受体结合亲和力，使用SPR(表面等离子 共振，BIACORE3000)。作为膜岛素受体，将ECD(胞外结构域）在肥K293F细胞中表达，然 后进行纯化。将由此表达的膜岛素受体通过氨基偶联固定在CM5忍片上，并且施加1yM至 6. 25nM的N-端或B29膜岛素缀合物并测定它们的结合亲和力。使用结合缓冲液（皿S-E巧 将运些膜岛素缀合物稀释，并与固定有膜岛素缀合物的忍片结合4分钟、解离6分钟。然后， 为了在不问的浓度下结合膜岛素缀合物，将SOmM化Cl/5mM化OH施加至与膜岛素雙体偶联 的膜岛素缀合物约30秒。利用BIA评估软件程序的1:ILangmuir结合模型来分析结合亲 和力。在图4中给出结果。
[0118] 如图4所示，N-端和B29膜岛素缀合物都被发现W浓度依赖性方式与膜岛素受体 结合。运些膜岛素缀合物与膜岛素受体的结合亲和力显示在表1中。详细地，B29膜岛素缀 合物具有比N端膜岛素缀合物高约1. 8倍的缔合（association)速率常数，运表明B29膜 岛素缀合物与膜岛素受体的结合比N-端膜岛素缀合物与膜岛素受体的结合更快。B29膜岛 素缀合物具有比N-端膜岛素缀合物低约1. 8倍的解离速率常数，运表明在结合后，B29膜 岛素缀合物与膜岛素受体的结合更稳定地保持。N-端和B29膜岛素缀合物之间结合亲和力 的比较结果显示出，B29膜岛素缀合物的结合亲和力比N-端膜岛素缀合物的结合亲和力高 约3. 6倍。
[0119][表U
[0120]N-端膜岛素缀合物和B29膜岛素缀合物之间膜岛素受体结合亲和力的比较
阳122] k。:缔合速率常数
[0123] kd:解离速率常数 阳124] Kd:亲和力常数
[01巧]基于W上描述，在不背离本发明的范围和精神的情况下可W进行的各种修改和改 变将对本领域技术人员是明显的。因此，应理解，在所有方面上述实施方式并不是限制性的 而是说明性的。本发明的范围是由所附的权利要求所限定而不是由权利要求之后的上述描 述所限定，因此，落入权利要求边界和界限或者运些边界和界限的等同物内的所有改变和 修改都意图被权利要求所囊括。
【主权项】
1. 胰岛素缀合物，其中胰岛素和免疫球蛋白Fe区通过非肽基聚合物连接体彼此连接， 所述非肽基聚合物连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多 元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、 透明质酸及其组合，并且所述非肽基聚合物的一端与胰岛素0链除其N-端外的氨基酸残 基连接，而其另一端与所述免疫球蛋白Fe区连接。2. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链的位置 20至29处的氨基酸残基中的任一个连接。3. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链的位置 25至29处的氨基酸残基中的任一个连接。4. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链的位置 29处的赖氨酸残基连接。5. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中与所述非肽基聚合物连接的所述胰岛素P链 的所述氨基酸残基具有胺基或巯基。6. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述胰岛素是天然胰岛素或变体、胰岛素衍 生物、胰岛素激动剂、或其片段，所述变体是通过对天然胰岛素的一些氨基酸的置换、添加、 缺失和修饰中的任意一种方法或通过其组合而制备。7. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白 Fe区和所述胰岛素P链的所述氨基酸残基的所述侧链的胺基或巯基连接。8. 权利要求7所述的胰岛素缀合物，其中所述氨基酸是天然存在的或非天然存在的氨 基酸。9. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是非糖基化的。10. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区由选自CH1、CH2、CH3 和CH4结构域的一至四个结构域构成。11. 权利要求10所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区进一步包括铰链区。12. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是源自于IgG、IgA、 IgD、IgE或IgM的Fe区。13. 权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区的每个结构域是不同 来源的结构域杂合体，所述不同来源源自于选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。14. 权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是由单链免疫球蛋白 构成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域构成。15. 权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是IgG4Fc区。16. 权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是人非糖基化 IgG4Fc区。17. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链的所 述氨基酸残基的所述侧链的所述胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧 吡咯烷基键。18. 权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有反 应性基团，所述反应性基团选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。19. 权利要求18所述的胰岛素缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧 甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰 亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。20. 权利要求18所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端分别具有丁醛反 应性基团或琥珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。21. 具有改善的体内持续时间和稳定性的长效胰岛素制剂，其包括权利要求1至20中 任一项所述的胰岛素缀合物。22. 权利要求21所述的长效胰岛素制剂，其中所述制剂用于治疗糖尿病。23. 权利要求1所述的胰岛素缀合物的制备方法，其包括以下步骤： (1) 将非肽基聚合物与所述胰岛素P链除其N-端外的氨基酸残基共价连接； (2) 从（1)的所述反应混合物中分离所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链除其N-端 外的所述氨基酸残基共价连接的胰岛素络合物；以及 (3) 将免疫球蛋白Fc区与所述分离的络合物的所述非肽基聚合物的另一端共价连接， 从而生成所述免疫球蛋白Fc区和胰岛素与所述非肽基聚合物的每一端连接的胰岛素缀合 物。24. 权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素P链的所述氨基酸 残基的所述侧链的所述胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基 键。25. 权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有醛衍生物、 马来酰亚胺衍生物或琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团。26. 权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端分别与所述胰岛素P链除 其N-端外的和免疫球蛋白Fc区的所述氨基酸残基的所述侧链的胺基或巯基连接。27. 权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有丁醛基或琥 珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。28. 权利要求23所述的方法，其中步骤（1)是在pH9. 0±2的碱性环境下进行。29. 权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤（1)中的所述胰岛素和所述非肽 基聚合物的摩尔比为1:1. 5至1:10。30. 权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤（3)中的所述胰岛素络合物和所 述免疫球蛋白Fc区的摩尔比为1:1至1:10。
【专利摘要】本发明提供了具有改善的胰岛素受体结合亲和力和增强的活性的胰岛素缀合物、包含该胰岛素缀合物的长效制剂及其制备方法，其中非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过共价键与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基位点特异性地连接。本发明的胰岛素缀合物用于提供显示出显著地增加肽的体内活性的胰岛素制剂。
【IPC分类】C07K14/62, C07K17/08, A61P3/10, A61K38/28
【公开号】CN105229025
【申请号】CN201480009429
【发明人】张明贤, 金大振, 黄祥渊, 金贤煜, 郑圣烨, 权世昌
【申请人】韩美药品株式会社
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年2月26日
【公告号】CA2899418A1, EP2963055A1, US20160000931, WO2014133327A1