一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法。该方法包括如下步骤：(1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；(2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3uM，诱导培养的温度为30℃，得到诱导后菌体；(3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。实验结果表明，本发明方法制备得到的人PSG9蛋白的纯度高，可达27.3mg/L，为后续PSG9在癌症中作用机制研究以及获得高纯度的单克隆抗体奠定了基础。
【专利说明】一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体为一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法。
【背景技术】
[0002] 妊娠特异性糖蛋白（Pregnancy specific glycoprotein, PSG)是一种糖基化蛋白， 具有复杂的蛋白质三级结构，是癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen, CEA)家族的成员。 但是，目前对PSG家族研究较少。PSGs共包含11个成员，各成员间蛋白质序列保守性较强， 同CEA家族蛋白一样，都含有免疫球蛋白样结构域（domain)，且是该蛋白的主要结构域。通 过研究也发现，PSG1可能参与胚胎期血管生成。另外，还发现PSG蛋白另一项重要的功能 是可以通过转化生长因子（Transfer growth factor, TGF)-beta,参与免疫反应，且能够抑 制结肠炎症的发生。
[0003] PSG9是PSG蛋白的一种异构体，该基因也称为PSG7或PSG 11，在蛋白质序列的 N-端含有血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF)样结构域。 PSG9蛋白是制备抗PSG9单克隆抗体的必备材料，同时，也是后期建立检测人血液或组织中 PSG9蛋白酶联免疫吸附试剂盒的标准品。Salahshor等通过基因芯片技术发现：PSG9在结 直肠癌组织中高表达。对已经公布的表达谱芯片数据分析也发现，在肺癌中，PSG9 mRNA表 达上调。多种肿瘤细胞系中也发现了 PSG9蛋白的表达。PSG9是一种分泌型蛋白，在血浆 中可以检测到。有研究报道在肝细胞癌中，PSG9血浆含量显著高于健康人群。据此，推测 PSG9可能促进肿瘤发生发展。但是，对于PSG9在肿瘤发生中的作用仍不清楚。
[0004] 目前，还未见有研究者表达全长的人PSG9蛋白，用于研究其功能。对于PSG9功能 的挖掘很大程度受限于：没有一种稳定、特异性强的抗体，来分析PSG9在肿瘤组织的表达， 构建酶联免疫吸附反应（ELISA)试剂盒，相互作用蛋白等。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种制备人PSG9蛋白的方法。
[0006] 本发明所提供的制备人PSG9蛋白的方法包括如下步骤：
[0007] (1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；
[0008] (2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为 3uM，诱导培养的温度为30°C，得到诱导后菌体；
[0009] (3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中 使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。
[0010] 上述所述人PSG9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2中自N端起第1-426位氨基 酸所示。
[0011] 上述所述的宿主大肠杆菌为E. coli BL21 (DE3)。
[0012] 上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸的DNA分 子所示。
[0013] 上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人 PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21 a -His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体 导入所述宿主大肠杆菌中。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种用于制备人PSG9蛋白的重组菌。
[0015] 本发明所提供的制备人PSG9蛋白的重组菌的具体步骤：将人PSG9蛋白的编码基 因导入宿主大肠杆菌中获得的。
[0016] 上述所述的宿主大肠杆菌为E. coli BL21 (DE3)。
[0017] 上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸的DNA分 子所示。
[0018] 上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人 PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21 a -His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体 导入所述宿主大肠杆菌中。
[0019] 实验结果表明，本发明方法制备得到的人PSG9蛋白的纯度高，可达27. 3mg/L，为 后续PSG9在癌症中作用机制研究以及获得高纯度的单克隆抗体奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为PSG9基因克隆双酶切（NheI、HindIII)鉴定。共挑取4个单克隆；Μ为DNA 分子量 Marker (bp)。
[0021] 图 2 为 SDS-PAGE 鉴定 IPTG 诱导 Ε· coli BL21(DE3)-PSG9-6XHis 菌株 PSG9 蛋 白的表达。A 为经过不同 IPTG 浓度（1 :0μΜ，2 :0· 5μΜ，3 :1μΜ，4 :2μΜ，5 :3μΜ，6 :5μΜ) 诱导后，检测PSG9-6XHis蛋白的表达量；Β为不同温度（1 :未加入IPTG诱导，2 :20°C，3 : 25°C，4:30°C，5:37°C)条件下，IPTG诱导PSG9-6XHis蛋白的表达量；Μ为蛋白质分子里 Marker(kDa)〇
[0022] 图3为SDS-PAGE检测PSG9-6XHis蛋白的可溶性表达和纯化。A为PSG9蛋白在 破碎后沉淀和上清中的分布（1 :沉淀，2 :上清）；B为PSG9蛋白的纯化，用不同浓度的咪唑 进行洗脱（1 :纯化前；咪唑浓度，2 :20nM，3 :40nM，4 :100nM，5 :200nM，6 :1000nM) ;M 为蛋白 质分子量Marker (kDa)。
[0023] 图 4 为 Western-blot 分析 E. coli BL21 (DE3)的表达。1 为未用 IPTG 诱导；2 为 IPTG诱导后。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1、人PSG9基因工程菌株的构建
[0027] 1、聚合酶链式反应克隆人PSG9的全长基因
[0028] 采用上游和下游引物序列，以pcDNA3. 1-PSG9质粒载体为模板克隆人全长的PSG9 编码基因序列。引物序列如下：
[0029] 上游引物序列：5 ' -CTAGCTAGCACAGGCAGCAGAGACCATGGG-3 '，下划线代表 Nhe I 酶 切位点；
[0030] 下游引物序列:5'-CCAAGCTTTACAGTCTCAGAGTCAGTCATGA-3'，下划线代表Hind III 酶切位点，同时将下游的终止密码子换为CAT。
[0031] 也可人工合成SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸所示基因，并在其上下游添加 Nhe I酶切位点和Hind III酶切位点。
[0032] 2、双酶切、连接
[0033] 用Nhel酶和Hindlll酶对PCR扩增产物进行酶切，回收目的基因片段；将目的 基因片段用T4 DNA连接酶连接到pET-21a-His质粒（购自Novagen公司，目录号为： 69770-3)上，得到重组质粒，记作pET-21 a -PSG9-His。对重组质粒进行测序验证，结果表 明连入pET-21 a -His的外源基因的序列如SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸所示，表明 载体构建正确。SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸所示基因编码的蛋白如SEQ ID N0. 2中 自N端1-426氨基酸所示。
[0034] 3、转化
[0035] 将构建好的pET-21 a -PSG9_His质粒载体按转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组 菌。将重组菌进行单克隆培养，挑取单克隆后，进行双酶切鉴定，结果如图1所示。表明构 建的重组菌正确，将其记作E. coli BL21(DE3)-PSG9-6XHis。该重组菌表达的蛋白是带有 His标签的，即为SEQIDN0·2所示融合蛋白（PSG9-6XHis)。
[0036] 实施例2、PSG9蛋白的表达及纯化
[0037] l、PSG9_6XHis蛋白的表达条件的摸索
[0038] 将E. coli BL21(DE3)-PSG9-6XHis培养至菌液0D值为0. 6时，用诱导剂异 丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)诱导目的蛋白 PSG9-6XHis的表达。为获得高产量的PSG9-6XHis蛋白，我们对IPTG的浓度及诱导温度 进行了优化。
[0039] 用不同浓度（0 μ Μ、0· 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、5 μ M)的 IPTG 诱导目的蛋白 PSG9-6XHis的表达。结果表明，当IPTG的浓度为3 μ Μ时，目的蛋白的浓度达到最大值（图 2Α)。
[0040] 在不同温度（20°C、25°C、30°C、37°C )下用IPTG诱导目的蛋白PSG9-6XHis的表 达，IPTG在菌液中的浓度为3 μ M。结果表明，在30°C的情况下，PSG9-6 X His蛋白占总蛋白 的含量最高（图2B)。
[0041] 2、PSG9-6 X Hi s 蛋白的表达
[0042] 将E. coli BL21(DE3)-PSG9-6XHis培养至菌液0D值为0. 6时，用诱导剂异 丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-l-Thiogalactopyranoside，IPTG)诱导目的蛋白 PSG9-6XHis表达，IPTG在菌液中的浓度为3μΜ，温度为30°C，诱导培养时间为5h。
[0043] 3、PSG9_6XHis 蛋白的纯化
[0044] 将诱导表达后菌体破碎，分别取沉淀和上清。用含有强变性剂6M尿素的溶液溶解 破碎诱导表达后细菌中不溶解的沉淀，并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白在沉淀和上清中 的分布（图3A)。结果表明，PSG9-6XHis蛋白主要包含于上清中，分子量约为50 KDa。
[0045] 用全是金公司的ProteinlsoTM Ni-IDA琼脂糖凝胶柱进行纯化。将上清上柱 后分别用含有20ηΜ、40ηΜ、ΙΟΟηΜ、200ηΜ、ΙΟΟΟηΜ咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，并用10 % 的SDS-PAGE进行检测。结果表明，用含有40nM咪唑的洗脱缓冲液洗脱时，大部分的 PSG9-6XHis蛋白被洗脱下来，如图3B所示，收集40nM咪唑的洗脱产物。
[0046] 对洗脱获得的PSG9_6XHis蛋白的纯度和产率进行检测。结果表明：洗脱产物中 蛋白的浓度为910ug/ml，蛋白的产率为27. 3mg/L(每100ml菌液可得目的蛋白2. 73mg)。
[0047] 4、鉴定
[0048] 我们采用Western blot对表达的PSG9_6XHis蛋白进行鉴定。用多克隆兔抗人 抗体检测表达的蛋白，实验结果如图4所示，经IPTG诱导后表达的PSG9-6 X His蛋白，可见 明显条带，分子量同预期大小一致，结果表明我们所表达的蛋白为人PSG9蛋白。
【权利要求】
1. 一种制备人PSG9蛋白的方法，包括如下步骤： (1) 构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌； (2) 重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3uM，诱 导培养的温度为30°C，得到诱导后菌体； (3) 蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用 的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述将人PSG9蛋白的编码基因导 入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21 a -His的多 克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。
5. -种用于制备人PSG9蛋白的重组菌，是将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆 菌中得到的重组菌。
6. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3) 〇
7. 根据权利要求5或6所述的重组菌，其特征在于：所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO. 1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。
8. 根据权利要求5-7任一所述的重组菌，其特征在于：所述将人PSG9蛋白的编码基因 导入宿主大肠杆菌中的方法：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21 a -His的多 克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。
【文档编号】C12R1/19GK104151407SQ201410376676
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】杨磊, 黄骁舾, 王敏 申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院