专利名称：基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体 构建及应用。
背景技术：
猪瘟(classical swine fever, CSF)是猪的一种高度接触性烈性传染病。虽然 各国都很重视猪瘟的防制，但由于目前养猪业的集约化和生猪贸易的全球化，猪瘟对全球 养猪业仍构成严重威胁。猪瘟的病原为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV), 属黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组长约12. 3kb，两端为 5'-端和3' _端非编码区，中部为编码区，包括4个结构蛋白和8个非结构蛋白，其中只 有囊膜糖蛋白E2和Erns可诱导机体产生中和抗体。在许多国家和地区，疫苗免疫仍是控制猪瘟的重要手段。目前使用的弱毒疫苗大 部分是我国1954年研发的基因1型猪瘟兔化弱毒C株疫苗。在相当长时间内，由于其性能 稳定、免疫效果好，被国内外公认为安全有效的弱毒疫苗。但该疫苗存在一定缺陷疫苗免 疫后诱导的抗体与动物感染野毒后产生的抗体类型相似，无法应用血清学方法快速鉴别诊 断疫苗免疫和野毒感染的动物。近年来研究表明，猪瘟病毒在全球的流行形势逐步由基因 1型向2型过渡，且两者的主要宿主保护性抗原E2在基因水平和抗原结构上均存在较大差 异。加之数十年来在大规模免疫接种压力下，流行毒株出现抗原变异和免疫逃逸现象已经 是不争的事实。同时，猪瘟疫情日益复杂，但实际监测中缺乏一套快速、灵敏、特异的鉴别检 测方法。因此，研究、改造和开发适合我国流行特点的新型猪瘟弱毒疫苗以及配套的鉴别检 测方法已迫在眉睫。近年来建立的RNA病毒感染性cDNA技术，可通过DNA水平的操作实现对RNA病毒 基因组的改造。应用该技术已经发现囊膜糖蛋白E2是病毒主要的毒力因子之一，且与病毒 的细胞嗜性有关。浙江大学动物预防医学研究所也已成功构建了猪瘟病毒疫苗C株的感染 性cDNA，为改造和开发新型猪瘟疫苗奠定了基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于E2基因的可 插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用。本发明的目的是在保留疫苗C株在兔体内复制和 对猪无致病力等特性的基础上，通过E2蛋白N端抗原区的置换，可改变重组病毒E2的抗原 性。以此重组病毒免疫猪只后，既无致病性，又能产生针对目前2型流行毒株E2的特异性 抗体。同时，在重组病毒中弓丨入探针标记序列可应用于荧光定量PCR鉴别检测方法中。为解决技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种基于E2基因的可插入式猪 瘟病毒cDNA载体的构建方法，包括步骤(1)以含有猪瘟病毒疫苗疫苗C株基因组5'半长的重组质粒PA-F123为模板，用 限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的ρΑ- Δ E2-F123质
3粒；(2)用BamHI和SalI将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3'半长的F456片段从重组 质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的ρΑ- Δ E2-F123中，获得重组质粒ρΑ_ Δ E2-FL22。作为前述方法的应用，本发明还提供了一种携带标记序列的流行毒株Ε2基因的 感染性cDNA载体的构建方法，包括步骤(1)用通用上游引物 E2-Spel-U :5' -GCT ACTAGT AACTGGGGCACAAGG-3‘-和下 游引物 E2-Nsil-L :5' -CCC ATGCAT G G AC T TTGAC-3 ‘扩增不同流行毒株 E2 的 830bp 片段。同时，在不改变E2氨基酸序列的基础上，还应用此下游引物可将标记序列引入扩增 的流行毒株E2中，分别是位于下游引物3'端的第6位核苷酸和位于下游引物3'端的第 9位核苷酸。(2)PCR产物经割胶回收后，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经 割胶回收后克隆于所述重组质粒PA-AE2-FL22，获得携带不同流行毒株E2基因的感染性 cDNA载体。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明构建的可插入式cDNA载体，可根据该病的流行形势，快速、方便的拯救携 带不同基因型E2基因的重组C株病毒；重组病毒E2基因中引入探针标记序列可应用于荧 光定量PCR鉴别检测方法中。拯救的重组病毒保留C株在兔体内复制以及对自然宿主猪无 致病力等特性；本方发明还可改变重组病毒主要宿主保护性抗原E2的抗原性，免疫后产生 针对重组病毒E2的特异性抗体(包括特异性的中和抗体)。
图1为基于猪瘟病毒E2基因的可插入式cDNA载体pA-AE2-FL22以及特异性标 记序列的构建示意图。图2为体夕卜转录获得的RNA电泳图，图中M为Wide Range DNA Marker (500-15, 000) ； 1为以携带2型流行毒株HZ1-08 E2基因的重组质粒为模板，体外转 录的RNA ；2为以携带1型流行毒株SM E2基因的重组质粒为模板，体外转录的RNA ；3为疫 苗C株体外转录的RNA对照。图3为体外转录的不同RNA电转ST细胞系后间接免疫荧光(IFA)检测病毒蛋白 表达情况。图4为不同重组病毒分子标记MspI和NcoI的鉴定示意图。图中M为2000bp DNALadder Marker ；1,4为从父代疫苗C株基因组中扩增得到的相应片段分别经MspI和 NcoI酶切后的结果；2、5为重组病毒RecCSME2-CSFV分别经MspI和NcoI酶切后的结果；3，6 为重组病毒RecCHZE2_CSFV分别经MspI和NcoI酶切后的结果。图5为不同重组病毒与针对C株全病毒多抗R-anti-C和囊膜糖蛋白E2单抗2B6 的反应性分析。
具体实施例方式参考附图，下面将对本发明进行详细描述。实施例1覆盖猪瘟病毒疫苗C株全长基因组cDNA片段的扩增
根据猪瘟病毒基因组序列，在保守区域设计带有特异性酶切位点的引物。
引物序列如下
Fl-upnew 5--GTATACGAGGTTAGTTCATTCTCG
Fl-Iownew5--GCCTTGTGCCCCAGTTACT
Fl-upper 5--AATCTAGA TAATACGACTCACTATA GTATACGAGGTTAGTTCATTCTC
Fl-Iower 5--AAAACTAGTAACAGCCATACCACAC
F2~upnew 5--GCTTGATAAAAGTATTAAGAGGACAG
F2~lownew 5--AACTCGTAAGTGGGCAGTATGA
F2_upper 5--ACGGACTAGTAACTGGGGCACAAGGC
F2-lower 5--GGGCTGCAGTGGAAATAAGGTACACGAGAA
F3~upnew 5--TTAATAAGGGTGCTGAAGGGAATAGGTGAG
F3-lownew 5--CCACATCCAAGTCCGGGAGAGTAA
F3_upper 5--AAAGCGGCCGCCTGCAGTGGTAACAAGAT
F3-lower 5--GCAGTCGACGGATCCTCACCACTATAATA
F4~upnew 5--GATTAAAGATACCAGTAGAGGAGATGAAGA
F4~lownew 5--CACGGATACTGGATTTTGTGACAT
F4_upper 5--CGTGACGTCGGATCCATCTAACCTGAGGGTGGTAACATCG
F4~lower 5--TACCATGGCCGCACTAACCCCCGTGCCTAGCAAACCATCGCTT
F5~upnew 5--AATCAGGCGCGGAAAAAG
F5~lownew 5--CCTCTTCTCATTCTTTGGGATC
F5_upper 5--ACCCCATGGAGATCATGTCACAAAATC
F5~lower 5--CAGGCGGCCGCTTCGAAAAAACCAGCAGCAC
F6~upnew 5--ATTGAAACGACCCGAGTTAGAG
F6-lownew 5--GGGCCGTTAGAAATTACCTTAG
F6_upper 5--GGGTTCGAACGCAAAAATATAGGGGAAATAT
F6-lower 5--AAAGTCGAC CTCGAG GGCCGTTAGAAATTACCTTAG
各片段的扩增均运用套式PCR的方法。其中引物名称中up表示上游引物，low表
示下游引物，new表示用于第一轮扩增的引物。引物中标有下划线的序列为用于该片段克隆 的酶切位点。Fl-upper引物中粗体的序列为引入的T7RNA聚合酶识别的启动子，F6_l0Wer 引物中粗体的序列为引入的XhoI限制性酶切位点。猪瘟活疫苗(兔源)购于杭州荐量兽用生物制品有限公司，用生理盐水稀释至1 头份/ml作为实验材料。用总RNA抽提试剂盒(上海生物工程有限公司)抽提疫苗中的总 RNA。根据上述设计的6对引物，RT-PCR分段扩增相应的6个cDNA片段。6个独立的cDNA 片段克隆于Takara公司的pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector，进行序列测定。实施例2全长cDNA克隆所需质粒的改造以pBR322 (购自Promega公司)为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组 3'-半长的质粒pB-CN。具体步骤如下应用弓丨物dGEM-U :GGG AAGCTT GGATCCTATAGGGCGAATTGG 禾Π DGEM-L CCG CCCGGG CAAGCTATTTAGGTGACAC 扩增含有质粒 pGEM_5ZF(+)(购自 Promega 公司)，多克隆位点的171bp片段，并在该片段的前后分别引入酶切位点HindIII和Aval。由于 PBR322质粒中编码卡那抗性片段的前后也含有相应的这两个酶，所以应用这两个酶可将该 片段切下，并将171bp的片段克隆于相应位置，获得中拷贝质粒pB-CN。以低拷贝质粒pACYC_177(购自NEB公司)为模板进行改造，获得用于克隆CSFV 基因组5'-半长和基因组全长的质粒pA-CN。具体步骤如下应用弓I 物 pA-U =GCGG ACTAGTACGCGTTCTAGA GCGCGGAACCCCTATTTG 和 ρΑ-L T GGATCCGCGGCCGCGTCGAC CCCCTTGTATTACTGTTTATGT 在删除 pACYC_177 多余卡那 抗性基因的同时，引入6个酶切位点用于半长和全长的克隆，获得低拷贝质粒pA-CN。实施例3全长cDNA载体的构建CSFV 5'-半长的组装首先分别用限制性内切酶Xbal/Spel，Spel/PstI和 Notl/Sall将Fl，F2和F3片段克隆于质粒pA或pGEM_5ZF (+)中，获得相应重组质粒Fl_pA， F2-pGEM和F3-pGEM。在Fl片段基因组5'-非编码区的上游引入T7RNA聚合酶的启动子 用于全长cDNA的体外转录。然后用PstI和SalI将F3从F3_pGEM中切下，克隆与用相同 酶作用的F2-pGEM，获得重组质粒F23-pGEM。再用SpeI和BamHI将F23从F23_pGEM中切 下，克隆与用相同酶作用的Fl-pA，获得含有CSFV 5'-半长的重组质粒F123-pA。CSFV 3'-半长的组装首先分别用限制性内切酶BamHI/Ncol和NcoI/NotI将 F4，F5片段克隆于质粒pB中，获得相应重组质粒F4-pB和F5_pB。而F6片段则克隆于 pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector 载体中，获得重组质粒 F6_pUC。然后用 NcoI/NotI 将 F5 从 F5-pB中切下，克隆与用相同酶作用的F4-pB中，获得重组质粒F45_pB。再用BstBI和SalI 将F6从F6-pUC中切下，克隆与用相同酶作用的F45-pB，获得含有CSFV 3'-半长的重组 质粒 F456-pB。实施例4可插入式cDNA载体ρΑ_ Δ E2-FL22的构建以重组质粒pA-F123为模板，选择其Ε2基因序列中5'-端的限制性内切酶SpeI 和3'-端的NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的ρΑ-ΔE2-F123质粒。用 BamHI和SalI将含有C株基因组3'-半长的F456片段从重组质粒pB_F456中切下，克隆 与用相同酶作用的PA-AE2-F123中，获得重组质粒ρΑ-Δ E2-FL22 (图1)。实施例5携带流行毒株Ε2基因的感染性cDNA载体的构建以重组质粒pA-AE2-FL22为骨架，将1型流行毒株SM和2型流行毒株HZ1-08 的E2克隆于该质粒的相应区域，获得携带流行毒株E2基因的感染性cDNA。具体操作 步骤如下用通用上游引物E2-Spel-U =GCT ACTAGT AACTGGGGCACAAGG和下游引物 E2-Nsil-L -CCC ATGCAT G G AC T TTGAC 扩增不同流行毒株 F.2 的 830bp 片段。PCR 产 物经割胶回收后，用限制性内切酶SpeI和NsiI酶切。酶切产物经割胶回收后克隆于重 组质粒PA-AE2-FL22，获得携带不同流行毒株E2基因的感染性cDNA载体pA_FL22SME2和 pA-FL22HZE2。对含有全长cDNA的细菌进行连续传代，第10代细菌抽提质粒后对替换区域进 行测序，测序结果与预期一致。这一结果表明通过本发明构建的携带流行毒株E2基因的感 染性cDNA载体在宿主菌内是稳定的。实施例6不同重组猪瘟病毒的拯救200ml LB培养基中加入培养过夜的菌液500 μ 1，同时加入浓度为100mg/ml的 Amp200l·! 1，37°C扩大培养12h。收集菌液后用Promega公司中量质粒纯化试剂盒抽提
6质粒。经浓度测定的质粒用限制性内切酶XhoI进行线性化。线性化的质粒经纯化后用 MEGAscript体外RNA合成试剂盒(Ambion公司)。体外转录获得的RNA经电泳检测完整性 和正确性。如图2所示，体外转录的RNA非常均一，无脱尾，降解现象。经浓度测定后存放 于-80°C备用。电转前一天，将ST或PK-15细胞分瓶。电转时，将前一天分瓶的细胞消化后，用PBS 洗涤细胞2次。将1 1. 5 μ g上述RNA与细胞混勻后加入0. 2cm的电转杯(Bio-Rad公 司)中，用电转仪Gene Pulser Xcell (Bio-Rad公司)进行电转，电转参数为150V，500 μ F， 电阻无穷。电转后用完全培养基将细胞重悬后加入培养瓶中，37°C，5% CO2培养。电转后 96h进行IFA鉴定，结果显示电转不同RNA的细胞均可检测到荧光信号，且呈典型戒指状的 核周围染色(图3)。细胞经胰酶消化后以1 4的比例继续连续传代培养。在检测是否产 生感染性子代病毒时，将细胞-76°C/37°C反复冻融三次，离心去除细胞碎片后取上清接种 新的ST或PK-15细胞，37°C培养96h后IFA检测。结果显示转录的不同RNA在细胞内均能 复制并合成病毒蛋白，最终产生具有感染性的子代病毒。这一结果表明通过本发明替换疫 苗C株的E2基因并不影响重组病毒在细胞内RNA的复制、蛋白的合成以及子代病毒的包装 和释放。实施例7不同重组嵌合病毒分子标记和抗原性的鉴定重组病毒感染ST细胞96小时后抽提RNA，用建立的套式RT-PCR体系分别扩增E2 基因(第一轮引物为 2342-2360 :GCATCAACCAYKGCATTCC，禾口3616-3591 GTCTGTGTGGGTRATTAAGTTCCCTA,以及第二轮引物 2420-2439 :CTRGTRACTGGGGCACAAGG，禾口3559-3540 :ACCAGCRGCGAGTTGYTCTG)和NS4B 基因(第一轮引物为 7673-7693 TGGGGGTGAATCAATAGCAGA,禾口8411-8432 :ATTACTTGATAGCTGGCGGACC，以及第二轮引物 7843-7872 GGAATTACAATAACCTGTCCAAGATAGTTG,和8372-8391 CCCAGCAGTTCCACAGCCTC)，并用MspI和NcoI酶切鉴定两个分子标记。结果表明重组病毒基于MspI的RFLP 表型发生改变，与重组病毒RecC-CSFV不同，与相应替换毒株的RFLP表型相同。重组病毒 RecCSME2-CSFV扩增的E2片段不能被MspI切开，而重组病毒RecCHZE2_CSFV扩增的E2片段被 MspI切成大小几乎相同的两个500bp片段(图4)。三个重组病毒基于NcoI的RFLP表型 没有改变，表明除了 E2基因替换外，基因组的其余部分仍然稳定遗传(图4)。E2片段经克 隆测序，序列比较结果表明引入的探针标记序列在不同重组病毒中也能稳定遗传。重组病毒感染ST细胞96小时后，用针对C株全病毒多抗R-anti-C和囊膜糖蛋白 E2进行IFA鉴定，结果表明重组病毒RecCHZE2-CSFV不与单抗2B6反应。这一结果表明通过 本发明可改变重组病毒E2的抗原性(图5)。实施例8不同重组嵌合病毒在兔和猪体内的致病力试验将传至第10代的重组病毒RecCHZE2_CSFV和RecCSME2_CSFV超离浓缩后，以 IOOTCID5ci耳缘静脉注射于家兔体内，阳性对照组为猪瘟病毒C株细胞苗，阴性对照为MEM培 养液。每天测量体温3次，在感染后的24-72h可观察到注射重组病毒和阳性对照的三组兔 子体温升高，且在感染后的第5天剖杀各组家兔脾脏可见明显肿大。而阴性对照组的家兔
7体温未见升高，且脾脏无肿大。这一结果表明通过本发明替换疫苗C株的E2基因并不改变 重组病毒在兔体内复制增殖的特点。 以Ioootcid5ci颈部肌肉注射60日龄仔猪，阳性对照为猪瘟病毒c株细胞苗，阴性 对照为MEM培养液。试验期各组猪均未见体温升高，且无明显的白细胞减少和病毒血症。在 免疫后的第9天开始可检测到特异性抗体，第20天可检测到高滴度的中和抗体。以上结果 表明通过本发明替换疫苗C株的E2基因并不改变重组病毒在猪体内无致病力的特征，且能 产生针对重组病毒E2的特异性抗体(包括特异性的中和抗体)。 还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上 实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联 想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体的构建方法，包括步骤(1)以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5′半长的重组质粒pA F123为模板，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的pA ΔE2 F123质粒；(2)用BamHI和SalI将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3′半长的F456片段从重组质粒pB F456中切下，克隆于相同酶作用的pA ΔE2 F123中，获得重组质粒pA ΔE2 FL22。
2.一种基于权利要求1所述方法的携带标记序列的流行毒株Ε2基因的感染性cDNA载 体的构建方法，包括步骤(1)用通用上游引物E2-Spel-U-GCT ACTAGTAACTGGGGCACAAGG-3‘和下游引物 E2-Nsil-L 5' -CCC ATGCAT G G AC T TTGAC-3 ‘扩增不同流行毒株 E2 的 830bp 片段；同 时，在不改变E2氨基酸序列的基础上，还应用此下游引物将标记序列引入扩增的流行毒株 E2中，分别是位于下游引物3'端的第6位核苷酸和位于下游引物3'端的第9位核苷酸;(2)PCR产物经割胶回收后，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回 收后克隆于所述重组质粒pA-AE2-FL22，获得携带不同流行毒株E2基因的感染性cDNA载 体。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用。该构建方法包括以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5’半长的重组质粒pA-F123为模板，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的pA-ΔE2-F123质粒；用BamHI和SalI将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的pA-ΔE2-F123中，获得重组质粒pA-ΔE2-FL22。本发明构建的可插入式cDNA载体，可根据该病的流行形势，快速、方便的拯救携带不同基因型E2基因的重组C株病毒；重组病毒E2基因中引入探针标记序列可应用于荧光定量PCR鉴别检测方法中。拯救的重组病毒保留C株在兔体内复制以及对自然宿主猪无致病力等特性。
文档编号C12N15/40GK101914566SQ20101019733
公开日2010年12月15日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者万婧, 方维焕, 李得江, 李肖梁, 童超, 袁雪梅, 陈宁 申请人:浙江大学