专利名称：基于PCR扩增的200bpDNAladder模板p222及其制备体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程研究领域中电泳耗材DNAmarkeHDNA分子量 标准)的制备方法的革新。具体地说，本发明以一种专有的PCR模板设计，建立了一套全新 的基于PCR扩增方法的200bp DNA ladder的制备体系。
背景技术：
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量 的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳 过程中未知DNA样品的分子量。目前，DNA分子量标准多是购自生物公司；同时由于其应用 的普遍性和必要性，为了节约开支，很多实验室都自己制备常用的分子量标准。国内市场 上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出 现，其神秘的面纱正在慢慢退去。按照DNA分子量标准制备所涉及的关键技术(过程)，其 制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA 分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片 段的扩增和多片段的扩增。1.通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点(天然的或人为加入的)，采用合 适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标 准。按照被消化DNA的来源可以分为两种天然来源的特种DNA(如基因组)和人工构建的 质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA 分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最 常见的此类DNA分子是Lamda噬菌体的基因组DNAU DNA)，由其产生的DNA分子量标准有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如 pBR322DNA/AluI marker和pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker,但是所用的内切酶都是不常 用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要 的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分离 纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠杆 菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大(50升的发酵体系很容易建 立，而PCR扩增一般只能在小于500微升的体系内进行)，获得的DNA片段条带在凝胶上条 带锐利，过程重复性高。不存在PCR扩增再现性不好的缺点。但是由于DNA小片段分子量 小，电泳时条带相对于高分子量的DNA大片段非常弱，所以上述重组载体不适用于制备DNA 小片段。这是利用重组载体制备各种DNA marker体系中存在的明显缺陷。目前各种DNA 小片段的制备主要以PCR扩增的方法为主。2.通过PCR扩增制备DNA分子量标准由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由 于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如Taq DNA聚合酶，模板DNA， 反应Buffer等均可自制。由于生产效率低，浓度强度高，因而限制了其大规模的制备和应用。长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域缺少作为PCR模板用的复合重组 载体设计方案和一种用于200bp DNA ladder中片段扩增的专用载体，以及与之相应的制备 体系。利用本发明中的载体可以复合体的方式制备DNA小片段，然后通过PCR产物的酶切 得到所需的目标DNA小片段；以克服普通PCR扩增产生DNA片段生产效率低，劳动强度高等 缺陷；从而能够快速、大规模的地生产DNA分子量标准200bp ladder。
发明内容
鉴于此，我们设计和重组构建了用作PCR扩增模板p222，并建立了相应的200bp DNA ladder的制备体系，恰恰满足了上述需求；其目的在于提供了一种专门用于200bp DNA ladder制备用的PCR扩增模板p222。本发明的进一步目的在于提供一种利用上述的PCR扩增模板p222制备200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制备体系。为了实现上述目的，本发明提供的制备用模板P222是一种专门用于200bpDNA ladder制备用的PCR扩增模板，其中含有3个200bp的重组DNA片段，每个200bp片段两端 均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为E200E200E200E。本发明中200bp DNA ladder的PCR扩增模板p222的构建方法，包括如下步骤分别以Lambda噬菌体基因组DNA为模板，利用PCR的方法扩增获得如下片段 200E、E200E、E200bp，其中200E的3，末端、E200bp的5，末端，以及E200Ebp的两个末端带 有EcoRI限制向内切酶的位点，三种DNA片段经EcoRI酶切后，以一种顺序连接的方式进行 连接，然后以末端引物PFlR对连接产物进行扩增，筛选获得200-200-200bp连接产物。同 时为其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌呤核苷酸)；将上述连接产物TA克隆到 克隆载体pGEM-Teasy中，即得到设计模板p222。制备200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制备体系以p222为扩增模板，在其两端(200-200-200)序列选择合适位点作为引物位点， 扩增获得如下PCR产物200/400/600-拉00-200-200丨.-200/400/600,共九种PCR产物。经 EcoRI酶切后，所得产物均为200bp DNA ladder中的片段。PCR引物的组合可以调节目标 DNA片段之间的数量比例，从而使其具有相当的质量关系。本发明中的PCR模板载体p222是一种专门用于200bp DNA ladder片段制备用 的PCR扩增模板；通过灵活的引物位点选择，可以特异性的以复合体的形式扩增DNA片段 (200-1200bp)；所获得的PCR产物过EcoRI的酶切可以释放其中的目标DNA片段。本发明的有益效果在于设计了一种PCR扩增模板p222，其中含有3条由4个 EcoRI酶切位点分隔的200bp重组DNA片段；以此重组载体为PCR扩增模板能够以复合体 的形式高效制备200bp ladder中的DNA片段(通过EcoRI酶切)。与传统的PCR扩增方法 相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反应缓冲液、实验耗材等)、效率高(多片段 的同时扩增)、省时省力等优点；其优势还在于通过引物位点的选择可以灵活的调整制备 片段的种类及其之间的数量关系。
图1是基于PCR技术的200bp DNAladder制备用重组模板p222的图谱。具体实施实例参照附图，本发明提供的p222是一种专门用于200bp DNA ladder制备用的PCR 扩增模板；其图谱中含有3个200bp的重组DNA片段，每个200bp片段两端均有两个EcoRI 酶切位点，三条重组DNA片段的结构为E200E200E200E。其200bp DNA ladder 制备体系为以p222为PCR扩增模板，在其核心序列(200-200_200bp)两侧选择合适位点作为 引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体200/400/600- |200-200-200丨-200/400/600，共 9 种扩增复合体；每种复合体经EcoRI部分或完全酶切后，所得产物均为200bp DNA ladder中的 DNA片段。
权利要求
基于PCR扩增的200bp DNA ladder模板p222，其特征在于其图谱中含有3个200bp的重组DNA片段，每个200bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为E200E200E200E。
2.根据权利要求1所述的基于PCR扩增的200bpDNA ladder模板p222的制备体系， 其特征在于以重组载体P222为模板，在其核心序列(200-200-200bp)两侧选择合适位 点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体=200/400/600- |200-200-200|. -200/400/600,共9种复合体；每一种复合物经EcoRI酶切后，所得产物均为200bp DNA ladder中的片段。
全文摘要
基于PCR扩增的200bp DNA ladder模板p222，其图谱中含有3个200bp的重组DNA片段，每个200bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为E200E200E200E。其制备体系以重组载体p222为模板，在其核心序列(200-200-200bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体200/400/600--200/400/600，共9种复合体；经EcoRI酶切后，所得产物均为200bpDNAladder中的片段。
文档编号C12N15/11GK101880661SQ20101019781
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者叶春和, 叶春江, 谷劲松 申请人:济南大学