细胞滚动分离的制作方法

专利名称：：细胞滚动分离的制作方法细胞滚动分离本申请要求2007年9月27日提交的美国临时申请系列号60/975，813的优先权和权益，其全部内容以全文形式通过引用结合于此。
背景技术：
：细胞滚动是一种重要的生理学和病理学过程，用于将血流中的特定细胞聚集到靶组织中。例如，在粘性剪切流中沿血管内皮的细胞滚动具有重要的生物学价值，在聚集白细胞到发炎部位、静脉注射后造血祖细胞的归巢、肿瘤细胞转移或其他炎症过程中发挥其作用。细胞滚动(cellrolling)是一种受体-配体介导的事件，它通过降低细胞速率引发对靶组织的粘附过程。细胞滚动典型地紧接着为活化、牢固粘附、和迁移。滚动应答主要由称作选择蛋白的跨膜糖蛋白受体家族介导，它们在白细胞和活化的内皮细胞表面上表达。选择蛋白通过类凝集素胞外结构域与糖结合。选择蛋白的大家族分成L-选择蛋白(CD62L)、E-选择蛋白(CD62E)、和P-选择蛋白(CD62P)。L-选择蛋白(74_100kDa)发现于大多数白细胞上并能够快速从细胞表面脱落。E-选择蛋白(IOOkDa)响应IL-Iβ和TNF-α，在血管内皮细胞上短暂表达(瞬时表达)。P-选择蛋白(HOkDa)典型地储存在血小板和内皮细胞的分泌颗粒中。例如，介导白细胞在血管内皮上滚动的粘附机制通常称作细胞滚动。该机制涉及P-选择蛋白和E-选择蛋白(在血管内皮细胞上表达)与选择蛋白-结合性糖配体(在循环的造血干细胞(HSC)和白细胞上表达)之间的弱亲和性。一旦“被捕获”，细胞在表面上缓慢滚动，相反未被捕获的细胞在大量流体中快速流动。
发明内容本发明包括以下发现滚动细胞的运动方向可以通过改变细胞滚动的表面上分子的排列(arrangment)而改变。特别地，我们已证明使用涂覆有促进细胞滚动的分子的区域和未涂覆区域之间的边缘(例如参见图1C)可以使细胞从流动方向偏移。在某些实施方式中，无流动的停滞线(stagnationline)可以代替此边缘或者除此边缘之外，无流动的停滞线可以促进细胞滚动与流动方向成角度。本文中描述的本发明利用这些发现提供基于细胞滚动的分离系统。分离的细胞可以用于任何目的，包括但不限于诊断或治疗目的。在某些方面，提供了可以用于细胞分离应用的方法。在某些实施方式中，方法包括提供至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面，其中该表面含有至少一个用有序层涂覆的一个区域和未用有序层涂覆的另一个区域之间的边缘；并使细胞群沿与至少一个边缘形成非零角度αs的方向上流过表面。在这样的方法中，细胞群中至少一个细胞含有被细胞粘附分子识别的表面部分，并且由于与至少一个边缘的至少一部分相互作用，细胞群中至少一个细胞在与流动方向成αs的方向上滚动一段时间。在某些实施方法中，方法包括提供至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的三维表面，并使细胞群在产生无流动的停滞线的条件下流过表面。在这样的实施方式中，流动方向与停滞线形成一个非零角度αs，该细胞群中至少一个细胞含有被细胞粘附分子识别的表面部分，且该细胞群中至少一个细胞在与流动方向成αs的方向上滚动至少部分时间。在某些方面，提供了用于细胞分离的设备，包括分离流动室、细胞流入分离流动室的进口、和细胞流出分离流动室的出口。在这样的设备中，分离流动室含有至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面，其中该表面含有至少一个用有序层涂覆的一个区域和未用有序层涂覆的另一个区域之间的边缘。在这样的设备中，当细胞流过进口到达出口时，它们以与至少一个边缘成αs角度的方向流动。图1示出了(A)P-选择蛋白固定在聚苯乙烯基层(substrate)上，用微流体技术产生边缘随后吸附BSA-FITC以揭示本设计。条带是100μm宽。⑶以1XIO6细胞/mL浓度在2dyn/Cm2剪切率的基层上流动的HL-60细胞的滚动轨迹。通过用Matlab代码处理在0.5Hz获得的194幅图像得到轨迹。可以看见细胞相互作用并仅在选择蛋白条带上滚动。(C)示出典型轨迹的小插图的放大图像，揭示了细胞沿流体流动方向在P-选择蛋白条带中滚动，但是一旦碰到边缘(标记〇)就改变方向并沿边缘滚动。未碰到边缘(标记口)的P-选择蛋白条带中的细胞沿流体流动方向滚动，并不是条带的方向。可以看到其他的细胞在边缘(标记X)上滚动。由细胞在其上滚动的涂覆区域的边缘而不是由形状确定细胞滚动的方向。图2描述了边缘设计的实施例的示意图，该设计将导致相对方向上两个细胞类型的净位移。该表面含有两个不同种类的边缘它们相对于流动方向形成不同的角度。被细胞碰到的第一个边缘形成一个角度使得两个细胞类型都能沿着它移动。第二个边缘以更大的角度倾斜或具有受体使得只有一种细胞类型(虚线)可以沿该边缘滚动。通过在大的区域上逐步改变第二个边缘得到的上述重复设计中的空间变化可以用于汇集特定的细胞类型。图3说明用具有变化角度㈧或恒定角度⑶的选择蛋白边缘的流动室可以进行细胞分离。室长度(L)、宽度(W)、细胞进口宽度(Wttn)、和室高度(h)是设计参数，它们具有显著相关性。如所示，在一个实施方式中，可以平行使用10个设备用于细胞分离以提高通量(C)O图4描述了使用边缘效应的不同的设计方案。(A)滚动细胞的负选择远离不沿边缘移动的细胞。(B)排列细胞的边缘成为纵队。(C)通过加入微孔板(也可以是粘性片来捕获细胞)分离单个细胞。(D)粘附区域连接到边缘能够使细胞在碰到边缘前滚动。图5是表明选择蛋白/mAb排列的设计参数的示意图，它包括具有与流动方向形成角度(as)的边缘的宽度(W)的受体带。也描述了滚动细胞的一种可能途径即碰到边缘，沿着它移动一段距离，且然后与它分离。图6A和6B描述了三维表面，它包括其上可以使细胞滚动的边缘。这样的表面可以产生或可以不产生停滞线，然而，通过边缘它们可以影响细胞滚动的方向。图7:(A)由于缺少散射光，用水灌满的(连接到载玻片上的PDMS设备的)微通道可能很难用眼睛看到(上面的载玻片)。用细胞灌满的类似的微通道通过被细胞散射的光可以容易地看到和辨别(下面的载玻片)。(B)小插图(在(A)中用方块标记)的放大图像显示微通道中捕获的细胞。图8描述了在环氧树脂功能化的玻璃基层上共价固定P-选择蛋白的反应示意图。在表面上预先固定的聚乙二醇层上面固定P-选择蛋白。图9表示在共价固定与物理吸附的P-选择蛋白上细胞滚动的静止图像和持续时间。示出(A)物理吸附与(B)共价固定的P-选择蛋白在28天后在表面上细胞滚动数量的比较。在(C)中，表示在剪切流下中性粒细胞在P-选择蛋白涂覆的表面上的滚动动力学。在3或28天的P-选择蛋白表面上在壁剪应力1至lOdyn/cm2下灌注2.5X105/mL中性粒细胞溶液。如果它们的速率低于50%的自由流动速率则细胞计数为滚动细胞。注意到与物理吸附的P-选择蛋白的表面比较，显著更大量的细胞在具有共价固定的P-选择蛋白的表面上滚动。图10描述在(A)使用EDC/NHS化学物的0EG-C00H/0EG-0H以不同的比率混合的自组装单层(SAM)上和⑶通过用P-选择蛋白的-SH基团连接的P-选择蛋白生物素化后OEG-生物素/0EG-0H的混合SAM上，P-选择蛋白固定的示意图。注意通过酰胺键㈧和通过生物素-链菌素键(B)固定的P-选择蛋白在表面上应该分别具有随机和定向的构象。图11表示(A)具有对照密度的P-选择蛋白固定的表面等离子体共振(SPR)传感图谱(sensorgrams)。通过改变0EG-C00H和0EG-0H之间的比率，固定的P-选择蛋白的量被控制并与0EG-C00H的浓度成比例。(B)通过比较在未定向的P-选择蛋白(EDC/NHS化学物)和定向的P-选择蛋白(巯基特异性生物素_链菌素化学物)上连接的抗体，P"选择蛋白定向对抗体连接的作用。注意固定的P-选择蛋白的量彼此相当(两个表面都是约12nm波长偏移(约180ng/cm2))图12描述了说明P-选择蛋白固定以生成边缘的示意图和照片。将有机硅橡胶掩模置于玻璃基层上(A)且通过物理吸附在基层的暴露区域上涂覆P-选择蛋白(B)。然后从基层上去除有机硅掩模(C)，并用BSA封闭未用P-选择蛋白涂覆的区域(D)。使用荧光素标记的BSA使得用落射荧光显微镜(印ifluorescencemicroscope)可以看到P-选择蛋白排列(E)。HL-60细胞选择性地粘附到P-选择蛋白区域，证明用P-选择蛋白涂覆基层的一些区域。比例尺100μm。图13表示说明P-选择蛋白边缘引导滚动细胞运动的照片。碰到与流体流动方向形成一个角度的P-选择蛋白涂覆的区域的边缘的滚动HL-60细胞被迫沿边缘滚动。被迫沿边缘滚动的细胞的运动与在流体流动方向上另一个细胞的滚动(用圆圈突显)进行比较。边缘成功地改变了滚动细胞的运动方向8.6°，导致细胞从它初始的位置沿流动方向每Imm长度有效地位移0.15mm。壁剪应力是1.9dyn/cm2。图14表示细胞和微球滚动的分析的结果。(A)从一组236幅图像产生滚动细胞的Matlab轨迹清楚地表明边缘效应。细胞没有能力穿过边缘导致边缘上轨迹的更高密度。在P-选择蛋白涂覆的区域内(粉红色)观察到细胞滚动，但在封闭的区域内(白色)没有观察到。比例尺300μπι。(B)在边缘上和P-选择蛋白区域内细胞滚动更长(>300μm)的轨迹清楚地表明边缘影响滚动的方向。比例尺300μπι。(C)相对于远离边缘的细胞滚动的行进方向(蓝色)，靠近边缘的细胞滚动的行进方向(红色)的角度分布柱状图。壁剪应力是1.9dyn/cm2(0.19Pa，300yL/min)。(D)用9.96μm直径sLex涂覆的在P-选择蛋白上滚动的微球进行类似的实验表明边缘对微球没有很大的影响因为它们的行进方向基本上没有改变。壁剪应力是0.33dyn/cm2(0.03Pa,200μL/min)。图15说明沿选择蛋白边缘，细胞滚动的潜在机制。(A)尾部边缘上的键(bonds)受到最大的应力。当这些键断开时，导致细胞不对称旋转(B)引起细胞沿边缘移动(C)。该机制类似于表面上的细胞滚动，但除了沿与表面平行的轴旋转，细胞也可以在平面上沿垂直于表面的轴旋转如图(B)中所示。在硬微球的情况下，接触的区域很小且流动产生的力通过垂直于接触区域上的一个点作用且这种不对称运动变得很难。图16描述(A)通过沿受体边缘滚动分离细胞的微流体设备，具有流动通道高度30μm。(B)多种荧光微球(约2至30μm直径)和HL-60细胞和缓冲液流注入含有与液流成一个角度的P-选择蛋白排列的设备中。滚动的HL-60细胞选择性地偏转并远离初始的流中的微球，在合成的荧光和明场图像中显而易见。虚线画出了细胞和微球流和缓冲液流之间的边界线。箭头表示沿边缘细胞滚动的方向。圈出边缘上的细胞。比例尺100μπι。图17描述(A)—种微型设备的设计。(B)HL-60细胞滚动轨迹表明用P_选择蛋白涂覆的区域(粉红色)的边缘控制滚动。(C)用低功率显微镜观察收集通道中的细胞。图18说明如何通过使生物分子流过可逆连接到基层的PDMS微通道来实现生物分子的微流体排列。该技术已用于生成P-选择蛋白边缘，且排列步骤后通过暴露于荧光标记的BSA可以使该设计可视化。BSA选择性地吸附在无P-选择蛋白的区域上并看起来明亮。图19描述中性粒细胞上CD64位点密度测定的示意图。为了测定连接到中性粒细胞表面的抗体的位点密度，标准的IgG珠连接到FITC-生物素抗体上并用于生成位点密度对荧光强度的校准曲线，如供应商描述。图20表示一个可以用于从未活化(⑶64_)的中性粒细胞中分选出活化的⑶64+中性粒细胞的设备的示意图。当它们以不同的角度行进时活化的中性粒细胞(A)预期可以与未活化的中性粒细胞(B)区别开，并通过出口A流出。未活化的中性粒细胞通过出口B流出。可以在两个出口处从细胞相对分布的变化检测活化的中性粒细胞。图21表示可以用于产生用于三维细胞分离应用的停滞线的表面的实施例。(A)圆柱体和(B)隆起部可以在其外表面用细胞粘附分子涂覆并用于三维的基于细胞滚动的分离系统。箭头指示流体流动的流线。停滞线表示在表面的附近没有流动的区域。具体实施例方式定义贯穿本说明书，使用了几个在下文中定义的术语。本文中使用的术语“约”和“大约”指一个数，一般包括落在在该数的任意方向(大于或小于该数)5%、10%、或20%范围内的数，除非另外说明或另外在上下文中显而易见(除了该数会超过100%的可能值)。本文中使用的短语“粘性片”指一个区域(例如在表面上)，在其上排列(arrang)了细胞可以与其粘附的分子。这样的粘附分子通常可以含有任何与细胞粘附分子相比，和细胞具有更强的相互作用的配体。这样的分子的实例包括抗体和抗体片段。在粘性片中(或该片的维度上)，这样的分子的密度在一些实施方式中可以控制为使碰到该片的细胞慢下来但不停止。在一些实施方式中，控制粘性片中(或该片的维度上)中分子的密度被控制为使碰到该片的细胞停止。本文中使用的术语“吸附”始终具有其在本领域中通常被接受的含义，即指“通过吸附收集”。“吸附”指这样的过程，通过该过程溶液中特异性气体、液体、或固体粘附到它们接触的材料，通常是固体的暴露表面。本文中使用的术语“细胞粘附分子”通常指位于细胞表面上的蛋白，参与在其上具有细胞粘附分子的细胞与其他细胞或与细胞外基质的连接(通过细胞粘附)。细胞粘附分子的实例包括但不限于选择蛋白(例如E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白等)、整联蛋白(例如ITGA4等)、钙粘素(例如E-钙粘素、N-钙粘素、P-钙粘素等)、免疫球蛋白细胞粘附分子、神经细胞粘附分子、细胞内粘附分子、血管细胞粘附分子、血小板_内皮细神经胞粘附分子、Ll细胞粘附分子、和细胞外基质细胞粘附分子(例如玻连蛋白(vitronectins)、纤连蛋白、和层粘连蛋白(Iaminins)等)的全长、片段、类似物、和/或修饰物。如本文中使用的，术语“细胞粘附分子”也包括由于它们的粘附性质可以有助于细胞粘附的其他化合物。在本发明的一些实施方式中，适体(aptamer)、碳水化合物、肽(例如RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)肽等)，和/或叶酸等可以用作细胞粘附分子。如本文中使用的，这样的化合物涵盖在术语“细胞粘附分子”中。如本文中使用的，涉及细胞粘附分子的术语包括但不限于“细胞粘附分子”、“选择蛋白”、“整联蛋白”、“钙粘素”、“免疫球蛋白细胞粘附分子”、“神经细胞粘附分子”、“细胞内粘附分子”、“血管细胞粘附分子”、“血小板_内皮细胞粘附分子”、“Li细胞粘附分子”、“细胞外基质细胞粘附分子”，包括这样的蛋白的全长形式及其功能片段、类似物、和修饰物，除非另外说明。同样地，涉及具体细胞粘附分子的术语包括但不限于“E-选择蛋白”、“P-选择蛋白”、"L-选择蛋白”、“ITGA4”、"E-钙粘素”、"N-钙粘素”、P-钙粘素”、“玻连蛋白”、“纤连蛋白”、“层粘连蛋白”等，也包括这些蛋白的全长形式及其功能片段、类似物、和修饰物，除非另外说明。如本文使用的，术语“细胞粘附分子”不包括抗体。本文中使用的短语“细胞培养”指细胞的生长，通常是在可控的环境中。这样的细胞可以来自多细胞真核生物，特别是动物细胞，或可以是微生物如细菌。当细胞来自多细胞真核动物时，术语“组织培养”通常与术语“细胞培养”相互交换地使用。本文中使用的术语“细胞修饰配体”，通常指能够改变细胞的生物学行为的分子。例如在细胞中触发分子信号的蛋白(例如表达另一种蛋白)是一种细胞修饰配体。本文中使用的术语“变形能力”，在指细胞时，指例如当它们穿过狭窄空间时，当它们沿表面等滚动时，细胞改变它们的形状的能力。本文中使用的术语“接头(linker)”是指将一个基团或部分(例如细胞粘附分子)与另一功能基团(例如固定在表面上的功能基团)连接的化学部分。没有限制地，在一些实施方式中，接头部分包括一个或多个右旋糖、树状分子、聚乙二醇(PEG)、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-谷氨酸)、聚乙稀醇、和聚乙稀亚胺。在一些实施方式中，接头部分包括一个或多个氨基、醛基、环氧基、乙烯基、巯基、羧酸盐、和羟基。在一些实施方式中，接头部分(linkermoiety)包括配体/受体对的一个成员和化学修饰的细胞表面分子以包括该对的另一个成员。本文中使用的短语“间充质干细胞/祖细胞”(缩写为“MSPC”)指分布于多种成人和胎儿组织包括骨髓、皮肤、肾、肺和肝中的自我更新的且多潜能的细胞。在定向并分化成包括脂细胞、软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、和心肌细胞的多种细胞类型之前，MSPC可以在培养基中培养和繁殖。骨髓和脂肪组织是MSPC最丰富的来源。该短语与“间充质干细胞”(缩写为“MSC”)互换地使用。本文中使用的术语“定向的(oriented)”用于描述具有明确的或指定的空间方向的分子(例如细胞粘附分子，等)，即非随机方向。例如如果表面上大部分的细胞粘附分子相对于表面具有特定的空间方向，细胞粘附分子在表面上是“定向的”。在本发明的某些实施方式中，“大部分”包括表面上至少50%的分子。本文中使用的术语“无定向的(imoriented)”用于描述不具有特定的或指定的方向的分子(例如细胞粘附分子，等)，即随机定向。例如，如果细胞粘附分子相对于表面通常不具有确定的方向，细胞粘附分子可以描述为在表面上“无定向的(imoriented)”。本文中使用的术语“有序层”指具有这样性质的层，在超过层上至少50%是基本上均勻的、周期性的和/或模式化(patternwise)的。在一些实施方式中，有序层具有一种或多种特征，其选自细胞粘附分子的基本上均勻的密度和基本上均一的空间方向。在一些实施方式中，有序层具有一种或多种特征，选自细胞粘附分子的模式化分布、模式化密度、和模式化空间方向。在一些实施方式中，该细胞粘附分子的有序层使细胞滚过有序层的速率基本上正比于用于该有序层的剪切应力。本文中使用的术语“物理吸附”始终具有其在本领域内通常被接受的含义，即“通过物理吸附收集”。“物理吸附”指不涉及形成化学键的吸附。本文中使用的短语“祖细胞”指具有分化成特定类型的细胞的能力的细胞。该术语通常指与干细胞相比，沿特定的谱系进一步分化的细胞。本文中使用的术语“自组装单层”(缩写为“SAM”)指在基层上含有单层分子的表面，它可以通过在基层表面上加入想要的分子的溶液并洗去过量的而制备。本文中使用的短语“停滞线”指邻近物体的表面零流动速度的区域，那里表面上的流动从不同方向汇聚。沿停滞线的剪切是零，且靠近表面的流动速率定义为穿过停滞线的平面。在该平面中，流动速率必须与停滞线形成一个非90度的角度(在垂直位置的情况下，该角度是90度)。本文中使用的短语“干细胞”指通过有丝细胞分裂能够自我更新并能够分化成多种特化细胞类型的细胞。干细胞的实例包括但不限于间充质干细胞、造血干细胞、和胚胎干细胞。某些实施方式的详细描述如上所述，本发明提供通过采用穿过表面的细胞滚动用于细胞分离的系统。I.方法提供了包括提供至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面和使细胞群流过表面的步骤的方法。表面含有至少一个用有序层涂覆的一个区域和未用有序层涂覆的一个区域之间的边缘。细胞群以与至少一个边缘形成非零度角αs的方向流过表面。该细胞群中至少一个细胞含有被细胞粘附分子识别的表面部分，并作为与边缘相互作用的结果，沿与流动方向成αs方向滚动至少部分时间。在一些实施方式中，这样的细胞沿边缘滚动至少部分时间。在某些实施方式中，方法进一步包括从细胞群中的某些细胞中分离至少一个细胞。在一些实施方式中，含有表面部分的细胞在涂覆区域上但以远离边缘至少一个细胞直径的距离滚动。在这样的实施方式中，细胞可以以小于as的角度滚动。在一些这样的实施方式中，小于as的角度是或者近似零度。即未与至少一个边缘相互作用的细胞沿流动方向滚动。A.涂覆的表面通常表面部分地用有序层的细胞粘附分子涂覆并可能含有或可能不含有如本文中讨论的其他分子。细胞粘附分子在本发明的某些实施方式的实践中可以使用多种细胞粘附分子。在一些实施方式中，该层细胞粘附分子包括具有与一种或多种细胞表面部分(例如蛋白质、多糖等)相互作用的解离常数(Kd)大于约lxlO—8摩尔/升(M))的细胞粘附分子。在一些实施方式中，该层细胞粘附分子包括具有与一种或多种细胞表面部分相互作用的解离常数在约lxlO—4摩尔至约IxlO-7M的范围内(包括两个端值)的细胞粘附分子。应当明了在涂覆表面上细胞的行为部分依赖于解离常数。通常可以使用任何细胞粘附分子。本发明的某些实施方式中有用的细胞粘附分子的实例包括但不限于，选择蛋白(例如E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白等)、整联蛋白(例如ITGA4等)、钙粘素(例如E-钙粘素、N-钙粘素、P-钙粘素等)、免疫球蛋白细胞粘附分子、神经细胞粘附分子、细胞内粘附分子、血管细胞粘附分子、血小板_内皮细胞粘附分子、Ll细胞粘附分子、和细胞外基质细胞粘附分子(例如玻连蛋白(vitronectins)、纤连蛋白、和层粘连蛋白(Iaminins)等)的全长、片段、类似物、和/或修饰物。在一些实施方式中，适体、碳水化合物、肽(例如RGD肽)、叶酸等可以用作细胞粘附分子。该层细胞粘附分子可以包括单一的细胞粘附分子或不同种类的细胞粘附分子的组合。细胞粘附分子可以以多种方式连接到表面。可以使用非共价相互作用，例如范德华相互作用、氢键和静电相互作用(也称作离子键)等。也可以使用共价键。可以使用任何共价化学物使细胞粘附分子共价连接到基层表面。本领域技术人员将明了实施例中描述的方法是示例性的且基于本领域的知识很容易改进。在一些实施方式中，细胞粘附分子通过一个或多个接头部分连接到表面。在一些实施方式中，接头部分以它的一端连接到细胞粘附分子上并以另一端连接到基层的表面。通常，接头部分和表面之间的键是共价键。接头部分和细胞粘附分子之间的键可以是共价的或非共价的(例如如果涉及如本文中讨论的配体/受体对时)。没有限制地，在一些实施方式中，接头部分包括一种或多种右旋糖、树状分子、聚乙二醇(PEG)、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-谷氨酸)、聚乙稀醇、和聚乙稀亚胺。在一些实施方式中，接头部分包括一个或多个氨基、醛基、环氧基、乙烯基、巯基、羧酸盐、和羟基。在一些实施方式中，接头部分包括配体/受体对的一个成员并化学修饰细胞表面分子以包括该对中的另一个成员。除了改善长期稳定性和涂覆表面的性能，使用共价连接而不是物理吸附使人们能够控制基层表面上细胞粘附分子的密度，排列和方向。例如，密度将依赖于可用于共价连接的表面上基团的密度。类似地，排列将依赖于可用于共价连接的表面上基团的排列。制备具有用于共价连接的适合基团的不同密度和排列的表面的方法是本领域已熟知的(例如参见Rusminietal.Proteinimmobilizationstrategiesforproteinbiochips.Biomacromolecules2007Jun；8(6)1775-89.andLeckbandetal.Anapproachforthestableimmobilizationofproteins.BiotechnologyandBioengineering1991；37(3)227-237，两者的全部内容通过引用结合于此)。在一些实施方式中，细胞粘附分子的密度范围是约10ng/cm2至约600ng/cm2。在一些实施方式中，细胞粘附分子的密度大于约30ng/cm2。例如，在一些实施方式中，细胞粘附分子的密度范围是约30ng/cm2至约360ng/cm2。在一些实施方式中，细胞粘附分子的密度范围是约50ng/cm2至约300ng/cm2。在一些实施方式中，细胞粘附分子的密度范围是约100ng/cm2至约200ng/cm2。在一些实施方式中，控制表面上细胞粘附分子的方向。这可能是有利的，例如，因为只有在细胞粘附分子的特定区域可接近细胞时，细胞粘附分子才迫使与细胞相互作用。例如，P-选择蛋白含有一个半胱氨酸残基。结果，如果P-选择蛋白通过与半胱氨酸特异性反应的接头部分连接到表面，所有的P-选择蛋白分子将以相同的方向连接到表面。通常，只要细胞粘附分子含有一个独特的基团，就可以使用该方法。在一些实施方式中，细胞粘附分子可以用本领域已知的方法进行设计或化学修饰以在提供最佳方向的位置上含有这样一个独特的基团(例如，特别的氨基酸残基)。例如在以蛋白为基础的细胞粘附分子的C-或N-端可以加上一个合适的氨基酸残基。在一些实施方式中，合成和/或纯化的细胞粘附分子使得仅有限亚类的残基能够与表面上或接头上的反应基团反应。在一些实施方式中，在每个细胞粘附分子上仅有一个基团或残基可以与表面上或接头上的反应基团反应。例如，在一些实施方式中，合成和/或纯化的细胞粘附分子带有保护基团，保护基团阻止它们连接的残基与表面或接头上的反应基团反应。在这样的实施方式中，细胞粘附分子上一个或多个残基没有得到保护。因为细胞粘附分子只能通过一个或多个未保护的残基连接到表面或接头，因而细胞粘附分子可以以特定方向连接到表面或接头。在一些实施方式中，细胞粘附分子连接到表面或接头后去除保护基团。(参见例如Gregoriusetal.AnalyticalBiochemistry2001Dec1；299(1)84-91，其全部内容通过弓丨用结合于此)抗体在一些实施方式中，抗体(包括抗体片段)可以与细胞粘附分子共同固定。通常，抗体可以以类似于细胞粘附分子的方式(例如用同样的接头部分)连接到表面。在某些实施方式中，可以用不同的共价连接方法连接抗体。在某些实施方式中，可以非共价连接抗体。在某些实施方式中，该有序层含有至少一种共价连接到表面的抗体和至少一种非共价连接到表面的抗体。在某些实施方式中，连接到细胞表面部分的抗体可以与细胞粘附分子共同固定。原则上，根据本发明可以使用任何抗体和表面配体对，只要该抗体连接到表面配体。例如，如果希望改变涂覆表面和表达⑶64的细胞类型之间的相互作用，抗⑶64抗体可以与细胞粘附分子共同固定。本领域技术人员将明了如何将其扩展到本领域已知的其他表面配体。在这样的实施方式中，细胞粘附分子对抗体的摩尔比可以根据希望的滚动特征(例如速度、细胞停止的百分数等)改变。合适比率的实例包括范围是约1001至1100的那些。在一些实施方式中，摩尔比的范围是201至11。在一些实施方式中，为了调整涂覆表面上细胞滚动的速度可以含有抗体。在一些实施方式中，通过控制抗体的密度和/或排列可以实现这一点。在一些实施方式中，可以在表面上以这样的密度固定抗体从而降低滚动速度，且不会引起细胞停止。在一些实施方式中，可以将抗体以弓丨起细胞滚动停止的密度安排到表面上。细胞修饰配体在一些实施方式中，细胞修饰配体可以与细胞粘附分子共同固定。通常，细胞修饰配体可以以细胞粘附分子类似的方式(例如用相同的接头部分)连接到表面上。在某些实施方式中，可以用不同的共价连接方法连接细胞修饰配体。在某些实施方式中，细胞修饰配体可以非共价连接。在某些实施方式中，该有序层包括至少一个共价连接到表面的细胞修饰配体和至少一个非共价连接到表面的细胞修饰配体。在一些实施方式中，流过涂覆表面的细胞群包括至少一个具有共同特征的细胞亚群，且细胞修饰配体能够改变细胞亚群的表型。多种细胞类型的任意一种可以包括亚群，如本文中讨论。作为一个实例，某些癌细胞可以表达例如TNF受体5和/或6这样的受体，它们在正常的细胞上不表达。肿瘤坏死因子(TNF)相关的受体凋亡诱导配体(TRAIL)特异性地结合到TNF受体5和6。为了诱导这类细胞的凋亡或程序性细胞死亡，TRAIL可以与细胞粘附分子共同固定。细胞修饰配体例如TRAIL和/或其他化学治疗试剂可以与细胞粘附分子共同固定以传送信号来杀死或阻止癌细胞的生长。本领域技术人员应当明了在基层上和/或在基层中可以固定和/或呈递其他细胞修饰配体来影响与细胞粘附分子相互作用的细胞的性能。例如，可以呈递纤维原细胞生长因子2(FGF-2)以协助将细胞维持在未分化状态。作为进一步的实例，可以呈递成骨蛋白2(BMP-2)以刺激干细胞的成骨分化等。细胞修饰配体的组合也可以一起使用。B.设计通常，涂覆的表面含有至少一个涂覆区域和未涂覆区域之间的边缘。在可以用于实现一个或多个边缘的设计的类型上没有限制。边缘通常表面上至少一个边缘与流动方向形成一个非零度角αs。在某些实施方式中，αs至少是0.5度。在各实施方式中，αs可以是至少1度，至少2度，至少3度，至少4度，至少5度，至少6度，至少7度，或至少8度。在各实施方式中，αs可以小于约70度，小于约65度，小于约60度，小于约55度，小于约50度，小于约45度，小于约40度，小于约35度，小于约30度，小于约25度，小于约20度，或小于约15度。该至少一个边缘可以基本上是线性的和/或可以包括一个弯曲部分。在一些实施方式中，边缘可以包括两个线性和弯曲部分。在本发明的一些实施方式中，表面含有多个边缘。在本发明的一些这样的实施方式中，至少两个边缘与流体流动方向形成不同的角度。图2表示设计的一个实例，其使用具有不同角度的多个边缘。在本发明的某些实施方式中，边缘是锐利的边缘。通过给定距离上密度的一定百分比的变化可以表征边缘的锐度。当涉及涂覆区域和未涂覆区域之间的边缘时，在有序层中考虑分子(例如细胞粘附分子)的密度并使用在涂覆区域中的最大密度来比较可能是有用的。“100%密度”可以定义为在邻近边缘的涂覆区域中的最大密度。例如在小距离上10%至90%的密度变化表示锐利的边缘；在更大距离上相同的变化表示模糊的边缘。在本发明的一些实施方式中，用相当于在小于约5μπι的距离上10%至90%密度变化的锐度来表征边缘。在一些实施方式中，该距离小于约3μm，小于约2μm，小于约1μm,小于约0.5μm，小于约0·2μm，或小于约0.1μm。不希望被任何特定理论束缚，提出了为了诱导细胞沿特定方向滚动一定程度的锐度可能是必要的。可能在锐利的边缘，细胞能够开始不对称运动仅仅当其同时与用与细胞表面相互作用的配体涂覆的表面和未涂覆表面相互作用时才可能。边缘的排列用有序层涂覆的区域可以形成多种如本文中讨论提供边缘的设计的任何一种。设计可以包括多个涂覆区域。在图2-4中描述了一些设计的实例。在本发明的某些实施方式中，设计包括一种或多种涂覆区域，它们每一个定义为具有至少两个边缘的条带。条带的两个边缘可以基本上是平行的；可替代的或另外地，条带本身可以基本上彼此平行。在一些实施方式中，其中条带基本上彼此平行，条带可以通过邻近条带之间基本上固定的距离Wg分开，且可以具有基本上相同的宽度ws。例如为了实现基于细胞滚动的分离，对于一系列特别的条件，两个参数Wg和Ws可以适当地改变。例如Ws可以在约0.01μm至约IOmm范围内。在本发明的一些实施方式中，Ws小于约100μm，小于约75μm，或小于约50μm。在本发明的一些实施方式中，ws大于约0.1μm或大于约1μm。在某些情况下相对于可能被诱导滚动的细胞的平均直径d定义Ws可能是有用的。在一些实施方式中，ws小于3d，小于2d，或小于d。例如wg可以在约0.2μm至约IOmm范围内。在一些实施方式中，Wg小于约100μm，小于约75μm,或小于约50μm。在一些实施方式中，wg大于约1μm,大于约5μm，或大于约10μm。Wg可以约等于、大于或小于ws。在某些实施方式中，wg,Ws或它们两者都可以与其他参数具有某些关联。例如，细胞可以沿具有接触半径的边缘滚动。在一些实施方式中，wg>r4。在一些实施方式中，Wg稍微大于r接触，例如Wg可以大于r接触，但限制于使得Wg<1.5·r接触、Wg<1.2·r接触、$wg<1·1·r接触。设计可以包括彼此不平行的涂覆区域的条带。在一些实施方式中，这样的条带从共同的点、或从共同的区域例如进口而开始，并以不同的角度向外辐射。这种设计的一个实例描述于图3A中。可替代的或另外地，设计可以包括由形状定义的涂覆区域例如方形、矩形、三角形、多边形、椭圆形、圆形、弧形、波浪形、和/或它们的组合。应该明了大量的这种形状和/或条带可以排列成任何设计，只要整体设计提供至少一个具有与流过表面的方向成非零度角的边缘。参见，例如图2和4。通常，设计的原状可以根据被分离的(一种或多种)细胞的类型和/或想要分离的类型进行修剪。例如，当系统需要分离单细胞类型时，则具有单一类型边缘的简单设计可能足够。然而，当系统需要分离多种不同细胞类型时，则可能需要具有不同类型边缘的更复杂的设计。表面可以包括另外的元件或特征用于具体的目的，例如在表面上捕获细胞，如图4C中所描述。元件可以是物理结构，例如孔(例如表面中的凹陷)，这限制细胞在流动方向上流动。类似地，粘性片可以结合到表面中有助于在表面上特殊的区域内固定细胞。粘性片可以包括例如抗体这样的有助于细胞降低其速度和/或停止的分子。在某些实施方式中，表面进一步包括位于邻近和/或通向至少一个边缘的粘性片。在一些实施方式中，粘性片位于涂覆区域的上游。“上游”指放置粘性片使得流过表面的细胞在它们碰到涂覆区域前碰到粘性片。这样的粘性片可以吸附细胞并有助于细胞沿边缘滚动。C.细胞细胞群可以含有多种细胞类型的任意一种并可以从多种来源的任意一种得到。细胞群一般包括至少一个具有共同特征的细胞亚群。在本发明的一些实施方式中，在流动的步骤中，亚群中至少一个细胞滚动至少部分时间。作为与边缘相互作用的结果这样一个细胞可以沿与流动方向成αs的方向滚动，其中αs是边缘和流体流动方向之间形成的角度。在一些实施方式中，亚群中基本上所有细胞滚动至少部分时间。共同的特征可以是表型例如细胞表面部分的表达、细胞类型(例如谱系类型)、分化潜力等。例如，亚群中的细胞可以都含有被细胞粘附分子识别的细胞表面部分。细胞表面部分的实例包括P-选择蛋白配体、E-选择蛋白配体、L-选择蛋白配体等。这样的部分的实例包括P-选择蛋白配体1(PSGL-I)、CD44(E-选择蛋白和L-选择蛋白的配体)、糖基化依赖的细胞粘附分子1(GlyCAM-Ι，一种L-选择蛋白配体)、⑶15(一种P-选择蛋白配体)、⑶34(—种L-选择蛋白配体)、E-选择蛋白配体I(ESL-I)等。表面部分进一步的实例包括迟现抗原4(VLA-4，一种VCAM-I配体)，gp200,等等。亚群可以含有特定的细胞类型和/或细胞类型的组合。例如，亚群中的细胞可以是癌细胞。细胞类型进一步的实例包括干细胞(例如间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞等)、祖细胞、红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、白细胞等。在一些实施方式中，亚群中所有细胞具有特定的细胞类型，例如都是癌细胞、都是干细胞、都是祖细胞等。尽管血小板没有正式归类为细胞，它们可以被诱导滚动并用本发明的系统分离。可以从多种来源得到细胞，包括但不限于含有细胞的体液(例如血液、淋巴液、腹水液、尿液、唾液、滑液、脑脊髓液、玻璃体液、精液等)、组织样品、冰冻的保存物、细胞培养物等。它们流动前和/或流动时可以用试剂处理细胞。例如可以用改变它们变形能力的试剂处理细胞。这样的试剂的实例包括细胞松弛素、N-乙基马来酰亚胺、对_氯汞苯、长春碱等。在某些实施方式中，这个处理步骤可以帮助某些类型的细胞进行细胞滚动。D.细胞滚动在适当条件下紧邻表面的细胞流动可以滚过通过涂覆区域的表面。进一步远离边缘的细胞(例如，离开边缘大于一个细胞直径的距离)通常沿着或大致沿着流体流动方向继续滚动。在本发明的某些实施方式中，位于或邻近边缘的细胞(例如，在边缘的一个细胞直径内)沿边缘滚动至少部分时间。在一些实施方式中，远离边缘的细胞可以沿着或大致沿着流体流动方向滚动直到它们离开表面或碰到边缘，在这点上它们可以开始沿边缘滚动。在一些实施方式中，沿边缘滚动的细胞沿该边缘持续一段时间，从表面分离，再粘附(例如，在另一个或在相同的涂覆区域上)，并开始再次滚动(参见例如图5)。应当明了在给定的一系列条件下，细胞群中不是所有的细胞可以沿边缘滚动。细胞滚动可能是选择性的因为仅有某些细胞亚群可以滚动。作为一个实例，群可以包括不含有被细胞粘附分子识别的细胞表面部分的细胞。在大多数情况下，这样的细胞不能沿表面滚动。群中表达被细胞粘附分子识别的细胞表面部分的细胞中，对于一个或多个亚群沿边缘滚动可能允许存在差异，而对于其他亚群滚动则不允许。不希望被任何特别的理论束缚，许多特征的任何一种可以用于区分沿边缘滚动的亚群和在给定的一系列条件下未滚动的亚群。这样的特征可以包括例如细胞表面部分的密度、细胞大小、细胞变形能力等。方向如上所述，细胞可以沿边缘滚动，其至少一个与流动方向形成一个非零度角as。因而在一些实施方式中细胞可以沿与流动方向成αs方向滚动。如上讨论，Cis可能变化。在某些实施方式中，αs至少是0.5度。在各种实施方式中，Cis可以是至少1度，至少2度，至少3度，至少4度，至少5度，至少6度，至少7度，或至少8度。在各种实施方式中，as可以是小于约70度，小于约65度，小于约60度，小于约55度，小于约50度，小于约45度，小于约40度，小于约35度，小于约30度，小于约25度，小于约20度，或小于约15度。不希望被任何特别的理论束缚，细胞可以以更小的角度更容易地滚动且可以忍受角度高达最大角度atr。a可根据细胞的特征、细胞分离系统的特定条件等变化。速度细胞滚动的速度也可依赖于细胞的特征、系统的特定条件等。在一些实施方式中沿边缘滚动的细胞的速度可大于类似细胞在远离边缘的涂覆区域上滚动的速度。在它沿边缘滚动的时间内给定的细胞可能以可变的速度或以基本上恒定的速度滚动。在一些实施方式中，亚群中的细胞当沿具有给定角度α3的边缘滚动时具有相同的平均速度。在一些实施方式中，当沿具有给定角度as的边缘滚动时，亚群中的细胞具有不同的平均速度。细胞可以沿边缘，例如沿与流动方向成as的方向以平均速度至少约0.1μm/s，至少约0.5μm/s,至少约0.8μm/s,或至少约1.0μm/s滚动。剪应力假设一个线性流体速度图，在一些实施方式中，细胞上的剪应力可能与流体速度相关，如厂流体(方程式1)"T=^A细胞其中μ是流体粘度，Rffllfi是细胞的半径，且是与表面距离Rffllfi处的流体流动的速度。在一些实施方式中，流过表面细胞上的剪应力在约0.05dyn/cm2至约50dyn/Cm2范围内。在一些实施方式中，剪应力范围是约0.2dyn/cm2至约5dyn/cm2。细胞变形能力不希望被任何特别的理论束缚，给定细胞的变形能力可能影响它沿边缘的滚动能力。例如在一些实施方式中，较不可变形的细胞比较可变形的细胞可能更不容易沿边缘滚动。当它滚动时，细胞接触表面的区域可以表示细胞的变形能力。例如以较大接触区域与表面相互作用的细胞比以较小接触区域相互作用的那些细胞更能变形。在一些实施方式中通过接触半径可以定义接触区域。在一些实施方式中，沿边缘滚动的细胞以至少约0.25μπι的细胞接触半径接触表面。在各实施方式中，可以是至少约1μm，至少约2μm，至少约3μm，或至少约4μm0细胞的变形能力可以改变，例如通过在流动前和/或流动期间用改变细胞变形能力的试剂处理，如本文中所讨论。参数的关系和组合在本发明的某些实施方式中，彼此相关地定义参数。在一些实施方式中，物理约束(physicalconstraints)指导2个或多个参数之间的关系。例如，在一些实施方式中和对于某些设计，αs可能与Ws(在某些设计中涂覆区域的条带宽度)和/或(对于某些设计条带之间间隙的宽度)相关联。作为另一个实例，细胞变形能力可能至少部分依赖于细胞大小。在一些实施方式中，2个或多个参数有意地通过设计约束。例如，如本文中讨论的，Wg可以约束为基于(细胞接触半径)的某些值。在一些实施方式中，Ws可以设置为等于wg。可以通过试验测定参数间的关系。例如，对于每个^和/或，可以确定可使细胞在边缘上滚动的相对于流动方向的最大角度ate。细胞粘附分子密度也可以影响atr。Ε.细胞分离和/或收集在本发明的某些实施方式中，方法进一步包括从细胞群中某些细胞中分离至少一个细胞。在一些实施方式中，方法可以进一步包括收集一个或多个亚群的细胞。细胞分离可以有助于诊断应用。例如，发明的方法可以允许分离以及作为结果，检测某些类型的细胞例如活化的中性粒细胞、循环的肿瘤细胞等。在生物样品中存在这样的细胞类型可能预示某些症状、疾病等。在一些实施方式中，分离和/或收集的细胞可在下游应用中使用，例如，培养在起始的细胞群中或在流体中以低量存在的亚群细胞。分离和/或收集的细胞可能具有治疗价值。例如分离和/或收集的干细胞可以用于再生组织和/或功能。由于细胞滚动是不影响细胞生理学的温和过程，发明的方法可能特别适用于某些治疗应用。分离可以基于至少一个细胞的与来自于群中的其他细胞相比不同的滚动特征。例如具有共同特征的亚群细胞比群中其他细胞能够沿边缘滚动的更好(例如从表面分开前滚动更长的时间，具有更高的速度等)。例如使用与流体流动方向成角度的边缘可以沿特定的方向引导这样的亚群中的细胞，而不容易滚动的细胞没有从流动方向上偏离。在一些实施方式中，至少一个感兴趣的细胞沿边缘滚动并沿某个方向偏离流动方向。可以沿着偏离细胞轨道的一个或多个收集点上和/或在轨道末端收集细胞。在一些实施方式中，使用“负”选择方案，其中未沿边缘滚动的细胞与其他细胞分离。例如，可以设计边缘以引导沿边缘滚动的细胞离开给定的收集点。因而，没有沿边缘滚动的细胞可能与其他的细胞分离和/或被收集。(参见例如图4Α和实施方式14)在一些实施方式中，用本文中披露的发明的设备可以有助于细胞分离和/或收集。F.三维方法在本发明的某些实施方式中，方法适用于三维系统中。(参见例如实施方式15)。这样的方法类似于已经描述的那些，不同之处在于，替代边缘或除了边缘之外，用无流动的“停滞线”来实现边缘效应。通常，这样的方法包括提供至少部分地用有序层的细胞粘附分子涂覆的三维表面和使细胞群流过表面的步骤。在这样的条件下用这样的方法使流体流动从而生成与流体流动的方向形成角度αs的无流动的停滞线。流动的细胞群中至少一个细胞含有被细胞粘附分子识别的细胞表面部分，且细胞群中至少一个细胞沿与流动方向成αs方向滚动至少部分时间。当流动的流体碰到某种三维物体时可以生成“停滞线”。在流动方向上产生差异的任何物体和形状可能潜在地用于生成停滞线。例如，圆柱体、隆起部、凹槽、凸起等可以生成停滞线。这样的物体和形状的至少部分的外表面和/或暴露的表面可以用可诱导细胞滚动的细胞粘附分子涂覆。在表面上滚动的细胞将滚向停滞线，且然后(在某些条件下)沿停滞线滚动并从而沿着它移动。当停滞线与流体流动的方向成一个角度时，细胞可以沿与流体流动方向成一个角度的方向滚动。当沿边缘滚动的情况下，细胞可以沿停滞线移动只要该角度不超过最大角度αte，它的值取决于细胞分离系统的特定条件。可以根据考虑的表面和表面周围的流场形成停滞线。因而，停滞线可以作为边缘起作用并易于细胞滚动。在某些实施方式中，三维表面含有至少一个如本文中讨论的边缘且可能包括或可能不包括停滞线，如图6A和B中描述。例如该边缘可以在球形、圆柱形等表面上。边缘也可以是沿波浪表面，沿具有周期性凸起的表面等。II.设备在本发明的一些方面中，提供细胞分离的设备。在某些实施方式中，设计这样的设备以根据本发明的方法进行使用。通常，这样的设备包括分离流动室、用于使细胞流入分离流动室的进口、以及用于使细胞流出分离流动室的出口，其中分离流动室含有至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面，且其中该表面包括至少一个用有序层涂覆的一个区域和未用有序层涂覆的另一个区域之间的边缘。在这样的设备中，当细胞流过进口到达出口时，它们以与至少一个边缘的方向成角度αs流动，除非它们与该至少一个边缘相互作用。本发明的设备可以包括以上在本发明方法的讨论中披露的任何特征。应当理解，当对于特定应用可能需要时，设备可以包括任意数量的进口或出口。例如在某些实施方式中设备可以进一步包括另外的进口用于将无细胞的缓冲液流引入分离流动室。多个出口可能是有用的，例如当收集由于流动通过分离流动室而得到差异性分离的细胞时是理想的。分离流动室可以具有任何形状，例如但不限于，方形或矩形。不希望被任何特别的理论束缚，分离流动室的高度可以影响被迫与表面相互作用的流动细胞的百分比。在一些实施方式中，限制高度从而使流过分离流动室的更多的细胞与表面相互作用是理想的。在本发明的一些实施方式中，限定分离流动室的壁具有约5μπι至约Imm范围的高度。在各种实施方式中，这样的壁的高度低于约100μm，低于约75μm，低于约50μm,低于约25μm,或低于约15μm。该高度在分离室的全长度上可能不是一致的。例如高度可以穿过分离室的长度逐步变化。在某些实施方式中，分离流动室可以通过下面的部分涂覆表面、壁和上面的未涂覆表面限定。在某些实施方式中，单个设备可以包括多个分离流动室，每个都具有它们各自的进口和出口。在某些实施方式中，这些分离流动室可以是分开的且不能相通(即，平行系统)。在这样的设备中每个分离流动室可能包括相同或不同的边缘设计。当在类似的条件下需要重复分离时(例如一个或多个测试样品和一个对照样品)包括多个具有相同的边缘设计的分离流动室的设备可能是有用的。当需要鉴别产生最佳分离(例如相同的测试样品使用不同的试样量)的设计时，包括多个具有不同设计的分离流动室的设备可能是有用的。在某些实施方式中，设备可以包括2个或多个流体相通的分离室(例如其中第一分离室的出口注入第二分离室的进口)。在这样的设备中各分离流动室可以包括相同或不同的边缘设计。应该明了这样的系列装备可能是有用的，例如，当将已通过第一分离阶段得到分离的细胞亚群暴露于第二个分离阶段分离(例如，以分离亚亚群)时，这是理想的。应该明了上述实施方式的任意组合或排列均包括在本发明中。在本发明的某些实施方式中，发明的设备可以与其它设备联合使用。例如流出一个设备的出口的细胞可以流入另一个设备。可替代的或另外地，可以制造设备使得它们接收(进入它们的进口)从另一个设备流出的细胞。在某些实施方式中，设备进一步包括一种或多种用于收集至少一个流过分离流动室的细胞亚群的装置(例如在分离流动室的一端的一个或多个通道)。应当明了任何前述的方法可包括使用这些装置收集细胞的步骤。在一些实施方式中，多孔滤器可以设置在通道的一端。设备中可以使用多个通道用于收集细胞亚群。在一些这样的实施方式中，设备进一步各自包括多个可以设置在例如收集通道的末端和/或连续通道之间的多孔滤器。可以设计和/或制造设备从而可能容易地可视化收集的细胞。例如，可以用眼睛、用低功率显微镜、用放大镜、或它们的组合看到收集的细胞(例如参见图7，其示出当通道充满细胞时可以用眼睛看到的通道)。在一些实施方式中，通过光照促使通道中收集细胞的可视化。在一些实施方式中，帮助可视化细胞的设备元件可以结合在设备中。例如，放大镜可以构造在设备中，并使得它放大收集通道而进行设置。可替代地或另外地，在有色流体、染料等或它们的组合的帮助下可以可视化收集的细胞。在一些实施方式中，无需进一步处理可以获得对收集的细胞数量的评估。在一些这样的实施方式中，设备可以引入例如沿收集通道的核对标记使得收集细胞的柱高度表示细胞的体积和/或表示细胞的数量。在某些实施方式中，设备进一步包括用于控制流速(flowrate)的装置。在一些实施方式中，控制流速的装置是注射泵。通常，应当理解，尽管在本文中描述的许多实施方式中应用液体流体流动，仍然可以通过各种装置来实现在发明的方法或设备中细胞的流动。因而，虽然细胞可以在流体中流动，细胞也可以利用毛细管作用而流动。因而，在一些实施方式中，细胞可以在真空下流动。在一些实施方式中，细胞至少部分地由于一个力或多个力例如重力、电动力、离心力和它们的组合而流动。实施例下面的实施例描述了形成和实施本发明的一些优选方式。然而，应当理解这些实施例仅仅是用于说明的目的并不意味着限制本发明的范围。而且，除非实施例中的描述以过去式表述，原文，如本说明书的剩余部分，不用于说明实验实际已经完成或数据实际已经得到。实施例1:P-选择蛋白涂覆的表面在例如本文中描述的某些应用中能够控制生物分子在表面上呈递可能是理想的。例如，控制表面上生物分子的密度和构象以及提高这样涂覆表面的稳定性使得能够调整这样的表面而用于特定的应用。而且，共同固定第二分子可以有利于某些类型的亚群例如间充质干细胞/祖细胞的选择性分离。共价固定生物活性物质对于控制参数如密度、构象，和提高稳定性可能是有利的。尽管肽和酶的共价固定方法已经研究了几十年，共价固定大分子量的生物分子例如选择蛋白呈现显著的挑战性。在这些挑战中包括与非特异性位点的结合增加以及为了防止蛋白失活要求温和的处理条件。在本实施例中，P-选择蛋白共价固定到玻璃基层上并检测这样的涂覆表面的特性(例如，P-选择蛋白分子的方向、密度、和稳定性等)。材料和方法从R&DSystems(Minneapolis,MN)购买重组人P-选择蛋白/Fe嵌合体(P-选择蛋白)和人Fc抗体片段。从TeleChemInternationalInc.(Sunnyvale,CA)得到未用SuperClean修饰的载玻片和用SuperEpoxy(Arraylt)官能化的载玻片。从NektarTherapeutics(SanCarlos,CA)得到异双官能团聚(乙二醇)(NH2-PEG-C00H)。从BangsLaboratories得到具有9.95μm直径的SuperAvidin涂覆的微球。从Glycotech得到多价的生物素化SialylLewis(X)-聚丙烯酰胺(sLex-PAA-生物素)和具有250μm厚度垫片(gasket)的矩形平行板流动室。本实施例中使用的所有其他化学物从Signa-Aldrich(St.Louis,MO)得到。使用本实施例中使用的材料，除非另外说明，否则无需进一步纯化。制备表面如图8中说明的，含有环氧基团(SuperEpoxy)的玻璃基层首先用作为间隔(spacer)的5mg/mL双官能团聚乙二醇(Mn5,000)涂覆从而为P-选择蛋白和无污浊表面(non-foulingsurfaces)提供反应位点(羧基端)。用EDC和NHS预先活化PEG接头上的羧酸基团，随后与P-选择蛋白溶液(5yg/mL)在室温下反应过夜。得到的表面用PBS彻底清洗并在4°C保存为以后使用。也在平面玻璃上和在用于比较的无EDC/NHS活化的PEG化的玻璃上制备物理吸附P-选择蛋白的表面。通过接触角测量和X-射线光电子光谱(XPS)(数据没有给出)确认固定操作的每个步骤。结果和讨论在环氧树脂涂覆的载玻片上制备P-选择蛋白涂覆表面并分析讨论如下。通过微球和活细胞的滚动测定提高的功能稳定性用多价的生物素化的SialylLewis(χ)-聚丙烯酰胺(sLex-PAA-生物素)结合亲和素涂覆的微球并用作细胞模拟。对于使用微球结合体(microsphereconjugates)的流动实验，将具有250μm厚垫片的矩形平行板流动室置于具有P-选择蛋白的玻璃表面上。多价sLex涂覆的微球(约5X105/mL)以剪应力约0.24dyn/cm2灌入流动室。每5秒钟拍照并通过测量连续图像中每个微球的位移计算速度(对至少20个微球进行平均)。新制备的表面比未修饰的表面具有大大降低的微球速率。微球结合体在无P-选择蛋白的PEG化表面上以平均速率30至40μm/s行进，它与根据Goldman计算(Goldmanetal.1967."Slowviscousmotionofasphereparalleltoaplanewall.IICouetteflow.”ChemicalEngineeringScience.22:653_660，其全部内容整体通过引用结合于此)的57μm/s合理地一致。21天后在室温下在PBS中，与物理吸附P-选择蛋白和未活化表面(无NHS/EDC)相比，P-选择蛋白共价固定在环氧树脂玻璃上具有显著更好的长期稳定性。P-选择蛋白固定的表面(预先活化)在微球速率方面减少最多，其中微球以它们在无P-选择蛋白的PEG化的环氧树脂表面上约40%的速率行进。P-选择蛋白固定在未用EDC/NHS处理的环氧树脂玻璃上和P-选择蛋白吸附的平面玻璃上使微球结合体相对更快地行进。在P-选择蛋白固定的未用EDC/NHS处理的环氧树脂玻璃和P-选择蛋白吸附的平面玻璃上，sLex-PAA结合的微球分别以在无P-选择蛋白的PEG化的环氧树脂表面的表面上它们的速度的约85%和约70%行进。在流动下也使用平行板室研究中性粒细胞滚动与固定的P-选择蛋白的相互作用。2.5XIOVmL中性粒细胞的悬浮液以相当于范围1至lOdyn/cm2的壁剪应力的不同流速灌入室中。如果滚动>10秒同时保持在视野中(用IOX物镜的864X648μm2)以及如果以平均速率小于50%计算的无相互作用细胞的自由流速平移，细胞归类为滚动。不具有P-选择蛋白(例如平面玻璃和PEG化的环氧树脂载玻片)的对照表面不显示细胞粘附(数据未给出)。从在四种不同的壁剪应力(1、3、5和lOdyn/cm2)下，体外细胞滚动检测可见共价固定的P-选择蛋白的稳定性是明显的。通过物理吸附P-选择蛋白制备的表面滚动细胞的数量随时间大大减少，而共价固定的P-选择蛋白制备后28天甚至仍保持不变(图IOA和10B)。特别地，以3dyn/Cm2，具有共价固定的P-选择蛋白的老化表面上的滚动流速未显示有很大的减少(80.6士19.(均值士SEM)，但在老化的P-选择蛋白吸附的表面上的流速分别地下降到30.1士5.2%。用SPR实时分析共价固定为了定量地表征固定化学物和它们在配体连接上的影响，使用表面等离子体共振(SPR)。该基于流动的SI^R系统提供1)由于存在金层用巯基化学物易于表面官能化，以及2)无需任何对分析物的改变定量并实时监测结合的事件。因而，SI^R技术特别地对于测定密度的可控性和P-选择蛋白的方向是有用的。我们开发了化学物以得到无污浊(non-fouling)的表面性质并为随后在金涂覆的Sra芯片上用寡聚乙二醇-烷基硫醇(Prochimia，波兰)进行P-选择蛋白固定提供反应位点。在无污浊的PEG表面上固定具有优点，因为1)由于高含量的PEG-OH基团减少了非特异性相互作用，2)通过改变双和单官能团PEG成分之间的比率促进密度/方向的可控性，比使用不同的P-选择蛋白浓度更容易且更可重复，以及3)潜在地使得能够在相同的表面上引入多种化学物。通过将清洁的金涂覆的基层在室温下浸泡在100μMOEG-烷基硫醇的乙醇溶液中过夜生成自组装的单层(SAM)。以所示的摩尔比0EG-C00H0EG-0H(139，19,37，55)和OEG-生物素0EG-0H(19)使用不同的OEG-烷基硫醇的混合物。在加入SPR仪器前将SAM冲洗，干燥并脱气。在0EG-C00H/0EG-0H的混合SAM表面上固定P-选择蛋白，如图10A中所示。首先IOmM磷酸缓冲液(PB)以流速50μL/min流入芯片5分钟。注入超量的EDC与NHS的1l(v/v)的混合物以活化SAM上的羧基10分钟。流动5分钟后，以浓度20μg/mL注入P"选择蛋白的PB溶液并流动7分钟用以固定。然后用PB清洗芯片表面5分钟，随后用乙醇胺(IOOmMPB溶液中)将剩余的活性酯基团失活并从表面去除松散连接的P-选择蛋白。对于OEG-生物素/OEG-OH的混合的SAM上P-选择蛋白的固定，SPR测量前首先用马来酰亚胺-PEO2-生物素(Pierce)将P-选择蛋白生物素化，如图IOB中所示。4°C下将50μL的lmg/mL的P-选择蛋白在PBS中的P-选择蛋白溶液与50摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素溶液混合过夜。用IOK分子量截至膜(cut-offmembrane)通过4个循环的超滤纯化反应混合物。以14，000Xg持续30分钟完成每次循环。OEG-生物素/OEG-OH混合SAM装在SI3R上且10μg/mL的抗生蛋白链菌素PBS溶液流动10分钟生成对生物素化的P-选择蛋白的连接位点。然后在用于其他混合SAM表面的相同条件下通过强生物素/亲和素连接来固定P-选择蛋白。以流速50μL/分钟实现在SPR中的固定。用sra表征的稳定和可调的P-选择蛋白固定的表面为了比较共价固定与物理吸附，使用一些sra通道作为参照通道，其中P-选择蛋白吸附在未用EDC/NHS活化的表面上。共价固定的P-选择蛋白看上去是稳定的，而当用150mMTris-HCl缓冲盐清洗时，物理吸附的P-选择蛋白容易从表面分离(图11)。为了控制P-选择蛋白的密度，使用0EG-C00H/0EG-0H以不同比率(使用图IOA中所示的化学物)混合的SAM且在上述相同条件下固定P-选择蛋白。图IlA显示P-选择蛋白的量与含有-COOH的SAM成分的量成线性比例。因而，用混合的SAM可以控制固定密度。通过比较图IOA(随机构象)和图IOB(定向构象)中两种不同的化学物也检测P-选择蛋白的方向效应。因为P-选择蛋白分子具有可以与表面上-COOH基团反应的多个氨基，P-选择蛋白的构象应该是随机的。相反地，P-选择蛋白已知在N端活性结合位点的另一侧上仅具有一个半胱氨酸作为它的第766个氨基酸(本研究中使用的P-选择蛋白由其天然形式的1至771氨基酸构成)。对于用两种化学物制备的通道，首先固定(波长偏移约12nm)相当量的P-选择蛋白，随后以20yL/分钟的流速流动20yg/mLP-选择蛋白抗体(eBioscience)。具有定向的P-选择蛋白的通道比来自具有随机固定P-选择蛋白的通道具有显著更大的结合响应(bindingresponse)(图11B)，表明通过使用硫醚化学物可控制P-选择蛋白的方向。在共价固定的初步研究中，我们表明P-选择蛋白可以被共价固定到表面上，这提供了更好的稳定性(与物理吸附比较)和密度的控制以及P-选择蛋白的方向。这些结果表明用开发的化学物可以制备稳定且可调的表面。稳定且可调的表面对于细胞亚群的一致性和有效分离可能特别有利。实施例2在基层上生成P-选择蛋白边缘如本文中所述，具有边缘的涂覆表面可以促进基于细胞滚动的分离。在本实施例中，用硅橡胶掩模可以在载玻基层上生成P-选择蛋白涂覆区域和未涂覆区域之间的边缘。材料和方法将人P-选择蛋白/Fe嵌合体(R&DSystems)放在清洁的载玻片(SuperClean2，TelechemInc.)上，用有机硅垫片作为阻隔层阻止在物理吸附P_选择蛋白时部分玻璃基层对P-选择蛋白的吸附。清洁的有机硅条置于载玻片上，其中它们的边缘以与载玻片的边缘成所需角度而排列。用IXPBS冲洗载玻片2次，并在载玻片的暴露区域上吸附5μg/mLP-选择蛋白(1XPBS中)过夜。然后用1XPBS冲洗载玻片，移去有机硅条，且全部表面用5%FBS或BSA封闭。对于一些载玻片，为了使P-选择蛋白涂覆的区域可视化，用BSA-FITC(Sigma-Aldrich)替代BSA或FBS进行封闭。结果和讨论尽管共价固定P-选择蛋白增强了表面性质例如功能稳定性，实证研究不需要长期稳定性且在玻璃基层上P-选择蛋白的物理吸附是充分的。为了将P-选择蛋白沉积在玻璃基层上用有机硅橡胶掩模实现了P-选择蛋白的选择性物理吸附(图12)。在封闭步骤中，用牛血清白蛋白与荧光素异硫氰酸酯连接(BSA-FITC)显示出与P-选择蛋白涂覆的区域相比，在被有机硅掩模占据的区域内BSA的选择性吸附。涂覆区域具有明确限定的边缘，表明在物理吸附步骤中，有机硅掩模没有泄露。而且，当细胞流经该基层时，细胞选择性地与用P-选择蛋白涂覆的区域相互作用，证明该技术的成功(图1A，1B，和13E)。实施例3引导在含有成角边缘的基层上的细胞滚动在这个实施例中，用含有P-选择蛋白分子的基层形成具有与流体流动方向成角度边缘的涂覆表面来影响细胞滚动的方向，证明利用沿成角度的边缘的细胞滚动来分离细胞的潜在可能性。材料和方法如实施例2中所述生成P-选择蛋白涂覆的表面，在涂覆区域和未涂覆区域之间具有边缘。边缘相对于流动方向以各个方向成角度。在流动室中的细胞和微球滚动实验。在商购的矩形平行板流动室Icm宽，6cm长，和125μπι深(250μπι用于微球)(GlycotechInc.)内进行细胞和微球滚动实验。将细胞培养基中密度3至5X105/mL的HL-60细胞或在具有1%BSA的1XPBS缓冲液中密度105/mL的微球装入安装在注射泵(NewEraPμmpSystems,Inc.，Farmingdale,NY)上的5mL注射器中以控制流速。流速在50至2000μL/min之间变化，相应的剪应力为0.32至12.8dynes/cm2(0.032至1.28Pa)。当细胞流动时，为了将HL-60细胞与P-选择蛋白嵌合体的Fc部分之间的相互作用减到最小，在实验前将5μg/mL的人Fc片段加入到细胞悬浮液中。流动室固定在Axiovert200Zeiss显微镜上(CarlZeiss,Thonwood,NY)，并用IOX物镜通常地在1至4分钟持续期内对于细胞滚动以每秒1祯的速率以及对于微球滚动以每秒3祯的速率得到图像。流动是层流(Re约0.1至3)并用平面傅立叶流动应用方程式计算剪应力(τ)其中μ是运动粘度，Q是体积流速，w是流动室宽度，且h是流动室高度。数据分析为了有助于数据分析，图像调整到相同程度的亮度、对比度、和Y修正并用围绕颗粒跟踪免费软件构造的自制Matlab颗粒跟踪软件进行处理。为了识别细胞用空间滤光片和亮度阈过滤图像。通过比较Matlab生成的细胞位置图像与实时图像验证该步骤从而确保在图像处理过程中没有乱真效果。通过平均像素密度以定位像素质心，用亚像素分辨率(sub-pixelresolution)进一步定位细胞位置。将针对整组图像的这些数据合并成列出在每个时间点滚动细胞的位置的颗粒轨迹(或粒子径迹)。舍弃在一幅图像中甚至缺少细胞的轨迹，正如对应于其中细胞没有显示显著位移(30μm在图像的全序列中)的粘附细27胞的轨迹。颗粒跟踪程序设定阈值每祯15μm的最大位移；因而没有跟踪自由流动的细胞。最终的结果是在每个时间点上每个细胞的位置列表，它可以用于可视化和进一步分析。通过轨迹的起始和终止位置之间的位移除以占用时间得到平均细胞速度。当轨迹仅在P-选择蛋白涂覆的区域内出现时，从颗粒轨迹上很容易识别P-选择蛋白涂覆的区域的边缘，并可以用直线表示。为了说明边缘对细胞滚动的影响，对在边缘的15ym内开始的轨迹分析速度并与从超出边缘90μm开始的轨迹比较。对于每组轨迹，得到平均速度和速度分布。微球数据也类似地分析。结果和讨论我们研究P-选择蛋白单一边缘对滚动的HL-60细胞移动的影响，HL-60细胞是一种表达高水平的P-选择蛋白糖蛋白配体-I(PSGL-I)(其在选择蛋白上介导细胞滚动)的人骨髓细胞系。在许多研究中表征HL-60细胞的滚动行为，包括对剪切率、细胞硬度和拓扑学的依赖，以及在微流体设备中的捕获。HL-60细胞很强壮并易于培养且类似于白细胞的PSGL-I的表达水平使它们成为实证研究的合适的候选者。密度3至5XIO5细胞/mL的HL-60细胞的悬浮液以剪应力约0.32至约12.8dyn/cm2(0.03-1.28Pa)使用商购的流动室流过实施例2中制成的基层。流动室是宽度lcm，高度125μπι(用于细胞)或者250μπι(用于微球)，且长度6cm的矩形，在任意一端具有进口和出口。只有一些细胞与表面相互作用，而其余的细胞流过室而没有与表面相互作用。只分析那些与表面相互作用的细胞。在P-选择蛋白涂覆的区域上观测HL-60细胞的选择性滚动，比在其中细胞没有通过形成粘附结合而被延缓的BSA涂覆的区域上的那些具有更低的细胞滚动速度。在我们的实验中剪应力范围约0.32至约12.Sdyn/cm2，滚动细胞典型的速度范围是约0.3至约1.2μm/s，它相当于或小于在其他研究中报道的细胞滚动速度。显著地，当滚动的HL-60细胞碰到P-选择蛋白区域边缘时，它们从它们沿边缘的方向行进的最初方向偏移，证明边缘确实可以通过瞬时受体-配体粘附结合来控制细胞的转运。在这种特定实验的条件下，仅对于边缘和流动方向之间小角度(<约10-15°)可以观察到该效果，且几乎碰到边缘的所有细胞从它们最初的行进方向偏离并被迫沿P-选择蛋白边缘移动。在更大的边缘角度上没有观测到边缘效应；碰到边缘的细胞与基层分离并继续沿流体流动的方向流动。因而，在该特定实验的条件下，只有在更小的边缘角度下可以改变细胞的行进方向。图12示出在1.9dyn/cm2(300μL/min)的剪应力下细胞滚动的快照，其中两个细胞被突出，一个在P-选择蛋白涂覆区域内没有碰到边缘的细胞和另一个碰到边缘并被迫沿边缘行进的细胞。碰到边缘的细胞从它的流体流动的方向偏离并相对于另一个没有碰到边缘的细胞以角度8.6°行进，证明单个P-选择蛋白边缘可以用于基本上改变细胞滚动的方向并因此控制滚动细胞的转运。为了分析细胞的滚动行为，用Matlab处理图像序列。滤出静态粘附细胞并绘出单个细胞的轨迹，清楚地表明在边缘上滚动的细胞和在P-选择蛋白区域内滚动的细胞的不同行进方向(图14A)。设置图像获得速率和处理参数使得只有在表面上滚动的那些细胞被跟踪。与滚动的细胞相比，没有滚动的细胞快速移动且每一帧它们有较大的位移，使同时跟踪滚动和自由流动的细胞变得不可能。在封闭区域内看不到轨迹，反映在该区域内没有滚动的细胞。碰到边缘的P-选择蛋白区域内滚动的细胞被迫在其上滚动而不是穿过边缘，导致与流体流动成一个角度转运的移动细胞得到积累。该作用在绘出的轨迹(图14A)中是显而易见的，但由于一段时间内积累的静态粘附细胞，该作用在图像(图14)中不明显。只有当绘出更长的细胞轨迹时(图14B)P-选择蛋白边缘的效果才非常清楚。为了说明边缘对细胞滚动的影响，轨迹分成两组(a)在离边缘30μm的距离内(碰到边缘的细胞)开始的轨迹，和(b)超出边缘90μπι距离(不被边缘影响的细胞)开始的轨迹。确认每个轨迹的行进方向并绘成柱状图(图14C)，零度角对应于在P-选择蛋白区域内细胞滚动的平均方向。碰到边缘的细胞的行进方向明显地与其他细胞的行进平均方向相差4至10°。该分析进一步证实边缘控制滚动细胞的行进方向的能力。而且，邻近边缘的细胞以平均速度约1μm/s滚动，而远离边缘的细胞以平均速度约0.5μm/s滚动。这些结果证明P-选择蛋白边缘使得能够通过(a)改变滚动方向和(b)增加滚动速度来控制滚动细胞的转运。用与P-选择蛋白形成瞬时结合的SialylLewis(χ)(sLex)涂覆的微球进行类似的实验并用作研究细胞滚动的模型。微球选择性地在P-选择蛋白区域上在流动速度约200μL/min(对应于剪应力约0.33dyn/cm2(0.033Pa))下以平均速度约3_4μm/s滚动。该速度与本发明人以前在P-选择蛋白上滚动的sLex涂覆的微球上得到的数据一致。然而，P-选择蛋白边缘对微球的滚动方向不具有很大的影响。碰到边缘的几乎所有的微球越过边缘穿过且它们的行进方向保持不变(图14D)。对应于这些微球的轨迹在边缘处终止而不是继续追踪。一旦这些微球从边缘偏离，它们继续沿流体流动的方向流动且由于它们高得多的速度而不再被追踪。这个观察证明在P-选择蛋白涂覆表面上具有类似滚动行为的两种类型的颗粒能够在P-选择蛋白边缘上具有显著不同的滚动行为。在边缘上细胞和微球的滚动行为之间这种明显差异在一维的滚动上并不明显并且表明边缘效应能够基于它们的纳米机械性质区别滚动的颗粒。没有被理论束缚，提出当细胞碰到边缘时，由于流体流动作用在细胞上的净力和随粘附结合断裂施加的力之间的偏移引起细胞进行非对称滚动移动并沿边缘移动(图15)。在流体流动的方向上驱动滚动移动的力矩可以预期是FeXa的量级，其中a是细胞或微球的半径，且Fe是作用在细胞上的流体力。引起细胞沿边缘移动的不对称力矩可以期望用FeX衡量，其中是其中细胞或微球与基层相互作用的接触区域的长度尺度。如果接触区域非常小该不对称力矩可以预期变成零，因为作用在细胞或微球上的净力应该与由于粘附结合的力校准，即FeXlee不应该大到足以维持该不对称移动，但FeXa应该保持相对不变。对于硬微球，接触长度限制在约0.4至约0.6μm，假设该结合或连接分子可以延伸约5至约lOnm。然而，细胞滚动可能依赖于细胞的机械性质，包括它的变形能力和大小和微绒毛的伸展能力，且对于滚动的HL-60细胞接触长度可能是几微米长。而且，由于微绒毛延伸几微米，滚动细胞可能伸展很长的范围，这有效地增加了滚动细胞和基层之间相互作用的区域。不希望被任何特别的理论束缚，缺乏伸展很长范围的能力可能是sLex涂覆的微球在P-选择蛋白区域上选择性地滚动，甚至当它与流体流动的方向形成小角度时也不沿边缘移动的原因。这个实施例证明基于特异性受体_配体相互作用的细胞的转运可以通过排列介导细胞滚动的受体以无标记的方式控制。P-选择蛋白的单一边缘能够基本上改变滚动的HL-60细胞相对于其中细胞以别的方式滚动的流体流动方向的轨道；同时，P-选择蛋白的单一边缘影响滚动的微球小得多的程度。实施例4微流体设备我们开发了一种微流体设备，它使用在边缘上的滚动分离细胞。用软光刻技术以PDMS(聚二甲基硅氧烷)制造该设备。首先，用微流体成形(Delamarche，E.etal.1997."Patterneddeliveryofimmunoglobulinstosurfacesusingmicrofluidicnetworks.”Science.276(5313):779_78，其全部内容整体通过引用结合于此)定义P-选择蛋白在玻璃或聚苯乙烯基层上的线。然后用真空歧管装配该设备以使PDMS成分保留在基层上形成高度范围30μm至250μm的流动室(图16)。该设备含有用于细胞和缓冲液流的独立的进口。该排列允许细胞流沿着不含有任何细胞的缓冲液流平行流动。作为细胞分离的实证，我们检测设备中的P-选择蛋白排列是否能够通过引导细胞沿P-选择蛋白边缘滚动而将细胞推出细胞流外。当含有HL-60细胞和微球的流和缓冲液流流经设备时，细胞流中的一些细胞被束缚并在基层上的P-选择蛋白边缘上滚动。由于边缘相对于流动的细胞流形成角，这些细胞被推出细胞流并因而与初始流动流中的微球分离(图16B)。这个结果进一步证明基于细胞滚动制作细胞分离设备的可行性。实施例5在含有边缘的基层上间充质干细胞/祖细胞(MSPC)滚动的表征在这个实施例中，研究P-选择蛋白排列对MSPC相对于流体流动方向的滚动方向的影响。这个实验的一个目的是使该排列指导滚动细胞的轨道的能力最大化以及研究它是如何依赖于细胞的性质例如大小、配体密度和变形能力。在标准的商购的流动细胞(GlycotechInc.)中用具有选择蛋白边缘的载玻片(基层)进行滚动实验。使用具有细胞质表达GFP的MSPC。如厂商说明，在LonzaMSPC扩展培养基(expansionmedia)中培养细胞。为了确保MSC的同一性，用流式细胞仪使用各种正和负细胞标记来表征MSC(Dimitroff，C.J.etal.2001."CD44isamajorE-selectinligandonhμmanhematopoieticprogenitorcells."JournalofCellBiology.153(6)1277-1286；Pittenger,Μ.F.1999."Multi1ineagepotentialofadulthμmanmesenchymalstemcells."Science.284(5411)143-7；andCaplan,A.I.1991."Mesenchymalstemcells.”JOrthopRes.9(5):641_50；其中每一个的全部内容整体通过引用结合于此)。正标记包括⑶90、⑶146、⑶44和⑶29。负细胞标记包括两种特异性的造血细胞表面标记，包括⑶45和⑶34。在无酶的细胞裂解液(Sigma)中孵育细胞10分钟。用含有FBS和0.05%NaN3(FACS缓冲液)的PBS清洗后，用40μm细胞滤网过滤细胞并用如下的小鼠IgG，κ抗体孵育30分钟1)CD34荧光素异硫氰酸酯(FITC)结合的抗体(用FACS缓冲液稀释)，2)CD45FITC结合的抗体，3)CD90FITC结合的抗体，4)⑶146R-藻红蛋白(R-PE)结合的抗体，5)CD44FITC结合的抗体(Abeamab30405)，和CD29PE结合的抗体(FAB17781PR&DSystems)，CXCR4(R&DSystems,FAB173P)。也用含有Fc区域的P-选择蛋白表征MSPC表达P-选择蛋白部分。另外，用CFU-F和CFU-O检测来验证细胞分化的能力。(参见实施例7)。为了确保MSC的多谱系分化潜力，也用Lonza的脂肪形成SingleQuot试剂盒检测脂肪形成的分化，随后用油红0染色并用FABP4抗体(AF3150，R&DSystems)进行FAC分析。用NikonTE2000U显微镜得到图像并用Matlab分析如本文中所述的其他工作。使用特异性共价化学物在之前用金装饰的基层上固定P-选择蛋白。由于共价化学物比物理吸附有优势，与其他方法例如微流体成形和微接触印刷比较，对于重复性、坚固性和可控性也如此，故选择该方法。在载玻片上蒸发薄层(约lOnm)的金并用标准的光刻技术形成图案。选择IOnm的金膜有助于通过金膜可视化细胞滚动(Mrksich，M.etal.1996."Controllingcellattachmentoncontouredsurfaceswithself-assembledmonolayersofalkanethiolatesongold."ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.93(20):10775_10778，其全部内容整体通过应用结合于此)。金蒸发后，为了阻止玻璃基层上P-选择蛋白的吸附，用PEO-硅烷(2-(甲氧基(聚乙烯氧)丙基)三甲氧基硅烷，Gelest,Inc.)处理载玻片。然后在金表面上用硫醇化学物固定P-选择蛋白。在涂覆金的区域上，首先连接含有寡聚(乙二醇)(OEG)的烷基硫醇以制备无污浊的自组装单层(SAM)。为了控制P-选择蛋白的密度和方向，使用单和双官能团OEG-烷基硫醇。例如，通过改变SH-(CH2)m-(CH2O)n-OH和SH-(CH2)m-(CH2O)n-COOH或SH-(CH2)m-(CH2O)n-NH2之间混合比率，可以控制可以与P-选择蛋白反应的反应位点(-C00H或-NH2)的密度，在表面上得到控制的P-选择蛋白密度。另外，双官能团OEG-烷基硫醇进一步与接头例如硫代_(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)(硫代-SMCC)反应，允许P-选择蛋白的方向控制。注意P-选择蛋白仅具有一个含有巯基的半胱氨酸残基(位于粘性位点的相对侧的第766个氨基酸)，这允许对它的粘性氨末端的方向进行控制(FujimotoT.etal.1993."P-selectinisacylatedwithpalmiticacidandstearicacidatcystein-766throughathioesterlinkage."JournalofBiologicalChemistry.268(15):11394-11400)。然后全部表面用5%FBS的1XPBS溶液封闭。使滚动细胞偏转最大化的P-选择蛋白边缘的测定使用一种含有由选择蛋白条带宽度00、间隙宽度(Wg)、和相对于流动方向的角度(as)定义的选择蛋白条带(图5)的基本排列。用光刻分辨率测定最小的模式尺寸(约0.5μπι)。初步的数据表明在这些特定实验的条件下，细胞不能被边缘以大αs方向引导。然而，可以预期使用多个边缘甚至在较大的αs方向可以对滚动细胞的轨道具有显著的影响。因而％可以在约Γ到约60°之间变化。滚动细胞与基层的接触区域和重新附着至基层前细胞行进的距离可以是2个参数，它们是特别相关于Ws和Wg的设计。以前细胞滚动方面的研究表明接触的区域一般在约5至约IOym范围内(Dong,C.etal.2000."Biomechanicsofcellrolling:shearflow,cell-surfaceadhesion,andcelldeformability."33(1):35_43，其全部内容整体通过引用结合于此)。wg可以在通过光刻分辨率测定的最小尺寸(约5μπι)和约10μm(它可以是接触尺寸的上限)之间变化。不希望被任何特别的理论束缚，为了最有效地分离，从一个边缘分离的细胞在重新吸附前移动的距离应该最小化。对于Ws<Wg，用选择蛋白涂覆的基层的份数很小，且重新吸附动力学可能被负面影响。然而，增加Ws超过，导致逐渐缩小的返回(return)，因为大部分表面用选择蛋白涂覆且边缘的数量减少。因而边缘排列将设置为宽度wEWs=Wg。设计边缘使得在单次试验中在单一的载玻片上可以测试的多个组合。对于不同α3和w值，在各排列上的MSPC滚动获得轨道。宽度(W=间隙宽度和选择蛋白宽度ws)是可变的，为0.5、1、2、5和1(^!11。边缘角度αs是可变的，为Γ、2°、5°、10°、20°、40°和60°。对于每个宽度，测定最大轨道角度α，可以使细胞相对于流动方向以该角度滚动。另外，与本文中描述的研究一样，沿边缘滚动时细胞行进的距离用Matlab定量。可以预期如果宽度大于细胞与基层接触的区域，最大轨道角度将独立于宽度(w)。对于每个选择蛋白排列，也评估细胞轨道的角度分布。(参见类似于图14中所示的评估)。除了涂覆区域和边缘的几何学，通过降低P-选择蛋白密度并观测它对最大轨道角度α的影响测定P-选择蛋白密度的影响。研究细胞大小和变形能力对含有引导滚动细胞的轨道的边缘的基层能力的影响可以预期MSPC的生物机械性质在细胞滚动和归巢过程中起作用。通过独立地控制每个参数研究细胞尺寸和细胞变形能力的影响。不希望被任何特别的理论限制，细胞变形能力可能扮演重要角色，因为在硬微球的情况下即使对于小αs也没有观察到沿边缘滚动。细胞尺寸影响接触区域并也影响流体流动在细胞上施加的剪应力。为了研究细胞大小的影响，用流式细胞仪根据细胞大小将MSPC分为含有多个相似尺寸分布的3至4个亚群。通过用增加细胞的变形能力的细胞松弛素D处理细胞以控制细胞变形能力。细胞松弛素D是一种细胞可透过性霉菌毒素，它引起肌动蛋白亚单元的结合和分离。细胞松弛素D破坏肌动蛋白丝并抑制肌动蛋白聚合，导致细胞骨架破坏。因为细胞松弛素D也干扰细胞产生伪足延伸以与基层相互作用的能力，一种替代物，甲基-β-环糊精(Mi3CD)也用于降低细胞硬度。MiiCD已知从细胞膜去掉胆固醇，导致膜流动性的显著提高。为了测定细胞大小和变形能力对滚动行为的影响，对特定的MSPC亚群反复进行滚动试验。为了研究细胞大小的影响，对3至4个基于细胞大小分选的MSPC亚群确定最大轨道角度ate。类似地，通过观察细胞松弛素D(或Μβ⑶)如何影响最大α，确定细胞变形能力的影响。实施例6通过在P-选择蛋白上滚动富集MPSC亚群本实施例证明用本发明的方法和设备将细胞群分离成亚群。通过滚动将MSPC分成3至4个亚群并用流式细胞仪检测得到的亚群之间的差异(例如大小和受体密度)。根据实施例5的细胞滚动的表征，通过设计和制造微流体设备实现分离。可以预期根据大小、配体密度、细胞变形能力、或它们的组合将细胞分离。设备设计设备包括一个细胞悬浮液的进口，另一个缓冲液/培养基的进口，一个分离流动室，和几个出口(图3)。用从实施例5得到的结果来指导对设备几何学和选择蛋白排列的设计。细胞悬浮液进口宽度保持在约30μm,因为增加该宽度将可能增加分离距离并因而增加细胞流经设备需要的时间。根据对实施例5中每个细胞群测定的最大轨道角度Cite设计选择蛋白的边缘。考虑的设计的实施例包括(a)恒定的边缘角度，和(b)变化的边缘角度(图3A禾口3B)。边缘和涂覆区域设计的选择受到细胞轨道对该设计的灵敏度的影响如果对于一种设计(其对于特定亚群使Qte最大化)，α^对于其他亚群非常小，那么变化的边缘角度设计可能是合适的。恒定边缘角度设计对于其他情况可能是合适的。流动室的最小长度通过如下近似地给出炉进口#方程式3L:7——^其中N是馏分的期望值。对于w进口=30μm，N=4，以及=，流动室的最小长度是约850μm。对于这个几何学，我们实验中观测到一般的滚动速度细胞分离时间是5至10分钟。因为细胞滚动本来很慢，为了足够的通量，平行的设备操作可能是必要的。对于生理学剪应力lOdyn/cm2，计算细胞悬浮液进口流速是约IyL/min.一个目的是在IOOyL中以细胞密度106/mL分离约IO5细胞。平行使用10个设备以速率10μL/min分离细胞悬浮液(图3)。设备制造用PDMS(聚二甲基硅氧烷)(Sylgard184，DowCorning)使用标准的微成型方法在SU-8(光固环氧树脂，来自Microchem，Inc.)主模上制造设备。在4”娃晶片上用标准方法制造具有理想高度且具有连接微通道的SU-8模式，随后用硅烷处理以防止PDMS粘到模上。PDMS和固化剂的混合物以重量比率101倒入主模中并在60°C固化1小时。固化后，剥除PDMS成分且冲打出通孔作为进口和出口。类似地制造具有连接歧管的PDMS的第二层并用氧等离子体处理连接到该层。用硅树脂粘合剂将进口和出口管连接到该层。将PDMS成分置于另一个之前在一些区域用选择蛋白涂覆的载玻片上以用于实验。用机械钳或真空将PDMS成分和载玻片放到一起。分离MSPC通过FACS分析表征MSPC在不同通道数下P-选择蛋白的密度以检测通道配体表达的差异。用抗体标记试剂盒(53027，Pierce)按照厂商的操作步骤进行FITC标记的P-选择蛋白可以用于这种表征。MSPC以密度IO5至IO6细胞/mL和缓冲液或细胞培养基分别以流速10μL/min和30至100μL/min(依赖于设备的几何学)流入设备中。收集3到5个亚群并分析(a)细胞大小、(b)配体密度、和(c)变形能力。对每个亚群用上述的BDFACSCalibur表征细胞大小和P-选择蛋白密度。在控制压力下通过迫使细胞进入狭窄微流体通道并观察细胞进入通道花费的时间来评估细胞变形能力。为了更好地理解分离的亚群之间的差异，构造统计模型以关联大小、变形能力和配体密度对MSPC受体表达图谱和形成CFU-Fs能力的影响(实施例7)。该模型对于调整增强分离的设计参数是有用的并帮助确定细胞滚动是否可以根据特定性质用于分离MSPC。实施例7具有增强的分化和细胞迁移能力的MSPC亚群的识别本实施例描述本文中披露的细胞分离系统的另一种潜在应用。检测MSPC亚群例如成骨谱系细胞的分化和迁移能力。预期基于滚动的MSPC分离将产生具有不同的分化能力(例如通过形成克隆和产生骨基质的能力测定)和/或在移动行为上不同的亚群。成骨谱系提供一种吸附性功能检测，它可以用于有效地评估细胞群中祖细胞的数量。每个骨结节由单个MSPC引起并在固体表面上在骨重新形成期间生成。骨重新形成由分化的成骨细胞引发并通过粘合线基质的出现进行标记。体外骨生成的顺序与胚胎形成期间膜内骨生成和骨内(endosseous)伤口愈合的顺序平行，并已证实是针对包括大鼠和人的各物种以及来源于人胚胎干细胞的成骨细胞(Davies,J.Ε.etal.1991."Depositionandresorptionofcalcifiedmatrixinvitrobyrantmarrowcells.”CellsandMaterials.1(1):3_15；Baksh，D.etal.2003.“Adulthμmanbonemarrow-derivedmesenchymalprogenitorcellsarecapableofadhesion-independentsurvivalandexpansion.”Exp.Hemato1.31(8)723~32；andKarpetal.2006(citedherein)；其中每一个的全部内容整体通过引用结合于此)。成骨细胞产生的细胞外基质聚集成称作骨结节的矿化基质的离散岛。通过已校准为输入细胞数的骨结节数的回顾分析，人们可以间接测定聚集的MSPC(骨祖细胞)的数量(频率)。骨髓含有每个粘附细胞约1/10，000到1/100，000的MSPC；该数值在人的20岁中后期达到峰值后随年龄减少。尽管在培养扩增的MSPC上有相当的兴趣，MSPC扩增的速率和产率与平板密度和每一段的孵育时间负相关。富集和/或分离骨祖细胞(即具有形成骨结节能力的祖细胞，在一些实例中，在应答于基质衍生因子-I(SDF-I)的迁移事件后)群的能力可以用作基于边缘的细胞滚动分离技术的实证。作为对照实验，通过FACS分析也检测分离的MSPC亚群以测定是否在如实施例5中所述已知MSPC标记物⑶45、⑶90、⑶44和⑶29的表达上有任何差异。在分离的亚群上MSPC归巢受体(CXCR4)表达的表征MSPC缺少或具有许多关键的负责白细胞和造血干细胞归巢的细胞因子受体和整联蛋白的高度可变的细胞表面表达，例如基质衍生因子-I(SDF-I)受体(CXCR4)。改善MSC和其他细胞类型的迁移和植入的方法对于细胞治疗是高度优先的。最近使用编码归巢受体例如CXCR4的逆转录病毒通过增加应答于基质衍生因子-1(SDF-I)和CXCR4的配体(一般出现在发炎位点)的细胞侵入来增强HSC和MSC的归巢和植入(engraftment)。一种更合适的替代方法可以是分离表达CXCR4的MSPC而无需标记受体(如在FACS分选中要求的)。为了检测CXCR4阳性细胞是否具有不同的滚动行为，表达CXCR4的MSPC(通过FACS分选得到)的滚动与不表达CXCR4的那些MSPC的滚动比较。因为CXCR4不是已知的滚动受体，可以预期CXCR4抗体将不影响细胞滚动。如果表达CXCR4的细胞具有不同的滚动行为，则将不表达CXCR4的细胞于表达CXCR4的细胞分开。将MSPC分成亚群，并检测每个亚群中CXCR4的表达，以评估表达CXCR4的MSPC的无标记的分离是否可以用本文中披露的细胞滚动分离系统实现。测定分离的亚群应答于SDF-I迁移的能力除了分离的骨祖细胞数量上的差异，MSPC的亚群可以具有迁移穿过血管内皮进入靶组织的不同的能力。据认为MSPC迁移是由在MSPC亚群上表达的CXCR4受体和它的配体SDF-144之间相互作用介导的，它类似于造血细胞的归巢机制。为了确定是否分离的部分(isolatedfraction)具有不同的潜力以进行迁移，随后产生骨结节，如前所述使用一种改良博登室(Boydenchamber)检测法(Karpetal.2005)。每个部分约50，000个单独的细胞加入到置于6孔板的孔中的穿孔过滤器(transwellfilters)。在15%FBS存在下允许细胞粘附10小时，其后用PBS冲洗孔。在向下隔间(compartment)中加入10或lOOng/ml的SDF-I后，将细胞孵育24小时且然后将过滤器上部的细胞用棉签去除。用PBS冲洗上隔间和下隔间3次后，向上和下隔间加入CFU-O培养基。将细胞再孵育2至3周，每2或3天更换培养基。用四环素定量含有矿化的区域的面积(Karpetal.2005)。在转移到CFU-O培养基之前为了测定滤器下面的细胞数量(即应答于SDF-I从各部分(fraction)迁移的细胞总数)，用棉签刮除一些滤器上面的细胞。然后整个滤器用甲苯胺蓝染色且然后在光学显微镜下观察。从分离的亚群定量骨结节的数量通过基于滚动分离得到的亚群的分化潜能被定量并与通过基于P-选择蛋白配体密度的FACS得到的亚群比较。对于FACS分离，使用具有Fc区域的P-选择蛋白。用BDFACSCalibur基于P-选择蛋白配体密度分离MSPC的3至4个亚群。用克隆形成单位造骨细胞(CFU-O)检测法(Karpetal.2005)定量骨祖细胞的数量。为了刺激分化成成骨细胞，含有α-MEM和FBS的培养基补充有10_8M地塞米松(DEX)，SOyg/ml抗坏血酸(AA)，和5mMβ甘油磷酸酯/盐(PgP)以及抗生素和两性霉素B。尽管它与特异性的糖皮质激素受体相互作用，DEX被证明可刺激来自许多组织的祖细胞的成骨分化。AA有助于胶原组装且βgP有助于胶原的矿物质化。每2至3天更换培养基且通过光学显微镜法和电子显微镜法观察到矿化区。培养基用或不用成骨补充剂处理以分别评估对比引导分化和自发分化成成骨细胞。为了检测克隆形成单位纤维原细胞(CFU-F)的数量(一种对MSPC的功能检测)，如Castro-Malaspina等人1980.("Characterizationofhμmanbonemarrowfibroblastcolony-formingcells(CFU-F)andtheirprogeny."Blood.56(2):289_301，其全部内容整体通过引用结合于此)所述培养细胞。一种阳性CFU-F克隆被鉴定为含有多于50个细胞的粘附克隆，它是α-萘基乙酸酯酯酶阴性的和苏木精&曙红阳性的(Baksh，D.etal.2003)0对于克隆形成潜力的CFU-F检测提供了一种对每个部分中MSPC的数量的粗略估计。除了CFU-O分析，CFU-F提供了每个部分中关于MSPC的潜力的恰当的数据。实施例8-10分离和检测活化的中性粒细胞的系统今年，全世界成千上万的婴儿可能会患败血症，这是身体对感染的炎症应答的结果，这将导致器官衰竭和死亡。对于未治疗的婴儿死亡率可以高达50%，其中约一半的败血症相关的死亡发生在早产的婴儿中。大多数败血症检测系统依赖于某些因子的血浆水平的确定或需要中心实验室的血液培养，或依赖于非特异性的临床症状。血培养阴性的结果一般需要5天，这通常太晚了以至于不能影响治疗决定。一种即时(point-of-care)快速检测败血病的简单的方法使得能够按时施用所需的医疗治疗，大大降低了婴儿的死亡率。最近的研究表明⑶64在中性粒细胞上的表达是一种新生儿败血病的高度特异性生物标记物，它不被症状例如发烧或化疗显著影响(Bhandari，V.etal.2008."HematologicprofileofsepsisinneonatesneutrophilCD64asadiagnosticmarker."121(1):129-134andNg,P.2002."NeutrophilCD64expressionasensitivediagnosticmarkerforlate-onsetnosocomialinfectioninverylowbirthweightinfants.PediatricResearch.51(3):296-3_3.)。尽管酶联免疫吸附测试(ELISA)和流式细胞仪技术对于检测中性粒细胞上的CD64水平是有用的，这些技术需要大量的样品处理和合适的储存条件，且一般不适用于即时的诊断。可以利用用受体不对称排列(如本文所述)引导滚动细胞的轨道的本发明的方法来分离和检测表达活化的⑶64的中性粒细胞，以快速无标记地诊断败血症。例如，具有如图17A中所示的设计的细胞滚动设备可以用于从其它细胞中分离和检测活化的CD64+中性粒细胞。我们也开发了用于共价固定选择蛋白和例如CD64这样的抗体的技术，它允许对选择蛋白的表面密度和方向进行排列和控制，并延长保存期限。与物理吸附比较，该方法可以用于增加对sLex配体结合微球和活的中性粒细胞的滚动应答的控制。本实施例提供的基层直接针对的目标是基于细胞滚动开发一种简单、独立的设备用于在几分钟的时间尺度下，快速分离和检测表达CD64的中性粒细胞，而无需任何处理步骤。不期望被任何特定的理论束缚，滚动细胞的性质似乎依赖于细胞大小、受体表达、和细胞变形能力。因而，再一次不希望被任何特定的理论束缚，可以假设全血中表达CD64的活化的中性粒细胞能够与其他的细胞类型分开。下面的实施例是希望证明活化的中性粒细胞与未活化的中性粒细胞以高度特异性分离。然后这些方法可以用于从全血中有效地分离CD64中性粒细胞。实施例8:P-选择蛋白和抗CD64抗体共同固定的基层的开发在本实施例中，开发用于检测活化的中性粒细胞的基层。这样的基层包括细胞粘附分子(在本实施例中，P-选择蛋白)和活化的中性粒细胞表达的作为标记物的抗体(在本实施例中，⑶64)的混合物。涂覆表面将P-选择蛋白和抗CD64抗体涂覆于表面上，使采用微流体成形(microfIuidicpatterning)在涂覆区域和未涂覆区域之间产生边缘(图18)。在本技术中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的微流体通道可逆地连接载玻片，且想要的受体溶液流过微流体通道用于固定。用SU-8主模(mastermold)和软光刻技术(Duffy，D.C.etal."Rapidprototypingofmicrofluidicsystemsinpoly(dimethylsiloxane)."AnalyticalChemistry.70(23)4974-4984，其全部内容整体通过引用结合于此)制备微流体通道。约50μm厚的SU_8光致抗蚀剂画出50μm宽的线，这在4英寸的硅晶片上定义了微通道。处理后，在约150°C烘烤模子15分钟以使SU-8的边缘平滑。然后将SU-8模子置于具有几滴十三烷氟_1，1，2，2-四氢辛基-1-三氯硅烷(UnitedChemicalTechnologies,Bristol，PA)的干燥器中以帮助以后除去PDMS。单体和固化剂以101的比率混合，倒入模子，脱气，在90°C下固化30分钟，然后从模子中去除。钻出进口和出口孔，将PDMS微通道置于玻璃基层上，形成封闭的微通道，用注射泵可以使溶液流过它。我们已经证明通过物理吸附在玻璃上用微流体产生P-选择蛋白边缘(图18)。为了更好地控制P-选择蛋白和抗CD64mAb的表面密度，我们正在进一步开发这种用于两种受体的共价共同固定(co-immobilization)的技术。固定方案使用环氧树脂化学物在玻璃基层上共价固定受体。从Arrayltlnc.得到环氧树脂官能化载玻片并直接用于共价固定，无需进一步处理。将PDMS微流体成分置于环氧树脂载玻片上，且在PBS缓冲液中的P-选择蛋白和/或抗⑶64mAb溶液流过微流体通道。固定后，剥除PDMS成分并将全部表面用5mg/mLBSA封闭1小时。共同固定的P-选择蛋白和抗CD64mAb的密度控制P-选择蛋白和抗CD64mAb的表面密度的控制对于开发一种最优的细胞分离设备可能是重要的。为了测试P-选择蛋白和抗CD64mAb的不同密度，在微流体成形期间它们在溶液中的浓度变化。初始的实验使用11、101、和201不同比率的P-选择蛋白抗CD64mAb浓度(其中P-选择蛋白浓度保持在约5μg/mL)。在相同的P-选择蛋白浓度下通过改变两种受体的固定时间(约5分钟和约1小时)改变总密度，以在三个比率下得到低和高表面密度。排列受体后，表面用5mg/mLBSA封闭1小时。用荧光测量定性地表征表面并用如下描述的放射性标记技术定量地表征其P-选择蛋白和抗CD64mAb的表面密度。P-选择蛋白的荧光特征从Glycotech得到生物素化的唾液酸化Lewis(χ)(sLex)并与Alexa488链菌素(Invitrogen，Inc.)以摩尔比11在链菌素浓度lmg/mL的PBS中孵育。sLex是一种连接到P-选择蛋白的糖，并用于模拟细胞滚动的微球的表面涂覆(Hong,S.etal.2007.“CovalentimmobilizationofP-selectinenhancescellrolling."Langmuir.23(24):12261_12268，其全部内容通过引用结合于此)。对于抗⑶64mAb固定的特征，从R&DSystems得到由Fcγ受体的细胞外结构域构成的重组人Fcγ受体I(CD64)，并使用蛋白标记试剂盒(Invitrogen，Inc)用Alexa647标记。用10μg/mL链菌素-sLex结合物的溶液和10μg/mLFcγ受体在4°C孵育表面过夜。孵育后，用IXPBS冲洗载玻片10分钟两次并在装配有用于成像的Andor885相机的NikonTE2000-U倒置落射荧光显微镜下成像。在相同的情况下，用Alexa488滤光片和Alexa647滤光片得到荧光图像，并定量它们的强度以证实对P-选择蛋白和抗CD64mAb的固定的控制。使用碘(125I)放射性标记的位点密度测量暴露于基层之前通过碘化(125I)抗CD64抗体或P-选择蛋白，放射性测量连接基层的配体的位点密度。用I0D0-GEN碘化试剂盒(PierCenet，IL)按照厂商的操作规程进行配体的放射性碘化。用蛋白A珠体(Piercenet，IL)在碘化之前纯化抗体，然后用涂覆iodogen的试管碘化(一般地每100μg抗体I0D0-GEN试剂的比率为10μg或更少)。为了防止配体的氧化，首先将500μCi的无载体Na125I加入I0D0-GEN试管，并在搅拌下孵育10至15分钟，随后加入配体溶液(100μg纯化的抗体样品溶于100μLPBS中)。从反应试管中取出样品，通过加入酪氨酸类似分子例如4-羟苯基丙酸或4-羟苯基乙酸(约50μL10mg/mL)(它结合活性的放射性碘)来终止样品的碘化。然后，纯化放射性碘化的配体部分并通过流过凝胶过滤柱(Pierce公司以试剂盒形式提供)与碘酪氨酸和未标记的配体分开。放射性碘化的配体在4°C保存在缓冲液中，每次分析都使用新鲜的以使放射活性的损失最小化。用Y计数仪以μCi/mmol为单位测量每单位质量标记的配体的放射性(比特异性放射性)。对于给定质量或浓度的抗体(例如用蛋白二喹啉甲酸(BCA)检测法测量)测量放射性是可能的；从抗体的摩尔重量，计算每单位质量或每个抗体的放射活性的量是可能的。为了测定固定的P-选择蛋白或抗CD64的位点密度，如上述共价固定125I-标记的配体。对于每个表面，分别分析P-选择蛋白和抗⑶64mAb位点密度。然后用PBS、1.5mMCa2\0.1%TritonX-100清洗表面3次。用0.IMNaOH去除结合的配体，并用γ计数仪测量放射性。实施例9在共同固定的基层上中性粒细胞的表征在该实施例中，研究边缘(由涂覆P-选择蛋白和抗⑶64mAb的区域产生)对中性粒细胞相对于流体流动方向的滚动方向的影响。本研究的一个目的是通过改变P-选择蛋白和抗CD64mAb的表面密度和边缘角度使排列引导活化的中性粒细胞的轨道与未活化的中性粒细胞相比的能力最大化。该研究有助于细胞分离设备的设计并有助于测定对中性粒细胞活化的分离技术的相对灵敏度。在标准的商购流动室中(GlycotechInc.)，用具有P_选择蛋白和抗CD64mAb共同固定排列的载玻片(基层)进行滚动实验。从AllCellsInc.得到的中性粒细胞在pH7.4下保存在含有0.5%人血清白蛋白、2mMCa2+和IOmMHEPES的无菌Hanks平衡盐溶液中直到如前述(Hongetal.2007)进行流动实验。为了活化中性粒细胞，HBSS中5XIO6细胞/mL在37°C用2nMTNF-α(预先溶于含有4mg/mlBSA的PBS中)孵育30分钟。中性粒细胞以剪应力约ldyn/cm2流过载玻片，这在生理学剪应力的范围内。与我们现在的研究一样，用NikonTE2000U显微镜得到图像并用Matlab分析。在活化的中性粒细胞上CD64表达的位点密度的定量为了在初级人中性粒细胞表面上测定CD64位点密度，用具有特异性抗体连接能力(ABC)的微珠(QuantymSimplyCellularkit；Sigma-AIdrich)进行流式细胞术(图19)。当微珠用特异性抗体标记时，它们可以作为一系列标准以ABC单位(每个细胞或微珠连接的抗体数)校正流式细胞仪的荧光等级。QuantymSimplyCellular试剂盒是一种4个高度一致的已知抗体结合能力的微珠群的混合物。在与细胞相同的条件下，用与实验样品等量的测试抗体标记微珠。使用对应于4个微珠群的4个峰的荧光强度的中值构建校准曲线。4种IgG标记的珠体(具有不同的密度)的每一种约500μL加入50μL细胞培养基并漩涡振荡。约10μg/mL抗生物素FITC抗体(抗⑶64，Abcam，ab34224)与每个标记的珠体样品或与细胞悬浮液在黑暗下孵育30分钟。加入约2mL的细胞悬浮液并在2500Xg下离心5分钟。样品冲洗2次(在2500Xg下离心5分钟)，且然后置于500μL与待分析的细胞相同的溶液。用流式细胞仪分析微球和细胞。使用每秒钟约100至200个事件(event)的流速，其中每个珠群收集约1000个事件。未染色的空白珠体用作阴性对照。使用前向散射(forwardscatter)相对侧向散射(sidescatter)的散点图，制作单群微球周围的活门，并在相应的荧光通道内测定5个微球群中每一个的峰(中值)柱图通道，用于列入QuickCal表格中(可以从mm.bangslabs.com得到软件)。使用未染色的细胞作为阴性对照并在与珠体标准相同的仪器设置下运行。从染色细胞样品的ABC值减去未染色细胞样品的ABC值。使用QuickCal生成校准曲线，测定仪器的检测阈值，并定量未知样品的ABC值。为了建立校准曲线，对4个结合抗体的微球中的每一个用ABC(y轴)对峰通道(χ轴)绘图。对于线性荧光，数据的log-log图可以给出一个45°直线。为了测定ABC检测阈，完成ABC校准过程并绘制校准曲线后，记录参考空白的峰(中值)通道(在一些实验中使用未染色的细胞样品作为参考空白)。然后用校准曲线确定与参考空白(或未染色细胞)的荧光相关的ABC值。这是在这些仪器设置下，该仪器的ABC检测阈值。检测阈值是高于仪器噪音可检测的ABC单位的最低值。对于样品的ABC定量，如上述完成ABC校准程序并绘制校准曲线后，用流式细胞仪测定未知的细胞样品(使用与ABC校准完全相同的仪器设置)。测定每个群的样品的峰(中值或几何平均值)通道值且该校准曲线用于测定相当于每一个样品峰通道的ABC值。从染色细胞样品的ABC值减去未染色细胞样品的ABC值。通过检测40X的悬浮液中10个细胞的直径测定细胞区域并用于计算CD64位点密度。确定P-选择蛋白和抗⑶64mAb的最佳表面密度首先表征活化和未活化的中性粒细胞的滚动，在含有共同固定P-选择蛋白和抗CD64mAb而没有任何成角度边缘的平面上使它们滚动行为的差异最大化。用注射泵以剪切率约ldyn/cm2，将密度约5XIO4细胞/mL的细胞悬浮液流过流动室中涂覆受体的基层。对于这项研究，因为目的是分析无边缘影响的滚动行为，因而未使用含有涂覆区域和未涂覆区域之间的边缘的表面。分别研究活化和未活化的中性粒细胞的细胞滚动，并用Matlab分析滚动细胞数、粘附细胞数、和滚动速率。不希望被任何特别的理论束缚，可以预测活化和未活化细胞之间滚动行为上的差异可能随抗CD64mAb表面密度的增加而增加，抗CD64mAb表面密度的增加影响滚动速率和与表面相互作用的细胞的数量。然而，在更高的抗CD64mAb表面密度下，静态粘附细胞的数量也可以增加。从未活化的中性粒细胞分离活化的中性粒细胞，中间值可能是最佳的。因而定量滚动细胞的数量和速率以及对于P-选择蛋白和抗CD64mAb不同表面密度的静态粘附细胞的数量(如实施例8中所述)。该研究应该确定使活化和未活化的细胞之间滚动速率差异最大化，同时使静态粘附细胞的数量最小化的P-选择蛋白和抗CD64mAb的密度的表面制备。测定使活化和未活化的中性粒细胞的轨道之间的差异最大化的边缘角度确定P-选择蛋白和抗⑶64mAb表面密度后，确定最佳边缘角度(Cis)，使活化和未活化的中性粒细胞的分离最大化。使用包括由蛋白条带的宽度(w)和相对于流动方向的角度(αs)(图5)定义的选择蛋白/mAb的条带的设计。w固定在约50μm并测定使活化和未活化的中性粒细胞的行进方向之间差异最大化的边缘角度(as)。为了最接近地匹配最终设备中的条件，如提出的设备设计中(描述于实施例10中)，用具有通道高度15μm的微流体流动室代替商购的流动室，用于该系列实验。在α3范围为5°、10°、20°、30°、40°、和50°的不同值的排列上得到活化和未活化的中性粒细胞滚动的轨道。进行细胞轨径的Matlab分析以测定(a)当它们遇到边缘时，继续在自由流中的滚动细胞的比率，(b)开始沿边缘移动的滚动细胞的比率，(c)离开前，沿边缘移动期间每个细胞行进的路径，和(d)每个细胞的滚动速率。通过对我们目前正在使用的Matlab程序进行很小的修正，可以容易地提取这些数据。由于P-选择蛋白和抗CD64mAb的排列，垂直于滚动细胞经历的流动方向的净平均偏转按照平均路径长度乘以Sin(Cis)计算。确定使活化和未活化的中性粒细胞的滚动之间的差异最大化的边缘角度(as)。为了证实偏转上的差异实际上是由于⑶64，只用P-选择蛋白进行对照实验。如果活化和未活化的中性粒细胞的滚动行为在P-选择蛋白涂覆的表面上类似，该差异可能是由于在活化的中性粒细胞上CD64的表达。而且，定量粘附到仅用抗-CD64mAb涂覆的表面上的未活化和活化的中性粒细胞的数量。确定活化的中性粒细胞改变的滚动行为实际上是由于⑶64表达，这是可以预期的。实施例10从未活化的中性粒细胞中区分CD64+活化的中性粒细胞的微流体设备本实施例旨在提供可以区别活化和未活化中性粒细胞的设备。确定使活化的和未活化的中性粒细胞的轨道之间的差异最大化的受体密度和排列后，制造区别两种细胞状态的微流体设备。中性细胞CD64表达的研究表明中性粒细胞CD64的表达具有单高斯分布；而且，在败血症期间，全分布位移时CD64表达增加数倍，其系数为10或更多(Davis，B.H.etal.2006."NeutrophilCD64isanimprovedindicatorofinfectionofsepsisinemergencydepartmentpatients."ArchivesofPathology&LaboratoryMedicine.130(5):654_661.)。因而，区别CD64+或CD64-中性粒细胞的设备对于检测败血症症状应该是有用的。为了用滚动分离细胞，对商购的流动室的两种主要的修饰应该是有利的。一般用于细胞滚动研究(Hongetal.2007)的商购流动室具有范围为约125μm或更大的高度，这造成大多数细胞仅仅流过该室从来没有碰到受体涂覆的表面或边缘。这样的流动室仅具有一个进口和一个出口，这不用于分离细胞。在本实施例考虑的设备中，通道的高度降低到约15μπι以促进细胞和表面之间的相互作用。而且，为了分离细胞，引入两个进口(细胞和缓冲液)和两个出口。减小流动室的尺寸可能不利地影响设备的通量。另一方面，血液中中性粒细胞的高密度需要非常少量样品体积的分析，且因而可能避免通量的问题。在其中需要更高的通量的其他应用中，可以制造这样的设备以同时平行操作。实际上，在单一设备中制造数千个整合的室的技术(Thorsen，Τ.etal.2002."Microfluidiclarge-scaleintegration.”Science.298(5593)，580-584，其内容全部通过引用结合于此)已经被商业化(Fluidigm，Inc.)并在全世界的几个学院的实验室中常规地使用。设备设计该设备包括一个细胞悬浮液的进口，另一个缓冲液的进口，一个分离流动室，和两个出口(图20)。用PDMS(聚二甲基硅氧烷)(Sylgard184，DowCorning)用标准的微成型方法在SU-8上(Microchem,Inc.的光固环氧树脂)制造该设备(Duffyetal.1998)。如果必要，用载玻片的支撑柱或硬支撑防止微通道坍塌。用微流体模式将P-选择蛋白和抗CD64mAb分别固定在载玻片上。用真空歧管装配该设备以保持PDMS成分与具有受体的玻璃基层相对。实施例9的结果用于指导本设备的设计，例如在几何学、受体密度和边缘角度方面。细胞悬浮液进口宽度保持在约20μm，因为增加这个宽度增加了分离距离，因而增加了细胞流经该设备需要的时间。可以预见对于10°量级的偏转角度，假定1至10分钟范围的细胞流经时间，可能需要具有1至IOmm量级宽度的流动室用于分离。对于约dyn/cm2的生理剪应力，在约IyL/分钟的量级，细胞悬浮液进口流速很慢。然而，血液中具有非常高密度的中性粒细胞，少量的血(约1至IOyL)应该足以用于分离细胞的收集和定量。因而，可以使用单一的设备在几分钟的时间尺度上，分离和定量CD64+中性粒细胞。使用长分离室，在相同的流动和表面设计条件下，独立地测定⑶64+和⑶64_中性粒细胞沿分离通道在不同位置细胞流量的横向分布。该信息将易于设计设备出口，使得⑶64+中性粒细胞被选择性地转到出口Α，而⑶64_和未滚动的细胞流入出口B(图20)。细胞分离约10μL中性粒细胞悬浮液以5XIO4细胞/mL的密度(血液中典型的生理密度)并且缓冲液以剪应力约ldyn/cm2流入设备。收集每个出口中分离细胞的部分并定量每个出口中细胞的相对分布(图20)。用吸液管测量收集的体积并加入96孔板中。细胞可以留在孔的底部并在显微镜下手动计数。对于每个分离实验，最后的输出(识)是出口A中细胞数量(nA)与出口B中细胞数量(nB)的相对比率对活化的中性粒细胞(模拟败血病情况)和未活化的中性粒细胞(正常条件下)进行分开的实验。活化和未活化的中性粒细胞之间相对分布(劝上的显著差异表明将未活化的中性粒细胞与活化的中性粒细胞成功地识别。基于这些初步的结果建立炉的客观标准，从而以截止率@区别未活化和活化的细胞。如果炉<PC，则对于存在⑶64+中性粒细胞结果是FALSE，否则是TRUE。然后进行一些分离实验(对于活化和未活化的中性粒细胞各自>10)，用这些客观标准定量该技术的特异性和灵敏度。为了检测⑶64位点密度对分离效率的影响，我们用约0.5nM、2nM、或5nMTNF-α处理初级人中性粒细胞，用实施例9中描述的珠体法确定它们的位点密度，并测定本文中所述的分离效率。该研究预期得到针对中性粒细胞上CD64表达的各种水平的设备灵敏度。实施例11开发ΗΤ29细胞沿边缘选择性滚动的表面在该实施例中，开发用于从白细胞中分离癌细胞的表面。癌细胞的这种细胞滚动介导分离在诊断应用中会是有用的。ΗΤ29是一种与E-选择蛋白相互作用的确定的细胞系并作为转移的循环肿瘤细胞模型使用。HL60细胞是一种骨髓细胞系，其用作白细胞滚动的模型。该实施例旨在证明使用本发明基于细胞滚动的分离系统可以从HL60细胞中选择性分离ΗΤ29细胞。用共同固定E-选择蛋白和epCAMAb开发含有涂覆和未涂覆区域之间的边缘的表面使得能够通过滚动分离HT29细胞。使用共价化学物将E-选择蛋白和epCAMmAb(R&DSystems)共同固定。在玻璃基层上共价固定具有控制密度的E-选择蛋白和epCAMmAb在玻璃基层上用环氧树脂化学物共价固定受体。从ArrayItInc.得到环氧树脂官能化的载玻片并无需进一步处理直接用于共价固定。采用微流体模式将E-选择蛋白和印CAmmAb排列在表面上(Delamarcheetal.1997)。在该技术中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的微流体通道可逆地与载玻片结合，且含有E-选择蛋白和印CAMmAb合适的混合物的所需受体溶液流过微流体通道用于固定。固定后，剥除PDMS成分且全部表面用5mg/mLBSA封闭1小时。E-选择蛋白和epCAMmAb表面密度的控制对于开发一种最优的细胞分离设备可能是重要的。为了检测E-选择蛋白和epCAMmAb的不同密度，在微流体成形过程中在溶液中改变它们的浓度。初始实验使用E-选择蛋白epCAMmAb浓度的不同比率11、101、和201(其中E-选择蛋白的浓度保持在约5yg/mL)。使用如下描述的放射性标记技术对表面表征E-选择蛋白和epCAMmAb的表面密度。用碘(125I)放射性标记并使用类似于实施例8中描述的那些方法测定位点密度。HT29细胞中epCAM表达的位点密度用实施例9中所述的流式细胞仪定量。在共同固定的基层上滚动的HT29和HL60的表征研究E-选择蛋白和epCAMmAb涂覆区域和未涂覆区域之间的边缘对HT29和HL60细胞相对于流体流动方向的滚动方向的影响。本研究的一个目的是通过改变E-选择蛋白和epCAMmAb的表面密度和边缘角度，使边缘弓I导HT29细胞相对HL60细胞的轨道的能力最大化。该研究希望帮助设计用于细胞分离的设备并帮助测定对中性粒细胞活化的分离技术的相对灵敏度。在我们使用PDMS微加工开发的微流体细胞滚动设备中进行滚动实验。细胞以在生理剪应力的范围内的剪应力ldyn/cm2流过载玻片。用NikonTE2000U显微镜捕获图像并用Matlab分析。用类似于实施例9中描述的那些方法测定E-选择蛋白和印CAMmAb的最佳表面密度。测定边缘角度使HT29和HL60细胞的轨道之间的差异最大化确定E-选择蛋白和印CAMmAb表面密度后，确定使HT29和HL60细胞的分离最大化的最佳边缘角度(as)。使用包括由选择蛋白条带的宽度(W)和相对于流动方向的角度(aJ限定的选择蛋白/mAb条带的设计(图5)。选择蛋白条带的宽度固定在w=10μm(比滚动细胞的粘附区域稍微大一点)且确定使HT29(循环的肿瘤细胞)和HL60(白细胞)的行进方向之间的差异最大化的边缘角度(as)。如实施例9和10中所述，用微流体流动室得到HT29和HL60细胞的细胞滚动轨道。实施例12分离HT29和HL60细胞的微流体设备在这个实施例中，将对于HT29细胞选择性滚动的最优化表面(实施例11中开发)结合至微流体设备用于从HL60细胞中分离HT29细胞。可以改进这样的设备用于可能具有诊断应用的其他细胞分离设备。例如，可改进它们用于从血液或血制品中分离和允许检测循环的肿瘤细胞(参见实施例13)。设备设计设备包括用标准的微成型方法用PDMS制造的一个细胞悬浮液进口，另一个缓冲液进口，分离流动室，和两个出口(类似于图20中描述的设备示意图)(Duffyetal.1998)。如果必要，使用载玻片的支撑柱或硬支撑来防止微通道的坍塌。如实施例11中所述用微流体成形在载玻片上分别固定E-选择蛋白和epCAMmAb。用真空歧管装配设备以保持PDMS成分与具有受体的玻璃基层相对。实施例11的结果用于指导设备的设计，例如，几何学、受体密度和边缘角度。细胞悬浮液进口宽度保持在约20μm，因为增加该宽度会增加分离距离并因而可能增加细胞流过设备需要的时间。可以预见对于10°量级的偏转角度，假设细胞流过时间在1至10分钟的范围，可能需要具有1至IOmm量级长度的流动室用于分离。对于生理学的剪应力约lOdyn/cm2，细胞悬浮液进口流速在1μL/min的量级上。使用长分离室，在相同流动和表面排列条件下独立地测定HT29和HL60细胞沿分离通道在不同位置上细胞流量的横向分布。该信息将用于设计设备出口使得HT29细胞选择性地转移进入一个出口，而HL60细胞流进另一个出口(参见图20类似的设备示意图)。分离通量单个设备，例如能够以约1μL/min的速率分离细胞。这样的速率对于最初的开发和测试设备可能是足够的，但对于处理大的样品体积是不够的。然而，由于设备几何学的固有简单性构造多个平行操作的分离室是可能的。以所估计的IOmm2的足印(footprint)，单个设备可能平行容纳约100个室使得能够具有100μL/min的通量。(在更大的设备中该通过速率可能放大到几mL/min)。可以用多层PDMS制造这些设备并连接到具有受体排列的相同的基层。细胞分离将含有混有HT29细胞的密度为IO5细胞/mL(血液中典型的生理白细胞密度)的HL60细胞的细胞悬浮液以剪应力ldyn/cm2流进设备。HT29细胞用钙黄绿素染色用于随后分析。HT29细胞的浓度从1到IO3细胞/mL变化以跨过临床相关浓度(Nagrath，S.etal.2007."Isolationofrarecirculatingtμmorcellsincancerpatientsbymicrochiptechnology.”Nature.450(7173):1235_U10，其全部内容整体通过引用结合于此)的范围。收集各出口中分离的细胞的部分并用流式细胞仪对各出口中细胞的相对分布定量。以分离的样品中HT29细胞的比率定量分离过程的选择性。收率定量为与样品中HT29细胞的总数相比分离的HT29细胞的比率。选择性和产率定量为细胞悬浮液中HT29掺入浓度的函数。实施例13从癌症患者的全血样品分离循环的肿瘤细胞(CTC)在本实施例中，基于实施例11-12的结果开发从体液例如血液样品分离循环肿瘤细胞(CTC)的系统。得到晚期结肠癌转移的患者血液的活临床样品。该样品中CTC的预期水平很高。对全血样品用epCAM和E-选择蛋白共同固定的基层进行细胞滚动实验，以从白细胞分离CTC而无需预先标记或处理样品。用流式细胞仪分析(用BDFACSCalibur流式细胞仪)具有高CTC比率的血液样品，用印CAMmAb定量血液中CTC的密度。约100μL到ImL的相同血液样品(根据设备通量)流经设备，用与实施例12相同的表面排列和流动条件进行分罔。用流式细胞仪分析得到的部分定量从血液中分离的CTC的数量。由于与其他细胞相比它们数量少，当CTC的滚动不能直接表征时，可以使用一种重复的方法促进滚动CTC的表征。如果用实施例12中得到的表面和流速没有得到分离，边缘角度增加刚刚超过CTC可以沿受体边缘滚动的角度。如果在这些条件下在人血液样品中没有检测到CTC，则血液中掺有ΗΤ29细胞且确定其中它们可以被检测和分离的最低浓度。为了增强跟踪ΗΤ29细胞分离的能力，HT29细胞用CellTrackerGreenCMFDA(Molecularprobes)预先标记。实施例14用于细胞分离系统的其他排列除了实施例6中讨论的和图3中描述的排列，可以使用各种其他排列实现细胞分离。一些这样的排列绘于图2和图4中。例如通过使用边缘，使不期望的细胞偏转可以实现滚动细胞的“负”选择。(参见例如图4A)。在这样的细胞分离方案中，想要的细胞群不被边缘偏转并以流体流动的方向移动。不想要的细胞沿被设计成诱导不想要的细胞的细胞类型滚动的边缘滚动。可以设计这样排列使细胞分到单独的纵列中，对于某些下游分析和/或应用，它可能是有用的。(参见，例如图4B)。可选地或另外地，排列可以包括设计成在表面上某些位置中捕获细胞的元件，如图4C中描述。例如，元件可以是阻止细胞在流动方向上流动的物理结构。这样的物理元件包括微孔，它可以是表面上的凹陷，在那里细胞可以被捕获。在一些实施方式中，使用多片利于细胞固定等的粘附配体(例如抗体)以捕获细胞。排列可以包括能够使细胞在碰到边缘前滚动的通向边缘的粘附区域。(参见例如图4D)。通过使用含有与流动方向形成不同角度的至少两个边缘的排列可以实现两个细胞类型的净位移。(参见例如图2)。第一边缘可以形成一个角从而使两种类型的细胞沿着它滚动。第二边缘可以形成一个更大的角或具有不同的受体成分从而使仅有一种细胞类型(在图2中其轨道用虚线表示)可以沿该边缘滚动。图2中描述的重复模式可以被空间改变，例如通过在大的区域上逐步地改变第二边缘；这样的改变可能利于特定细胞类型的分尚。如本实施例或本文中描述的其他排列所例示的，根据应用排列可以具有大量的几何设计的任意一种且可以包括或可以不包括某些元件(例如微孔、粘附配体片等)。实施例15用于细胞分离的三维(3D)设备在这个实施例中，将提供用于细胞分离的三维(3D)设备。如本文中讨论和例示的，在本发明的二维系统中，用细胞粘附分子(例如P-选择蛋白和/或E-选择蛋白)涂覆的区域与未涂覆的区域之间的边缘利于细胞滚动。细胞沿边缘滚动且方向为与流体流动的方向成角度的特定方向。在三维表面上，可以发生类似于边缘效应的效果。在图21中绘出三维设备的示意图。通过箭头绘出指示流体流动的流线。当流动的流体碰到物体例如圆柱体(图21A)或隆起部(图21B)时，可以产生“停滞线”。在这样的3D设备中，如下所解释的，停滞线可以作为边缘起作用并利于细胞滚动。本文中定义的停滞线是邻近物体表面的零流速区域，其中表面上的流动从不同方向汇聚。沿停滞线的剪切是零，且接近表面的流速定义了穿过停滞线的平面。在该平面中，流速必须相对停滞线形成除了90度以外的角度。在垂直柱的情况下，该角度是90度。在本发明考虑的3D设备中，外表面用可以诱导细胞滚动的细胞粘附分子涂覆。可以诱导流过表面的流体中的细胞在表面上滚动。表面上滚动的细胞将向停滞点滚动，且然后(在某些条件下)沿停滞线滚动且因而沿它移动。当停滞线与流体流动的方向成角度时，细胞可以在与流体流动的方向成角度的方向上滚动。在沿边缘滚动的情况下，细胞可以沿停滞线移动，只要该角度不超过最大角度αte，它的值取决于细胞分离系统的特定条件。根据考虑的表面和表面周围的流场可以绘出该停滞线。其他实施例通过考虑本文中披露的本发明的说明书或实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅仅被作为示例，本发明真正的范围由权利要求示出。权利要求一种方法，包括以下步骤提供一个至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面，其中所述表面含有至少一个在用所述有序层涂覆的区域和未用所述有序层涂覆的另一区域之间的边缘；以及使细胞群以与所述至少一个边缘形成非零度角αs的方向流过所述表面，其中所述细胞群中的至少一个细胞含有被所述细胞粘附分子识别的表面部分，并且其中由于与所述至少一个边缘的至少一部分相互作用，所述至少一个细胞在与流动方向成αs角的方向上滚动一段时间。2.根据权利要求1所述的方法，其中，由于沿所述至少一个边缘的至少一部分滚动，所述至少一个细胞在与所述流动方向成αs角的方向上滚动一段时间。3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从所述细胞群的剩余物中分离所述至少一个细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在距离所述边缘大于1个细胞直径的所述涂覆区域上滚动的含有所述表面部分的细胞以与所述流动方向小于αs的角度滚动。5.根据权利要求4所述的方法，其中，在距离所述边缘大于1个细胞直径的所述涂覆区域上滚动的含有所述表面部分的细胞在与所述流动方向相同的方向上滚动。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述边缘是基本上线性的。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述边缘包括曲线部分。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个边缘包括线性部分和弯曲部分。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述边缘的特征为在小于约5μπι的距离上具有相当于细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化的锐度，其中与邻近所述边缘的所述涂覆区域中的细胞粘附分子的最大密度相比，测定细胞粘附分子的密度百分数。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约3μm的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约2μm的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约Iym的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约0.5μm的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约0.2μm的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述锐度相当于在小于约0.1μm的距离上细胞粘附分子的密度从约10%到约90%的变化。16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面含有多个边缘。17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个涂覆区域限定具有两个边缘的条市ο18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述两个边缘基本上平行。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面含有多个涂覆区域。20.根据权利要求19所述的方法，其中，每个涂覆区域限定具有两个边缘的条带。21.根据权利要求20所述的方法，其中，每个条带的两个边缘基本上平行。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述条带基本上彼此平行。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述条带通过邻近条带之间具有基本上固定的距离Wg的间隙彼此分开，并且所述条带都具有基本上相同的宽度ws。24.根据权利要求23所述的方法，其中，Ws在约0.01μm至约IOmm的范围内。25.根据权利要求24所述的方法，其中，Ws小于约100μm。26.根据权利要求25所述的方法，其中，Ws小于约75μm。27.根据权利要求26所述的方法，其中，Ws小于约50μm。28.根据权利要求24所述的方法，其中，Ws大于约0.1μm。29.根据权利要求28所述的方法，其中，ws大于约1μm。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述至少一个细胞具有平均直径d且其中Ws<3d。31.根据权利要求30所述的方法，其中，Ws<2d。32.根据权利要求31所述的方法，其中，Ws<d。33.根据权利要求23所述的方法，其中，Wg在约0.2μm至约IOmm的范围内。34.根据权利要求33所述的方法，其中，Wg小于约100μm。35.根据权利要求34所述的方法，其中，Wg小于约75μm。36.根据权利要求35所述的方法，其中，Wg小于约50μm。37.根据权利要求36所述的方法，其中，wg大于约1μm。38.根据权利要求37所述的方法，其中，Wg大于约5μm39.根据权利要求38所述的方法，其中，wg大于约10μm40.根据权利要求39所述的方法，其中，Wg约等于ws041.根据权利要求40所述的方法，其中，Wg大于ws042.根据权利要求41所述的方法，其中，Wg小于ws043.根据权利要求42所述的方法，其中，所述至少一个细胞沿具有接触半径r接触的边缘滚动，且其中Wg>r接触。44.根据权利要求43所述的方法，其中，Wg<1.5·!·接触。45.根据权利要求44所述的方法，其中，Wg<1.2·!·接触。46.根据权利要求45所述的方法，其中，Wg<1.1·r接触。47.根据权利要求20所述的方法，其中，所述条带彼此不平行。48.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一个涂覆区域限定了一个形状，所述形状选自由正方形、矩形、三角形、多边形、椭圆形、圆形、弧形、波浪形、和它们的组合组成的组。49.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括至少一个具有共同特征的细胞亚群，并且在流动的步骤中，由于与所述至少一个边缘的至少一部分相互作用，所述亚群中至少一个细胞沿与所述流动方向成αs角的方向上滚动一段时间。50.根据权利要求49所述的方法，其中，由于沿所述边缘的至少一部分滚动，来自亚群的基本上所有的细胞沿与所述流动方向成αs角的方向滚动一段时间。51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都含有被所述细胞粘附分子识别的表面部分。52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述表面部分选自由P-选择蛋白配体、E-选择蛋白配体、L-选择蛋白配体、和它们的组合组成的组。53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述表面部分选自由P-选择蛋白配体-1(PSGL-I)、糖基化依赖的细胞粘附分子-1(GlyCAM-I)、⑶15、⑶34、⑶44、E-选择蛋白配体-1(ESL-I)、和它们的组合组成的组。54.根据权利要求51所述的方法，其中，所述表面部分选自由VLA-4、gp200、和它们的组合组成的组。55.根据权利要求51所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是干细胞。56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述亚群中的细胞是干细胞，所述干细胞选自由间充质干细胞、造血干细胞、和胚胎干细胞组成的组。57.根据权利要求51所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是癌细胞。58.根据权利要求51所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是祖细胞。59.根据权利要求51所述的方法，其中，所述亚群中的细胞是选自由红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、白细胞、和它们的组合组成的组中的所有细胞类型。60.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞粘附分子非共价连接到所述表面。61.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞粘附分子共价连接到所述表面。62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述细胞粘附分子通过接头部分共价连接到所述表面63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述接头部分含有聚乙二醇(PEG)。64.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞粘附分子选自由选择蛋白、整联蛋白、钙粘素、免疫球蛋白细胞粘附分子、和它们的组合组成的组。65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述细胞粘附分子选自由E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、和它们的组合组成的组。66.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞粘附分子选自由适体、碳水化合物、和肽组成的组。67.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞粘附分子包括一种或多种细胞外基质细胞粘附分子。68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述细胞外基质细胞粘附分子选自由玻连蛋白、纤连蛋白、和层粘连蛋白组成的组。69.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有序层含有不同种类的细胞粘附分子的组I=IO70.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有序层的细胞粘附分子进一步包括抗体。71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述抗体连接到所述表面部分上。72.根据权利要求70所述的方法，其中，所述有序层以细胞粘附分子与抗体在1001至1100范围内的摩尔比含有细胞粘附分子和抗体。73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述有序层以细胞粘附分子与抗体在201至11范围内的摩尔比含有细胞粘附分子和抗体。74.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有序层的细胞粘附分子进一步包括一种或多种细胞修饰配体。75.根据权利要求74所述的方法，其中，所述一种或多种细胞修饰配体非共价连接到所述有序层。76.根据权利要求74所述的方法，其中，所述细胞群包括至少一个具有共同特征的细胞亚群，并且所述细胞修饰配体能够改变所述细胞亚群的表型。77.根据权利要求76所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是干细胞。78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述亚群中的细胞是干细胞，所述干细胞选自由间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、和它们的组合组成的组。79.根据权利要求77所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是癌细胞。80.根据权利要求77所述的方法，其中，所述亚群中的细胞都是祖细胞。81.根据权利要求77所述的方法，其中，所述亚群中的细胞是选自由红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、白细胞、和它们的组合组成的组中的所有细胞类型。82.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述流动步骤中，所述细胞群沿与所述边缘形成至少约0.5度的角度αs的方向流动。83.根据权利要求82所述的方法，其中，03至少是约1度。84.根据权利要求83所述的方法，其中，α3至少是约2度。85.根据权利要求84所述的方法，其中，α3至少是约3度。86.根据权利要求85所述的方法，其中，α3至少是约4度。87.根据权利要求86所述的方法，其中，α3至少是约5度。88.根据权利要求87所述的方法，其中，α3至少是约6度。89.根据权利要求88所述的方法，其中，α3至少是约7度。90.根据权利要求89所述的方法，其中，α3至少是约8度。91.根据权利要求82所述的方法，其中，Cis小于约70度。92.根据权利要求91所述的方法，其中，Cis小于约65度。93.根据权利要求92所述的方法，其中，Cis小于约60度。94.根据权利要求93所述的方法，其中，Cis小于约55度。95.根据权利要求94所述的方法，其中，Cis小于约50度。96.根据权利要求95所述的方法，其中，Cis小于约45度。97.根据权利要求96所述的方法，其中，Cis小于约40度。98.根据权利要求97所述的方法，其中，Cis小于约35度。99.根据权利要求98所述的方法，其中，Cis小于约30度。100.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞沿与流动方向成α向上以平均速度至少约0.1μm/s滚动。101.根据权利要求100所述的方法，其中，所述至少一个细胞沿与流动方向成方向上以平均速度至少约0.5μm/s滚动。102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述至少一个细胞沿与流动方向成方向上以平均速度至少约0.8μm/s滚动。103.根据权利要求102所述的方法，其中，所述至少一个细胞沿与流动方向成方向上以平均速度至少约ι.ομm/s滚动104.根据权利要求1所述的方法，其中，流过所述表面的细胞上的剪应力在约·0.05dyn/cm2至约50dyn/cm2的范围内。105.根据权利要求104所述的方法，其中，流过所述表面的细胞上的所述剪应力在约0.2dyn/cm2至约5dyn/cm2的范围内。106.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个细胞与表面区域接触，具有的细胞接触半径(r接触)为至少约0.25μm。107.根据权利要求106所述的方法，其中，r-纟至少是约1μm。108.根据权利要求107所述的方法，其中！·■纟至少是约？口!!!。109.根据权利要求108所述的方法，其中！·■4至少是约3口!11。110.根据权利要求109所述的方法，其中至少是约4μm。111.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在所述流动步骤之前，用改变细胞变形能力的试剂处理所述细胞群的步骤。112.根据权利要求111所述的方法，其中，所述改变细胞变形能力的试剂选自由细胞松弛素、N-乙基马来酰亚胺、对-氯汞苯、长春碱、和它们的组合组成的组。113.根据权利要求49所述的方法，进一步包括收集所述细胞亚群。114.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括具有共同特征的至少一个细胞亚群，并且在所述流动步骤中，来自所述亚群的大多数细胞不沿所述边缘滚动。115.根据权利要求114所述的方法，进一步包括收集所述细胞亚群。116.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面进一步包括在所述表面上捕获所述至少一个细胞的元件。117.根据权利要求116所述的方法，其中，所述元件是阻止细胞沿流动方向上流动的物理结构。118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述元件是微孔。119.根据权利要求116所述的方法，其中，所述元件是粘性片。120.根据权利要求119所述的方法，其中，所述粘性片含有抗体。121.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面进一步含有至少一个邻近至少一个涂覆区域的粘性片。122.根据权利要求121所述的方法，其中，所述至少一个粘性片相对于所述流动方向位于所述涂覆区域的上游。123.根据权利要求16所述的方法，其中，所述至少两个边缘与所述流体流动的方向形成不同的角度。124.—种设备，包括分离流动室，其中，所述分离流动室包括至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的表面，并且所述表面含有至少一个在用所述有序层涂覆的区域和未用所述有序层涂覆的另一个区域之间的边缘；使细胞流入所述分离流动室的进口；和使细胞流出所述分离流动室的出口；其中，当细胞流过所述进口到达所述出口时，除非它们与所述至少一个边缘相互作用，否则它们以与所述至少一个边缘的方向成αs的角度流动。125.根据权利要求124所述的设备，进一步包括至少一个连接至所述分离流动室的另外的出口。126.根据权利要求124所述的设备，进一步包括至少一个连接至所述分离室的另外的进口。127.根据权利要求126所述的设备，其中，至少一个进口将细胞群引入所述分离流动室中，并且至少一个进口将无细胞的缓冲液引入到所述分离流动室中。128.根据权利要求124所述的设备，其中，所述分离流动室由具有约5μπι至Imm高度的壁限定。129.根据权利要求128所述的设备，其中，所述分离流动室由具有低于约100μm高度的壁限定。130.根据权利要求129所述的设备，其中，所述分离流动室由具有低于约75μm高度的壁限定。131.根据权利要求130所述的设备，其中，所述分离流动室由具有低于约50μm高度的壁限定。132.根据权利要求131所述的设备，其中，所述分离流动室由具有低于约25μm高度的壁限定。133.根据权利要求132所述的设备，其中，所述分离流动室由具有低于约15μm高度的壁限定。134.根据权利要求124所述的设备，其中，所述分离流动室是矩形。135.根据权利要求124所述的设备，其中，所述分离流动室由具有不均一高度的壁限定。136.根据权利要求135所述的设备，其中，所述分离流动室由具有逐步改变的高度的壁限定。137.根据权利要求124所述的设备，其中，流出所述出口的细胞流入另一个设备。138.根据权利要求124所述的设备，其中，流入所述进口的细胞从另一个设备流出。139.根据权利要求124所述的设备，进一步包括用于收集至少一个流过所述分离流动室的细胞亚群的通道。140.根据权利要求139所述的设备，进一步包括在所述通道一端的多孔滤器。141.根据权利要求124所述的设备，进一步包括多个用于收集流过所述分离室的细胞亚群的通道。142.根据权利要求141所述的设备，进一步包括多孔滤器，其中所述多孔滤器位于各通道之间。143.根据权利要求139所述的设备，其中，收集的细胞可以用眼睛、用低功率显微镜、用放大镜、或它们的组合可视化。144.根据权利要求143所述的设备，进一步包括放置放大镜，使得所述镜放大所述收集通道。145.根据权利要求139所述的设备，其中，通过有色流体、染料、或它们的组合促进所述通道中收集细胞的可视化。146.根据权利要求139所述的设备，其中，通过光照促进所述通道中收集细胞的可视化。147.根据权利要求124所述的设备，其中，所述表面进一步含有粘性片。148.根据权利要求124所述的设备，进一步包括控制流速的装置。149.根据权利要求148所述的设备，其中，所述控制流速的装置包括注射泵。150.根据权利要求139所述的设备，其中，无需进一步处理能够得到收集的细胞数量的评估值。151.根据权利要求150所述的设备，其中，所述设备进一步包括沿所述收集通道的标记，从而使收集细胞的柱高表示细胞体积和/或细胞数量。152.根据权利要求124所述的设备，其中，细胞在流体中流动。153.根据权利要求124所述的设备，其中，细胞由于毛细管作用流动。154.根据权利要求124所述的设备，其中，细胞在真空下流动。155.根据权利要求124所述的设备，其中，细胞至少部分由于选自由重力、电动力、离心力、和它们的组合组成的组中的力流动。156.—种方法，包括以下步骤提供至少部分用有序层的细胞粘附分子涂覆的三维表面，并且使细胞群在使产生无流动停滞线的条件下流过所述表面，其中流动方向与所述停滞线形成非零度角αs，其中所述细胞群中的至少一个细胞含有被所述细胞粘附分子识别的表面部分，并且其中所述细胞群中的至少一个细胞沿与所述流动方向成α3角的方向上滚动至少部分时间。157.根据权利要求156所述的方法，其中，所述三维表面包括圆柱体外表面的至少一部分。158.根据权利要求156所述的方法，其中，所述三维表面包括隆起部、凹槽、凸起、或它们的组合的外表面的至少一部分。全文摘要本发明提供了基于细胞在表面上沿用细胞粘附分子涂覆的区域边缘滚动的细胞分离系统。披露了涂覆区域和边缘的多种设计。文档编号C12N5/0787GK101918543SQ200880118048公开日2010年12月15日申请日期2008年9月29日优先权日2007年9月27日发明者丹尼尔·格里菲思·安德森,杰弗里·迈克尔·卡普,梅颖,洪承杓,罗伯特·S·朗格尔,罗希特·南德库马尔·卡尔尼克,苏曼·博塞申请人:麻省理工学院