5ITCR-CMV- 丫 4TCR包装为重组慢病 O
[0100] 分离健康人PBMC，分选a0T细胞，并在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中， 使用上述重组慢病毒进行感染。感染后第7天，收集细胞，用流式细胞技术检测其表面 丫 4 5 1 (GTM)TCR的表达情况。如图IF所示，与空载体感染对照相比，35. 9%的a0T细胞 同时表达丫4 5I(GTM)TCR,即成功获得表达肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的aPT细 胞，即丫4 5I(GTM)-曰PT细胞。 阳1〇U实施例4 : 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞体外生物学功能鉴定 引1) 丫 4 6 1佑?) -Fc分子与肿瘤细胞的结合情况 阳10引 丫4SI(GTM)-QPT细胞对肿瘤杀伤的前提是丫4SI(GTM)TCR与肿瘤细胞表面 相应肿瘤相关抗原的结合。表达了丫 4 5 1 (GTM) -Fc分子（图2A)，将丫 4 5 1 (GTM)TCR胞外 区与抗体Fc分子相连，并检测其与肿瘤细胞的结合情况。流式细胞技术（图2B1-图2B3) 和激光扫描共聚焦显微镜（图2C1-图2C3)的结果均显示，与同型对照组化IgGl-Fc)相比， 丫 4 5 1 (GTM) -Fc与胎pG2、BGC-803及K562肿瘤细胞都能特异性的结合。 阳104] 。丫 4S1 (GTM) -a0T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性
[0105]WHepG2、BGC-803及K562细胞为祀细胞，W实施例3中所获得的 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞为效应细胞，用LDH法检测丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞对祀细胞的杀 伤活性（W杀伤率表示），结果如图2D所示。与空载体对照细胞相比，丫4SI(GTM)-QPT 细胞对运些肿瘤细胞的杀伤效率都显著提高。 阳106] 扣丫 4S1 (GTM) -a0T细胞对肿瘤细胞的杀伤途径 阳107] 丫 5T细胞对肿瘤细胞的杀伤主要通过两条途径=Fas-FasL途径和穿孔素-颗粒 酶途径。采用流式细胞术检测与胎pG2解育后丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞化SL和Granzyme B的表达情况。结果显示，与肿瘤细胞解育后，丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞的化SL表达水平与 空载体对照细胞没有差异，而GranzymeB的表达水平（40. 7% )明显高于对照组（25. 7% ) (图沈1-图沈2)，表明丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞是通过穿孔素-颗粒酶途径发挥对肿瘤的 杀伤。 阳1〇8] 4) 丫 4S1 (GTM) -a0T细胞细胞因子的分泌能力 阳109] 除了直接发挥细胞毒活性W外，丫 5T细胞的抗肿瘤免疫功能还包括分泌细胞因 子。用流式细胞技术检测了在与肿瘤细胞化pG2接触8小时后，丫 45I(GTM)-QPT细胞 细胞因子的分泌能力，细胞因子包括子IL-2,IFN-丫和IL-4。结果如图2F1-2F3所示， 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞分泌IL-2,IFN- 丫能力显著高于空载体对照细胞，而IL-4的分泌 能力两者没有显著性差异。
[0110] 实施例5 : 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞自身反应性检测 阳1川 1)外源丫 4和S1链与内源TCRa0交叉互配检测 阳11引研究表明，外源a链和0链与aPT细胞中内源的TCRa0会发生交叉互配， 运种交叉互配形成的新型TCR极可能引起自身免疫反应。如果外源丫 45I(GTM)TCR受体 在aPT细胞中表达时也出现类似的交叉互配现象，就有可能引起自身反应性。因此，用外 源5 1链和丫4链分别修饰aPT细胞，检测细胞表面是否有丫 5 (GTM)TCR表达。结果如 图3A1-图3A3所示，5ITCR修饰的a0T细胞和丫 4TCR链修饰的a0T细胞都检测不到 丫 5TCR的表达，而pCDH- 5ITCR-CMV- 丫 4TCR修饰的a0T细胞作为阳性对照，能检测到 丫 5TCR的表达，说明外源5 1链或丫 4链不与aTCR链或PTCR链发生交叉互配，形成完 整的TCR分子，被运送到细胞膜表面，因此丫 4S1 (GTM) -a0T细胞没有产生新的TCR而带 来的自身免疫反应风险。 阳11引 。丫 4S1 (GTM) -a0T细胞对正常细胞的反应性研究
[0114] 除了交叉互配W外，外源的丫 5TCR本身如果能与正常细胞结合，也会引起 丫4 5I(GTM)-QPT细胞的自身反应性。首先用流式细胞术检测丫4 5I(GTM)-Fc分 子与正常细胞，包括PBMCs, 1308. 1.86,CCC-HEL-I和293T细胞的结合情况。结果如图 3B1-图3B4所示，丫 451(GTM)-Fc分子不与正常细胞结合。与空载体对照细胞相比， 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞对正常细胞的杀伤作用没有改变（图3C)，而且在与正常细胞共解 育后，丫 4S1 (GTM) -a0T细胞分泌IFN- 丫的能力也没有显著提高（图3D1-图3D4)。 阳11引实施例6 : 丫 4 5 1 (GTM) -a0T细胞体内抗肿瘤作用
[0116] 建立了荷人肝癌细胞化pG2移植瘤裸鼠模型。待肿瘤结节长到IOOmm3左右，将裸 鼠随机分成两组。治疗组，瘤内注射丫 45l(GTM)-aPT细胞（IXlO6细胞/只）；空载体 组，瘤内注射空载体感染的同样数目的aPT细胞，每隔=天治疗一次，共进行四次。动物 同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只。图4A显示了不同组裸鼠的皮下肿瘤体积变化情况， 丫 45I(GTM)-QPT细胞治疗组裸鼠的肿瘤显著小于对照组。图4B为计算出的肿瘤生长抑 制率曲线。从第3天开始，丫4 5 1 (GTM) -a0T细胞治疗对肿瘤生长的抑制率就达到40%， 并且随着时间推移，增长至70 %，并且在30天时间内一直维持在运个水平上。图4C是30 天后，处死老鼠，分离到的皮下肿瘤的大小。W上结果充分显示，丫 45I(GTM)-QPT细胞 在体内明显抑制了小鼠肿瘤的生长。
[0117] 从上面所述可W看出，本发明所提供的肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的 aPT细胞具有广泛的抗肿瘤作用，如肝细胞癌、胃癌、髓系白血病等。并且，不存在外源 TCR丫 5和内源TCRa0的交叉互配情况，对正常细胞没有细胞毒活性，没有自身反应性风 险，具有获得较佳的治疗效果，可W应用于制备抗肿瘤细胞制剂。为肿瘤的过继性免疫治疗 提供了新的方法和策略。
【主权项】
1. 一种肿瘤结合特异性γSTCR基因修饰的αβτ细胞，该αβτ细胞表达肿瘤结合 特异性γδTCR，所述肿瘤结合特异性γδTCR包括γ4链和δ1链，所述δ1链⑶R3的氨 基酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细胞，其特征在 于，所述γ4链的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示，所述δ1链的氨基酸序列如SEQIDNO: 3 所示。3. 根据权利要求1所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细胞，其特征在 于，所述αβΤ细胞是通过可表达所述肿瘤结合特异性γδTCR的表达载体感染或转染所 得。4. 根据权利要求3所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细胞，其特征在 于，所述表达载体是重组慢病毒。5. 根据权利要求4所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细胞，其特征在 于，所述重组慢病毒的出发载体是Ρ⑶H-CMV-MCS-EFl-copGFP，插入该出发载体的表达所述 肿瘤结合特异性γSTCR的基因序列如SEQIDN0:4所示。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细 胞，其特征在于，所述αβΤ细胞经肿瘤细胞蛋白刺激后，IL-2和IFN-γ分泌增加。7. 根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细 胞，其特征在于，所述αβΤ细胞通过穿孔素/颗粒酶途径对肿瘤细胞起细胞毒作用。8. 根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细 胞，其特征在于，所述αβΤ细胞是无自身免疫反应的细胞。9. 根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβΤ细胞 在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途，或者在制备含IL-2的抗肿瘤细胞制剂中的用途。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自肝细胞癌、胃癌、髓系白 血病。
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途，该αβT细胞表达肿瘤结合特异性γδTCR，所述肿瘤结合特异性γδTCR包括γ4链和δ1链，所述δ1链CDR3的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。实验证明该细胞对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
【IPC分类】C12N15/867, A61K35/17, A61P35/02, C12N5/10, A61P35/00
【公开号】CN105296431
【申请号】CN201510846740
【发明人】何维, 何康霞, 陈慧, 胡愉, 张建民
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月26日