216、al217、al221)分别检测tnf-α、gm-csf、ifn-γ以及il-2的细胞因子浓度水平。如图4所示，尽管tnf-α、gm-csf、ifn-γ前三种因子水平没有明显区别，il-2的水平敲除组明显分泌水平更高，这意味着敲除组细胞更有利于存活。

pd-1敲除egfrviii-car-t细胞杀伤效果评估

收集稳定表达luciferase的靶细胞(u251-oe-luc、u251-wt-luc)和效应细胞(car-t细胞)，300g，慢升慢降离心10min，弃上清；用1mlpbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复清洗一次；用培养液(rpmi1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞至浓度为2x10⁶/ml，重悬效应细胞至浓度为3.2x10⁷/ml。

采用倍比稀释的方法设置效靶比为1:1、2:1、4:1、8:1的实验孔，并设置对照组，空白组(每组3个复孔，37℃5％co2培养箱中培养16至24h；消化吸取所有细胞，500g离心5min；用100μlpbs重悬细胞，加入不透明底的96孔检测板中，并且迅速在每孔加入100μld-luciferin底物溶液(避光操作)，酶标仪检测560nm吸光度，结果如图5所示，pd1-敲除egfrviiicar-t细胞在u251-oe靶细胞中不同效靶比条件下杀伤效率明显高于未敲除组。

小鼠体内成瘤与治疗实验评估

在免疫缺陷小鼠nsg的颅内预先移植入2x105u251-oe-luc的细胞，用活体成像仪每隔2-3天观察其稳定成瘤的情况。植入后一周开始，原位注射2x106egfrviiicar-t或pd1-ko；egfrviiicar-t的细胞，并设未电转组nt为对照。每隔3天注射一次，共注射3次。之后观察小鼠存活状态并记录生存曲线，结果如图6所示。敲除组可以明显延长小鼠生存寿命。

本发明采用piggybac转座子系统，从而a、制备工艺简单，不需要病毒制备所需要的各种复杂条件；b、piggybac系统负载可以超过14kb，而病毒系统负载不能超过8kb，否则得不到符合要求的病毒；c、病毒系统感染后的有效表达时间窗在两周左右，这是病毒系统介导治疗容易复发的原因之一；而piggybac系统可以介导长期表达，延长car的表达时间，更好地满足了t细胞治疗的要求。

另外，本发明采用电转的方法，既不需要病毒包装的复杂工艺，又避免病毒感染带来的安全隐患。

此外，本发明采用人自身的ef1α启动子，使car基因能够在人体内长时间持续表达；人pd-1基因的特异性敲除，增强了t细胞的抗肿瘤能力。

　　序列表

<110>成都克里斯博生物科技有限公司

<120>pd-1敲除egfrviiicar-t细胞的制备

<160>1

<210>1

<211>7827

<212>dna

<213>人工序列pb-egfrviiicar-bbz-puro

<400>1

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