专利名称：一种真菌快速培养鉴定药敏试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于体外诊断技术领域，尤其是涉及一种真菌快速培养鉴定药敏试剂盒， 本发明还涉及使用该试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
真菌(fungus)原归属植物界，现代分类系统则将其单立为一界。真菌与细菌不 同，具有真正的核膜，能产生孢子，没有叶绿素，产生分枝的菌丝，细胞壁有甲壳质或纤维 素。临床上将致病性真菌分为浅部真菌和深部真菌两类，前者侵犯皮肤、毛发、指甲，对治疗 有顽固性，但对身体影响较小。后者可侵犯全身内脏，严重者可引起死亡。深部真菌是侵犯 皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌，这类真菌主要是念珠菌属和新型隐球菌属。念 珠菌属广泛存在于自然界中，大约150个种，是一种条件致病菌，临床上最常见的致病念珠 菌感染包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌和其他念珠 菌。正常机体中念珠菌的少量存在不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常 菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾 病。可引起皮肤念珠菌病；黏膜念珠菌病；内脏及中枢神经念珠菌病，可由黏膜皮肤等处 病菌播散引起，如肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症。新型隐球菌对于 人类而言为条件致病菌，本菌多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染，也可由 受损皮肤及肠道传入，当机体免疫功能下降时可向全身播散，主要侵犯中枢神经系统，发生 脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等，也可入侵骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤黏膜，引起慢性炎症和脓肿。 如隐球菌脑膜炎在使用二性霉素B之前，病死率高达90%以上。目前进行真菌检测的方法主要是培养方法，而鉴定和药敏均需要先进行分离培 养，然后再进行鉴定和药敏，而直接用临床标本进行鉴定和药敏的试剂盒却几乎没有。临床 真菌的诊断通常是先用平板培养1-3天进行纯化培养，然后通过变色平板或全自动仪器 进行鉴定，然后再通过MH平板纸片法分析其抗生素敏感情况，其前后诊断时间一般在4天 以上，对操作人员要求高，并且麻烦，费时费力，成本高，不适合临床的快速诊断治疗，容易 贻误病情。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种同时对多种真菌进行快速 有效鉴定和药敏检测的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，本发明还同时提供使用该试剂盒直 接对临床标本进行检测的方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，包括带有培养液、稀释液、矿物油和 检测板的盒体，所述培养液中含有0. 05-2%的酵母膏，0. 05-2%的磷酸二氢钾，0. 05-2% 硫酸镁，0. 1-2%的NaCl，0. 05-2%的硫酸铵，0. 001%的万古霉素，0. 01-0. 08%的氯霉素， 0. 001%的多粘菌素B，0. 005-0. 02%溴甲酚紫；所述检测板上设置有阴性参照孔，阳性检测孔，真菌鉴定孔和抗生素药敏检测孔；所述稀释液采用0. 5-1%的氯化钠溶液，所述矿物 油为液体石蜡油。所述真菌鉴定孔至少包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、 季也蒙念珠菌、新型隐球菌中一种以上的真菌鉴定孔。所述白色念珠菌鉴定孔中包被有5_40g/l的葡萄糖和100mg/l的放线菌酮；热 带念珠菌鉴定孔中包被有5-40g/l松三糖和lmg/1的氟康唑；克柔念珠菌鉴定孔中包被 有5-40g/l乳糖，20mg/l的氟康唑；光滑念珠菌鉴定孔中包被有5-50g/l海藻糖，lmg/1的 伏立康唑；季也蒙念珠菌鉴定孔中包被有5-40g/l的棉子糖；新型隐球菌鉴定孔中包被有 5-40g/l的葡萄糖和0. 013mg/l的卡泊芬净。每孔的包被量为lOOul。所述药敏检测孔至少包含有5-氟胞嘧啶、两性霉素、制霉菌素、伊曲康唑、伏立康 唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、氟康唑抗生素中三种以上的药敏检测测定孔。所述抗生素高低浓度孔中对应包被浓度分别是5_氟胞嘧啶4mg/l和32mg/l ； 两性霉素:lmg/l和2mg/l ；制霉菌素:4mg/l和8mg/l ；伊曲康唑0. 125mg/l和lmg/1 ；伏立 康唑lmg/1和2mg/l ；克霉唑:2mg/l和8mg/l ；咪康唑lmg/1和8mg/l ；酮康唑lmg/1和 8mg/l ；益康唑lmg/1和8mg/l ；氟康唑:8mg/l和32mg/l。每孔的包被量为lOOul。所述阳性检测孔包被有0. 5-5%葡萄糖；每孔的包被量为lOOul。本发明真菌快速培养鉴定药敏试剂盒的检测方法，包括下述步骤(1)取取培养液50-100ul加入检测板上的阴性参照孔中；(2)接种待检标本于培养液中搅拌混勻；(3)把含标本的培养液接种入检测板上除阴性参照孔外的所有孔中，每孔 50-100ul，然后滴加矿物油，盖上检测板盖后置36-38°C培养，24h观察结果。本发明的优点在于可同时对多种真菌进行鉴定，通过在药敏检测板上包被多种糖 或抑制剂，使不同孔利于不同真菌的生长，从而对临床最常见的白色念珠菌、热带念珠菌、 光滑念珠菌、克柔念珠菌、新型隐球菌和季也蒙念珠菌等真菌进行鉴定，给临床提供有效指 导；由于在所用的培养液中添加了包括酵母浸膏、葡萄糖、抑菌剂、高效生长因子等有效成 分，从而可以保证真菌快速生长，使真菌在24h内完成培养；通过在其中添加抗生素，可有 效抑制细菌生长，从而保证培养液具有良好的特异性；药敏检测原理是参照美国clsi标准 的微量稀释法改进而成，由于常规微量稀释法是先将纯菌落制备成一定浓度的菌液，再将 该菌液加入到事先稀释好的抗生素的浓度梯度中，通过24-48h培养后观察结果。该方法虽 然准确，但是操作步骤繁琐，培养时间长，对操作要求高，临床使用受很大限制。本发明的药 敏检测孔可以检测3种以上抗生素，包被了临床最为常见的真菌抗生素一一5-氟胞嘧啶、 两性霉素、制霉菌素、伊曲康唑、伏立康唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、氟康唑等，每种 抗生素在药敏板上都有对应的高低两个浓度检测孔，所有抗生素通过冻干或物理干燥方法 预先包被进药敏板检测孔中，矿物油滴加在培养液上，可有效防止药敏板在培养过程中液 体的蒸发，检测板盖可以有效防止外界杂物落入药敏检测孔中，从而进一步保证检测结果 的准确性。本发明的另一目的是提供利用该真菌快速培养鉴定药敏试剂盒进行检测的方法， 临床上常用的方法是先把标本进行培养，然后进行鉴定和药敏检测。本发明所述的检测方 法简单，不仅适合纯菌的检测，更可以直接用于临床标本的真菌鉴定和抗生素药敏检测，检测周期短，一次性可以同时对待检真菌进行鉴定和药敏检测，24h出结果，大大的缩短了临 床检测周期，有利于患者的早期诊断和治疗。观察结果时，可直接目测培养液液体的颜色，若阴性参照孔不变色，真菌检测孔不 变色，表示无真菌感染，结果为阴性。若阴性参照孔变色，则可能是污染，该次检测结果无 效。若阴性参照孔不变色，阳性检测孔变色，表示有真菌感染，判读余下各孔结果；鉴定相应 孔变色，表示该种真菌的感染，报该种真菌阳性结果，若鉴定孔均不变色，则无该种真菌感 染，若所有鉴定孔均不变色，说明不是鉴定孔所能鉴定的真菌感染，而是其他真菌感染。药 敏检测孔，若上下均不变色，表示该种所检测真菌对该种抗生素敏感。若上孔变色，而下孔 不变色，表示该种所检测真菌对该种抗生素中介，若上下孔均变色，表示该种所检测真菌对 该种抗生素耐药。采用本试剂盒检测，其结果只需用目测，无需借助其他设备，满足了不同 客户群的需求。
图1是本发明试剂盒的结构示意图。图2是图1中检测板的结构示意图。
具体实施例方式如图1、2所示，本发明所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，包括带有培养液1、 稀释液2、矿物油3和检测板4的盒体，所述培养液1中含有的酵母膏，0. 8%的磷酸二 氢钾，0. 1 %硫酸镁，0. 5 %的NaCl，0. 2 %的硫酸铵，0. 001 %的万古霉素，0. 04%的氯霉素， 0. 001%的多粘菌素B，0. 01%溴甲酚紫；所述检测板4上设置有阴性参照孔5，阳性检测孔 6，真菌鉴定孔7和抗生素药敏检测孔8 ；所述稀释液2采用0. 9%的氯化钠溶液，所述矿物 油3为液体石蜡油。真菌鉴定孔7包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙 念珠菌、新型隐球菌的鉴定孔。在白色念珠菌鉴定孔中包被有20g/l的葡萄糖和100mg/l的 放线菌酮；热带念珠菌鉴定孔中包被有20g/l松三糖和lmg/1的氟康唑；克柔念珠菌鉴定 孔中包被有20g/l乳糖，20mg/l的氟康唑；光滑念珠菌鉴定孔中包被有25g/l海藻糖，lmg/ 1的伏立康唑；季也蒙念珠菌鉴定孔中包被有20g/l的棉子糖；新型隐球菌鉴定孔中包被有 20g/l的葡萄糖和0. 5mg/l的卡泊芬净。每孔的包被量为lOOul。药敏检测孔8包含有5-氟胞嘧啶、两性霉素、制霉菌素、伊曲康唑、伏立康唑、克霉 唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、氟康唑十种抗生素的药敏检测孔。在抗生素高低浓度孔中对应包被浓度分别是5_氟胞嘧啶4mg/l和32mg/l ；两 性霉素lmg/1和2mg/l ；制霉菌素:4mg/l和8mg/l ；伊曲康唑0. 125mg/l和lmg/1 ；伏立 康唑lmg/1和2mg/l ；克霉唑:2mg/l和8mg/l ；咪康唑lmg/1和8mg/l ；酮康唑lmg/1和 8mg/l ；益康唑lmg/1和8mg/l ；氟康唑:8mg/l和32mg/l。每孔的包被量为lOOul。在阳性检测孔6包被有2%葡萄糖，包被量为lOOul。本发明所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒的检测方法，包括下述步骤(1)取培养液lOOul加入检测板4上的阴性参照孔5中；(2)接种待检标本于培养液1中搅拌混勻如果待检标本为阴道或宫颈分泌物时，
5需要先用稀释液2稀释，再添加lOOul于培养液1中搅拌均勻；若待检标本为其他类型，则 可将待检标本直接加于培养液1中搅拌混勻即可；(3)把含标本的培养液接种入检测板4上除阴性参照孔5外的所有孔中，每孔 lOOul，然后滴加矿物油3 —滴，盖上检测板盖后置36-38°C培养，24h观察结果。结果判读如下若阴性参照孔变色，则可能是污染，该次检测结果无效。若阴性参照孔不变色，阳性检测孔不变色，表示无真菌感染，结果为阴性。若阴性参照孔不变色，阳性检测孔变色，表示有真菌感染，判读余下各孔结果白色念珠菌孔如果变色判读为白色念珠菌阳性，不变色则报白色念珠菌阴性；热带念珠菌孔如果变色判读为热带念珠菌阳性，不变色则报热带念珠菌阴性；光滑念珠菌孔如果变色判读为光滑念珠菌阳性，不变色则报光滑念珠菌阴性；克柔念珠菌孔如果变色判读为克柔念珠菌阳性，不变色则报克柔念珠菌阴性；新型隐球菌孔如果变色判读为新型隐球菌阳性，不变色则报新型隐球菌阴性；季也蒙念珠菌孔如果变色判读为季也蒙念珠菌阳性，不变色则报季也蒙念珠菌阴 性。5-氟胞嘧啶检测孔若高低浓度孔均未变色，则报5-氟胞嘧啶敏感，若高浓度孔 不变色则报5-氟胞嘧啶中介，若高低浓度均变色，则报5-氟胞嘧啶耐药。两性霉素检测孔若高低浓度孔均未变色，则报5-氟胞嘧啶敏感，若高浓度孔不 变色则报两性霉素中介，若高低浓度均变色，则报两性霉素耐药。制霉菌素检测孔若高低浓度孔均未变色，则报制霉菌素敏感，若高浓度孔不变色 则报制霉菌素中介，若高低浓度均变色，则报制霉菌素耐药。伊曲康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报伊曲康唑敏感，若高浓度孔不变色 则报伊曲康唑中介，若高低浓度均变色，则报伊曲康唑耐药。伏立康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报伏立康唑敏感，若高浓度孔不变色 则报伏立康唑中介，若高低浓度均变色，则报伏立康唑耐药。克霉唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报克霉唑敏感，若高浓度孔不变色则报 克霉唑中介，若高低浓度均变色，则报克霉唑耐药。咪康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报咪康唑敏感，若高浓度孔不变色则报 咪康唑中介，若高低浓度均变色，则报咪康唑耐药。酮康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报酮康唑敏感，若高浓度孔不变色则报 酮康唑中介，若高低浓度均变色，则报酮康唑耐药。益康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报益康唑敏感，若高浓度孔不变色则报 益康唑中介，若高低浓度均变色，则报益康唑耐药。氟康唑检测孔若高低浓度孔均未变色，则报氟康唑敏感，若高浓度孔不变色则报 氟康唑中介，若高低浓度均变色，则报氟康唑耐药。
权利要求
一种真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，包括带有培养液(1)、稀释液(2)、矿物油(3)和检测板(4)的盒体，其特征在于所述培养液(1)中含有0.05-2％的酵母膏，0.05-2％的磷酸二氢钾，0.05-2％硫酸镁，0.1-2％的NaCl，0.05-2％的硫酸铵，0.001％的万古霉素，0.01-0.08％的氯霉素，0.001％的多粘菌素B，0.005-0.02％溴甲酚紫；所述检测板(4)上设置有阴性参照孔(5)，阳性检测孔(6)，真菌鉴定孔(7)和抗生素药敏检测孔(8)；所述稀释液采用0.5-1％的氯化钠溶液，所述矿物油为液体石蜡油。
2.根据权利要求1所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，其特征在于所述真菌鉴定 孔(7)至少包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型 隐球菌中一种以上的真菌鉴定孔。
3.根据权利要求2所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，其特征在于所述白色念珠 菌鉴定孔中包被有5-40g/l的葡萄糖和100mg/l的放线菌酮；热带念珠菌鉴定孔中包被有 5-40g/l松三糖和lmg/1的氟康唑；克柔念珠菌鉴定孔中包被有5-40g/l乳糖，20mg/l的氟 康唑；光滑念珠菌鉴定孔中包被有5-50g/l海藻糖，lmg/1的伏立康唑；季也蒙念珠菌鉴定 孔中包被有5-40g/l的棉子糖；新型隐球菌鉴定孔中包被有5-40g/l的葡萄糖和0. 013mg/ 1的卡泊芬净；每孔的包被量为IOOul。
4.根据权利要求1所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，其特征在于所述药敏检测 孔(8)至少包含有5-氟胞嘧啶、两性霉素、制霉菌素、伊曲康唑、伏立康唑、克霉唑、咪康唑、 酮康唑、益康唑、氟康唑抗生素中三种以上的药敏检测测定孔。
5.根据权利要求4所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，其特征在于所述抗生素高 低浓度孔中对应包被浓度分别是5_氟胞嘧啶4mg/l和32mg/l ；两性霉素lmg/1和2mg/ 1 ；制霉菌素:4mg/l和8mg/l ；伊曲康唑0. 125mg/l和lmg/1 ；伏立康唑:lmg/l和2mg/l ；克 霉唑:2mg/l和8mg/l ；咪康唑lmg/1和8mg/l ；酮康唑lmg/1和8mg/l ；益康唑lmg/1和 8mg/l ；氟康唑8mg/l和32mg/l ；每孔的包被量为IOOul。
6.根据权利要求1所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，其特征在于所述阳性检测 孔(6)包被有0. 5-5%葡萄糖；每孔的包被量为lOOul。
7.根据权利要求1所述的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒的检测方法，其特征在于它 包括下述步骤(1)取培养液(l)50-100ul加入检测板(4)上的阴性参照孔(5)中；(2)接种待检标本于培养液(1)中搅拌混勻；(3)把含标本的培养液接种入检测板(4)上除阴性参照孔(5)外的所有孔中，每孔 50-100ul，然后滴加矿物油(3)，盖上检测板盖后置36-38°C培养，24h观察结果。
全文摘要
本发明公开了一种同时对多种真菌进行快速有效鉴定和药敏检测的真菌快速培养鉴定药敏试剂盒，本发明还同时公开了使用该试剂盒直接对临床标本进行检测的方法，本发明的优点在于可同时对多种真菌进行鉴定，通过在药敏检测板上包被多种糖或抑制剂，使不同孔利于不同真菌的生长，从而对临床最常见的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、新型隐球菌和季也蒙念珠菌等真菌进行鉴定，给临床提供有效指导；本发明所述的检测方法简单，不仅适合纯菌的检测，更可以直接用于临床标本的真菌鉴定和抗生素药敏检测，检测周期短，一次性可以同时对待检真菌进行鉴定和药敏检测，24h出结果，大大的缩短了临床检测周期，有利于患者的早期诊断和治疗。
文档编号C12Q1/04GK101886111SQ20101019760
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者付光宇, 吴学炜, 张中洲, 杨红云, 杨静静, 王则宇, 胡泽林, 郑业焕, 闫瑞亮 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司