专利名称：用于检测弓形虫的引物、试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测弓形虫的引物、试剂
盒及方法。
背景技术：
弓形虫病是由弓形虫寄生引起的一种感染，世界各地的弓形虫感染非常普遍，美、 英的成年人中，大约16-40%曾经感染，有的调查达70%，而欧洲大陆和拉丁美洲的成年人， 50-80%有过感染，法国人高达90%。我国弓形虫感染低于国外。弓形虫可经孕妇胎盘侵入 胎儿，并可对之造成严重损害，如脑积水、小脑畸形、失明及智力发育障碍等。因此，快速可 靠的产前诊断是十分需要的。如果怀孕头3个月发生先天性感染，大约40%胎儿可能有严 重损害，出现流产、死胎或新生儿疾病，或者出生后有眼、脑或肝脏的病变或畸形，如视网膜 脉络膜炎、白内障、脑内钙化、脑积水、小头畸形、智力障碍、黄疸和肝脾肿大。怀孕末3个月 发生的感染，严重者不到3%。因此孕前检查并治疗是非常必要的，孕间的检测也不容忽视。目前已有的弓形虫检测方法有以下几种
1)直接镜检取患者血液、骨髓或脑脊液、胸腹水、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼房水、 羊水阴道分泌物等作涂片，或淋巴结、肌肉、肝、胎盘等活组织切片，作瑞氏或姬氏染色镜检 可找到滋养体或包囊，但检出阳性率不高，不够灵敏可信。2)动物接种或组织培养取待检体液或组织悬液，接种小白鼠腹腔内，可产生感 染并找到病原体，第一代接种阴性时，应盲目传代3次；或作组织(猴肾或猪肾细胞)培养以 分离、鉴定弓形虫。但此方法时间长，检出率低。3)免疫学检查检测抗体所用抗原主要有速殖子可溶性抗原(胞质抗原)和胞膜 抗原。前者的抗体出现较早(用染色试验、间接免疫荧光试验检测)、而后者的抗体出现较晚 (用间接血凝试验等检测)。同时采用多种方法检测可起互补作用而提高检出率。但由于弓 形虫在人体细胞内可长期存在，故检测抗体一般难以区别现症感染或以往感染。4) DNA检测技术国内已建立多聚酶链反应诊断本病毒，并与探针杂交、动物接种 和免疫学检查方法相比较，显示具高度特异、敏感和快速等优点。PCR检测具有高度的特异性和敏感性，可以检测出微量的虫体DNA，从而推断出虫 体存在与否，不失为一种较有效的判断母体有无虫血症的病原学诊断手段。国外近年来应 用PCR诊断免疫缺陷病人弓形虫感染取得较好的结果。但传统的PCR诊断需要用电泳检测， 如申请号为CN200710032159. 1的中国发明申请，电泳检测灵敏度一般且不适用于临床，容 易因样品污染而增加假阳性结果导致检测结果不准确。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测弓形虫的引物，利用该引物可以在基因水平上 对弓形虫迅速的进行诊断。本发明的另一个目的是提供一种利用上述的引物制备的用于检测弓形虫的试剂
3盒，该试剂盒在弓形虫的检测中具有较高的灵敏度和高效、高特异性，检测耗时少、检测结 果稳定。本发明的又一个目的是提供一种用于检测弓形虫的方法，该方法利用本发明提供 的试剂盒进行弓形虫的检测，检测耗时少、检测结果稳定。本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的
一种用于检测弓形虫的引物，其特征在于该引物为弓形虫特异性B基因，该引物的上 游引物具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列(5‘ -TCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTT-3‘);下 游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列(5' - TTTCCACCCTCCAGGAAAAGCA -3')。所 述的引物可特异性的扩增出弓形虫B基因，该引物用于检测弓形虫时，最好是以人DNA保守 序列特有基因β球蛋白(β-globin)基因作为内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序 列为 SEQ ID NO. 3 (5' - TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA -3')，下游引物核苷酸序列为 SEQ ID NO. 4(5' - GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA -3')。经实验表明，通过 PCR 反应，该内参引 物较之其它根据人DNA保守序列设计的引物能够更快速有效地识别人体DNA，可以确定模 板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。一种用于检测弓形虫的试剂盒，包括PCR反应液、所述的引物和内参引物混合液、 阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水。该试剂盒采用本发明提供的引物，是一种具有较好 灵敏度和高效、高特异性的检测弓形虫的工具。作为优选方案，所述的内参引物的上游引物具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列；下游引物具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。作为优选方案，所述的PCR反应液是包括pH 8. 4的Tris_HC140 mM, MgCl2 15 24mM,KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 m M, dNTP 0. 4mM 和终浓度 0. 06 0. 10 U/μ L 的 Taq DNA 多聚酶的混合溶液。更为优选的方案是，所述的PCR反应液是包括pH 8.4的Tris-HCl 40 mM, MgCl2 20 mM,KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0. 4mM 和终浓度 0· 08 U/yL 的 Taq DNA 多聚酶的混合溶液。作为优选方案，所述的引物和内参引物混合液是由ΙΟμΜ内参引物和ΙΟμΜ弓丨物 混合配制而成，其中内参引物/引物的体积比值范围为0. 6 1. 2。最佳的内参引物/引物 的体积比值为1 :1。作为优选方案，所述的阳性对照物为含弓形虫特异性基因的宫颈细胞DNA，阴性对 照物为ddH20。一种检测弓形虫的方法，包括以下步骤1)提取样本DNA ;2)使用本发明提供的引 物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)所得到的扩增产物。该方 法是一种具有较好灵敏度和高效、高特异性的检测弓形虫的方法。该方法简单、成本低廉、 适宜于广泛推广。作为优选方案，步骤1)中的样本为人的静脉全血、或宫颈悬浮细胞及分泌 物，步骤3)中的采用的检测方法为微流体芯片检测法。微流体芯片检测法是在玻璃芯片上 蚀刻若干微米级通道，构建“微型实验室”，分析样品从上样管道进入芯片，在电场或压力场 作用下，进入分离管道，在分离管道内样品完成自动分离，到达监测点，激光激发荧光发光， 仪器收集并自动处理数据，完成芯片上的自动化分析。本发明通过对患者的静脉血细胞或者宫颈细胞及分泌物中的DNA进行弓形虫B基 因检测，从而诊断患者是否感染了弓形虫，具体包括以下步骤1)将本发明提供的引物和内参引物(分别为SEQID NO :1和2所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 3和4所示的核苷酸序列)混合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增；或采用本发明 提供的试剂盒对被测样本的DNA进行多重PCR扩增；被扩增的目标基因片段大小各不相同；
2)扩增产物通过微流体芯片进行检测；
3)通过对各检测峰位置的判断，确定检测到的片段的大小，从而确定被检测到的基因， 判断临床样本感染的病毒类别；
4)结果判断a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出，检测无效；b) 只出现DNA内参特异性峰，说明没有弓形虫感染；c)出现DNA内参和弓形虫B基因特异性 峰，说明有弓形虫感染。与现有的检测方法和试剂盒相比，本发明具有以下优点
1)本发明采用PCR技术，对弓形虫特异性基因片段进行扩增。其区别与其他已有基因 检测的主要方面为本试剂盒检测手段为微流体芯片检测法，不同于电泳检测或RT-PCR仪 检测，检测结果更直观，灵敏度高，可信性好，且检测芯片为一次性使用，不会因污染而增加 假阳性结果，适合临床应用。2)内参引物的加入优选的人DNA保守序列特有基因的特异性引物作为内参引 物，该内参引物的设计选用了人β球蛋白(β-globin)基因，因为人体细胞中都含有此基 因，引入该内参基因可以确定临床样本的提取质量，避免扩增结果的假阴性。3)本发明提供的检测弓形虫的方法，可以在基因水平上迅速的进行诊断，具有较 好的灵敏度和特异性。该方法可直接对患者的临床样本(例如静脉血、宫颈悬浮细胞)进行 检测，不需要对样本进行培养后再对病毒株进行检测，节约了时间。同时，微流体芯片检测 法比传统的DNA电泳检测法简单、快捷、直观，为临床用药提供了准确、及时的指导。因此， 本发明所提供的方法技术成熟，检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、 准确。
图1是引物和内参引物混合液扩增DNA样品的电泳图，其中1-5是宫颈悬浮细 胞DNA样品，6-10是静脉血液DNA样品，+是阳性对照，-是阴性对照，200和300是对应的 Marker条带的bp数。图2是不同比例的引物和内参引物混合液扩增感染弓形虫的DNA样品图，其中各 点样孔中内参引物和引物的体积比如下1-2:内参引物/引物=0.6，3-4:内参引物/引物 =1. 0，5-6 内参引物/引物=1. 2，-是阴性对照，200和300是对应的Marker条带的bp数。图3是不同组分的PCR反应液扩增感染弓形虫的DNA样品图，其中1_2 =MgCl2 15mM、Taq DNA 多聚酶 0. 06U/ μ 1,3-4 =MgCl2 20mM、Taq DNA 多聚酶 0. 08U/ μ 1, 5-6 =MgCl2 24mM、Taq DNA多聚酶0. IOU/ μ 1，-是阴性对照，200和300是对应的Marker条带的bp数。图4是未感染弓形虫的DNA样品的微流体芯片检测结果图。图5是感染弓形虫的DNA样品的微流体芯片检测结果图。
具体实施例方式以下参照具体的实施例及附图来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实
5施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规 技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人 员可以通过公共途径获得的。本发明所述的“PCR”是指聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)，是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退 火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学技术。本发明微流体芯片检测法使用的检测仪器是购自宁波美生医疗器械有限公司生 产的微流体芯片电泳仪，该仪器的专利申请号为CN200910272437. X、CN200920230097. X、 CN200910272874. X、CN200910273037. 0、CN200920288540. 9、CN200910272436. 5。实施例1 试剂盒的组成与配制
本发明的试剂盒由PCR反应液、引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭 菌双蒸水组成。1.配制 PCR 反应液Tris-HCl CpH 8.4)40 mM，MgCl2 15 24mM，KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0.4 mM, Taq DNA 多聚酶的终浓度为 0. 06 0. 10 U/yL。其中 MgCl2最佳的浓度为20 mM, Taq DNA多聚酶的最佳终浓度为0. 08 U/ μ L ；
2.配制引物和内参引物混合液由10 μ M的内参引物和10 μ M的引物混合配制而成， 内参引物/引物体积比值范围为0. 6 1. 2，其中优选的内参引物/引物体积比值为1:1; 内参引物(S卩Β297引物)是针对内参基因——β球蛋白(β -globin)基因设计的一对特异 性引物，可以特异扩增出β球蛋白(β-globin)基因中297bp大小的保守片段。3.灭菌双蒸水(ddH20)；
4.阳性对照物含弓形虫基因的宫颈细胞DNA;
5.阴性对照物ddH20。为方便描述本发明的效果，以下各实施例均采用本试剂盒的最优配比，即本发明 的试剂盒包括
1.PCR 反应液Tris-HCl CpH 8.4)40 mM, MgCl2 20 mM, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0. 4 mM, Taq DNA 多聚酶的终浓度为 0. 08 U/μ L ；
2.引物和内参引物混合液由10μ M的内参引物和10 μ M的引物混合配制而成，内参 引物/引物体积比为1:1 ；
3.灭菌双蒸水(ddH20)；
4.阳性对照物含弓形虫基因的宫颈细胞DNA;
5.阴性对照物ddH20。实施例2 临床样本的制备(按血液、组织提取试剂盒)
本实施例制备本发明检测方法所使用的样本为人体静脉血液样本或宫颈细胞样本，提 取用试剂盒为宁波基内生物技术有限公司生产的血液/组织基因组提取试剂盒(注册号 浙甬食药监械(准)字2010第1400013号)。使用此试剂盒分别提取5个临床宫颈悬浮细胞 样本和5个临床静脉血液样本详述如下。1.样本处理
a、血样处理取新鲜血样或将加入抗凝剂的血液样本解冻，混勻后取100μ 1于1. 5ml
离心管中。
b、悬浮细胞样本处理宫颈组织悬浮样本自然沉降后，取沉降溶液底部细胞液 Iml放入EP管中，12000r/min离心2min，弃上清。2.吸附一漂洗一洗涤一溶解。具体操作同血液/组织基因组提取试剂盒说明书。实施例3 用引物和内参引物混合液扩增DNA样本
本实施例为采用本发明所提供的引物和内参引物序列扩增实施例2所提取的10个DNA 样品，并采用凝胶电泳检测PCR的扩增结果。引物和内参引物序列见表1。表1 PCR扩增引物和内参引物序列
权利要求
一种用于检测弓形虫的引物，其特征在于该引物为弓形虫特异性B基因，该引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测弓形虫的试剂盒，其特征在于包括PCR反应液、如权利要求1所述的引 物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的内参引物的上游引物具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液是包括pH8.4 的 Tris-HC140 mM，MgCl2 15 24 mM，KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0.4mM 和终浓度 0. 06 0. 10 U/μ L的Taq DNA多聚酶的混合溶液。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液是包括pH8. 4的 Tris-HC140 mM, MgCl2 20 mM, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0. 4mM 和终浓度 0. 08 U/ μ L的Taq DNA多聚酶的混合溶液。
6.根据权利要求2或3或5所述的试剂盒，其特征在于所述的引物和内参引物混合液 是由ΙΟμΜ内参引物和ΙΟμΜ引物混合配制而成，其中内参引物/弓丨物的体积比值范围为 0. 6 1. 2。
7.根据权利要求2或3或5所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照物为含弓形虫 特异性基因的宫颈细胞DNA ；阴性对照物为ddH20。
8.—种检测弓形虫的方法，其特征在于包括以下步骤1)提取样本DNA；2)使用权利要求1所述的引物或权利要求3所述的试剂盒对步骤1)得到的DNA进行 PCR扩增；3)检测步骤2)所得到的扩增产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的步骤1)中的样本为人的静脉全血、 或宫颈悬浮细胞及分泌物；步骤3)中的采用的检测方法为微流体芯片检测法。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)用权利要求1所述的引物或权利要求3所述的试剂盒对被测样本的DNA进行多重 PCR扩增；被扩增的目标基因片段大小各不相同；2)扩增产物通过微流体芯片进行检测；3)通过对各检测峰位置的判断，确定检测到的片段的大小，从而确定被检测到的基因， 判断临床样本感染的病毒类别；4)结果判断a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出，检测无效；b) 只出现DNA内参特异性峰，说明没有弓形虫感染；c)出现DNA内参和弓形虫B基因特异性 峰，说明有弓形虫感染。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测弓形虫的引物、试剂盒及方法。本发明引物的核苷酸序列如下上游引物5′-TCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTT-3′，下游引物5′-TTTCCACCCTCCAGGAAAAGCA-3′，利用此引物可在基因水平上对弓形虫迅速的进行诊断。利用上述的引物制备的用于检测弓形虫的试剂盒在弓形虫的检测中具有较高的灵敏度和高效、高特异性，检测耗时少、检测结果稳定，避免了现有的电泳法因样品污染而增加假阳性结果导致检测结果不准确的情况的发生。本发明还提供一种用于检测弓形虫的方法，该方法利用本发明提供的试剂盒进行弓形虫的检测，检测耗时少、检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、准确。
文档编号C12N15/11GK101948911SQ20101019767
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者倪剑锋, 徐辉, 杨文辉, 潘承斌 申请人:宁波基内生物技术有限公司