专利名称：禽流感病毒通用型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
禽流感病毒的分离鉴定需要从禽鸟采集咽喉拭子或泄殖腔拭子，或从发病及死亡 禽鸟采集内脏器官，用鸡胚进行病毒分离培养，再鉴定血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，最 后通过鸡人工感染进行致病力的测定，这种经典的禽流感病毒检测方法因敏感性高，被OIE 推荐为国际参考方法，但由于诊断周期长，且需要在生物安全三级实验室中进行，因此不 能用于快速检测，而现有的禽流感病毒检测方法，如常规RT-PCR技术、胶体金免疫检测和 ELISA等因敏感性较低，不能直接用于禽类和禽类产品的AIV检测。特别在鱼类养殖水体中的禽流感病毒(avian influenza viruses，AIV)含量十分 低，其含量远远低于普通禽类组织，禽流感病毒的检测较普通禽类组织困难许多，现有的较 ^jl^^WXlli^l^^i^, UR1MM^i RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)及荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)检测方法均无法满足鱼类养殖水体禽流感 病毒快速检测和高敏感性的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效率、敏感性高 的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。本发明所采用的技术方案是本发明涉及的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR 检测方法，包括以下步骤
A 取待测样品提取模板RNA ；
B:设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物(P1、P2)进行一步法 RT-PCR，所述外引物(P1、P2)的序列分别为 Pl :5’ -TATTAGCAAAAGCAGGGTA-3’ P2 :5’ -GTAGTAGAAACAAGGGTATT-3’ ；
C 以上述一步法RT-PCR产物为模板，将内引物(P3、P4)及探针和反应组分置于荧 光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物(P3、P4)及探针序列分别为 P3 :5’ -CGGACGAAAAGGCAACGA-3’ P4 :5’ -CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT-3’ 探针Fam-5，-CGATCGTGCCTTCCTTTGACA-3，-Eclipse ； D 反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT 值判定结果。为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异性，确定最佳退火温度和PCR循环次数， 上述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为50°C 30min,94°C 3min，1个循环；94°C 60s，530C 60s, 720C 120s，30 个循环；72°C延伸 8min。上述步骤C中荧光PCR的反应参数为94°C 10s，45°C 30 s，72°C 60s，3个循环； 94°C 10s,58°C 35s，45个循环后收集荧光。所述步骤B中阳性对照设立方法为选取禽流感病毒RNA为模板，经过克隆筛选正 确的重组克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度 稀释后作为阳性对照；采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性 对照。本发明所涉及的检测试剂盒包括RNA提取试剂、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂、质粒抽 提试剂和PCR反应体系试剂等，其中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光 PCR反应体系；
所述一步法RT-PCR反应体系的组分包括10 μ mol/L的外引物Pl 0. 5 μ L，10 μ mol/ L 的夕卜弓I 物 P2 0. 5 μ L，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1. 0μ L,2X1 Step Buffer 10. 0 μ L，模板 RNA 溶液 2· 0 μ L，DEPC Η20 6. 0 μ L ； 所述荧光PCR反应体系包括如下组分
IXRT-PCR 缓冲液 含 10 mmol/L Tris-Cl, 50 mmol/L KCl，ρΗ8· 3
dNTPs0. 2 mmol/L each
MgCl22. 5 mmol/L
DTT2 mmol/L
甘油5%
Ex TagDNA 酶IU/ μ L
内引物 P30.9 μ mol/L
内引物 Ρ40.9 μ mol/L
探针0.25 μ mol/L。 本发明的有益效果是实时荧光RT-PCR是20世纪90年代末发展起来的一种的 检测方法，其敏感性较常规RT-PCR技术、胶体金免疫检测和ELISA等方法均较高，与经典的 鸡胚病毒分离方法相当，与常规方法相比，在特异、快速、高通量等方面具有巨大的优势，可 快速检测大批量样品。上世纪80年代发展起来的套式PCR技术，多用于普通检测方法难以 检测到的浓度极低的模板(1个或数个copies)，能大大增加扩增的效率和忠实性，对环境 样品中极微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板 的扩增。为提高鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性，本发明建立了敏感性 高于常规荧光RT-PCR的高通量、快速检测方法——禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR方 法，将套式PCR技术与荧光RT-PCR技术相结合，叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的 优势，同时具有荧光RT-PCR快速、高通量的优点，其先进性主要体现在以下几点
1、套式PCR内引物的使用有效地避免了引物设计而产生的非特异性扩增，这样在第二 轮中错误扩增的可能性极低，减少了引物的非特异性扩增，增加了检测的可靠性，因此套式 PCR比普通PCR更特异。荧光探针经去羟基化处理，不会在Taq酶作用下发生延伸。它只 有与待测模板完全匹配的结合，才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光的信号，排除了引 物的非特异性扩增而导致的假阳性。一般情况下，Tagman探针与模板之间的碱基错配超 过4个以上就无法与模板结合，而正式PCR循环(收集荧光步骤)较高的退火温度(55°C
560°C )，排除了模板的非特异性扩增，使得本方法具有较好的特异性，可准确检测AIV。2、套式PCR外引物和内引物的使用，使得靶基因经过两次信号放大，大大增加了 检测的灵敏度，套式PCR比普通PCR更敏感，敏感性一般是普通PCR的100 1000倍，因此 套式PCR技术对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，多用于普通检测方法难以检测 到的浓度极低的模板(1个或数个copies)，能大大增加扩增的效率和忠实性，对于鱼塘养 殖水体中的禽流感病毒这样微量模板的扩增十分有利。荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度，灵敏度大约是肉眼观察 电泳条带的100倍，的因此用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精 度，另外由于本方法在正式PCR循环(收集荧光)之前设置了 3个低温(退火温度为45°C) PCR循环(反应参数为92°C 10s,45°C 30s,72°C 60s)，使得模板在较低的退火温度下得到了 大量的扩增，因此大大提高了本方法的敏感性。3、流感病毒为RNA病毒，如果用病毒作为阳性对照抽提RNA，RNA极不稳定，容易裂 解，在日常检验中容易造成环境污染和病毒扩散，生物安全的风险非常高，不符合生物安全 管理的相关规定。本发明成功构建了扩增目的片段重组质粒，标号为pGEM-NP，测序结果证 实为扩增特异性相关目的片段。抽提质粒后用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production SyStem-T7体外转录试剂盒分别进行体外反转录，按一定浓度进行稀释作 为阳性对照，为避免阳性对照Ct值太高，造成样品之间的污染，Ct值控制在1^25之间，实 际检测中应用方便、避免了生物安全风险。4、核酸提取需要60 min左右，一步法RT-PCR需要180 min左右，实时荧光PCR需 要60 min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为5h，与需耗时半个月才能完成 的鸡胚病毒分离方法相比，大大节省了时间，能快速、高通量的对样品进行检测。
图1是本发明引物及探针套式荧光RT-PCR扩增曲线；
其中A :A/Duck/ffushang/2003 (H5N1)株；B 重组质粒pGEM_NP体外反转录片段；C 阴 性对照；
图2是本发明引物及探针特异性试验结果；
其中 A :A/Duck/ffushang/2003 (H5N1)株；B :H5N2 ；C :H3N2 ；D =HlNl ；E :H6N2 ；F :H9N2 ； G 重组质粒pGEM-NP体外反转录片段；H =NDV ；I =EDSV J 阴性对照； 图3是本发明引物及探针检测稀释质粒的敏感性试验结果； 图4是本发明引物及探针检测H5W病毒的敏感性试验结果。
具体实施例方式下面就对本发明的具体构建步骤作进一步详细阐述，主要包括以下几个步骤 1、套式荧光RT-PCR引物和探针的设计合成
用 Lasergene 基因分析软件，对从 NCBI 下载的 H5m、H5N2、H5N9、H2、H6、H9 AIV, NDV, EDSV的核苷酸序列进行比对，寻找高度保守的区域，选取适当的AIV NP基因相关序列，导 入探针设计软件Primer Express 2. 0分别设计AIV通用型套式荧光RT-PCR引物和Tagman 探针，用DEPC处理水溶解，-80°C避光保存。其外引物PI、P2，内引物P3、P4以及探针见下2、套式荧光RT-PCR反应体系的建立与优化
(1)内引物和探针浓度的优化将荧光PCR反应中的引物和探针浓度从0.1 ymol/L 至1 μ mol/L以0. 05 μ mol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其他条件完全 一致。试验结果显示引物浓度在0.8 ymol/L,0.9 μ mol/L和1.0 μ mol/L都较为合适， 探针的浓度在0.15 ymol/L,0. 25 ymol/L和0. 3 μ mol/L，都较合适，考虑到经济的原因， 选择0. 9 μ mol/L的引物和0. 25 μ mol/L的探针作为荧光RT-PCR检测方法的引物和探针 浓度。(2)MgCl2浓度的优化=MgCl2会影响荧光PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其 他反应成分不变的情况下，采用MgCl2浓度梯度，对MgCl2浓度进行了优化，MgCl2浓度从1. 0 mmol/L开始，以0. 5 mmol/L递加，直到8 mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明MgCl2浓度 越低PCR产物的荧光信号强度越低，而随着MgCl2浓度的增高，扩增效率有所提高，但随着 浓度的不断升高，PCR的扩增受到抑制。经比较结果后最终选定PCR反应体系中的MgCl2浓 度为 2. 5mmol/L。(3) dNTPs浓度的优化dNTPs浓度的高低会影响荧光PCR产物的含量，在固定其 他反应成分不变的情况下，采用dNTPs浓度梯度，对dNTPs浓度进行了优化，dNTPs浓度从 0.1 mmol/L开始，以0.05 mmol/L递加，直到0. 8 mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明采用 MgCl2浓度为2. 5mmol/L时，采用0. 2mmol/L的dNTP为最适。(4) Taq DNA聚合酶(Taq酶)的选择和优化Taq酶(以单位Unit计，简写U)优化 实验酶的用量分别采用0. 5U、1U、1. 5U、2U、2. 5U、3U和3. 5U。荧光PCR检测结果表明Taq酶 用量在1U、1. 25U、1. 5U和2. 5U都较合适，从经济和效果双重考虑，最终选择IU作为RT-PCR 反应体系的最适酶量。(5)最佳退火温度和PCR循环数的确定为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异 性，根据设计的引物退火温度，以55°C为基础，以0. 5°C递加，直到62°C。将细菌DNA模板采 用极限梯度稀释法进行PCR实验，采用循环次数为35、40和45。实验结果显示58°C作为退 火温度较为合适，扩增循环数45个循环即可达到检测的极限。(6)优化后的套式荧光RT-PCR检测条件经优化，确定了同时适合于AIV通用型 套式荧光RT-PCR检测的总体积为20μ1的最佳反应体系及反应参数，各组分及浓度见下表。
荧光素设定Iteport Dye设定分别为FAM，Quench Dye都设定为Eclipse， Reference dye 设定为 None。
权利要求
1.一种禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤 A 取待测样品提取模板RNA ；B 设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物(PI、P2)进行一步法 RT-PCR，所述外引物(P1、P2)的序列分别为 Pl :5’ -TATTAGCAAAAGCAGGGTA-3’ P2 :5’ -GTAGTAGAAACAAGGGTATT-3’ ；C 以上述一步法RT-PCR产物为模板，将内引物(P3、P4)及探针和反应组分置于荧 光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物(P3、P4)及探针序列分别为 P3 :5’ -CGGACGAAAAGGCAACGA-3’ P4 :5’ -CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT-3’ 探针Fam-5，-CGATCGTGCCTTCCTTTGACA-3，-Eclipse ； D 反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT 值判定结果。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于， 所述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为50°C 30min,94°C 3min，1个循环；94°C 60s， 53°C 60s, 72°C 120s，30 个循环；72°C延伸 8min。
3.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在 于，所述步骤C中荧光PCR的反应参数为94°C 10s,45°C 30 s，72°C 60s，3个循环；94°C 10s,58°C 35s，45个循环后收集荧光。
4.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于， 所述步骤B中阳性对照设立方法为选取禽流感病毒RNA为模板，经过克隆筛选正确的重组 克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度稀释后作 为阳性对照。
5.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于， 所述步骤B中采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。
6.一种用于权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法的检测试 剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光 PCR反应体系；所述一步法RT-PCR反应体系的组分包括10 μ mol/L的外引物Pl 0. 5 μ L，10 μ mol/ L 的夕卜弓I 物 P2 0. 5 μ L，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1. 0μ L,2X1 Step Buffer 10. 0 μ L，模板 RNA 溶液 2. 0 μ L，DEPC H20 6. 0 μ L ； 所述荧光PCR反应体系包括如下组分IXRT-PCR 缓冲液 含 10 mmol/L Tris-Cl, 50 mmol/L KCl, pH8. 3 dNTPs0. 2 mmol/L each内引物 P4 0.9 μ mol/L 探针0.25 ymol/Lc
全文摘要
本发明公开了一种高效率、敏感性高的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。该方法利用两套PCR引物(1对外侧引物和1对内侧引物)进行两轮PCR扩增的方法，即将外侧引物进行PCR扩增后的产物作为内侧引物进行PCR扩增的模板，内侧引物与模板DNA的结合位点处于外侧引物扩增出的DNA片段内侧，套式PCR对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效。本发明相比于普通检测方法难以检测到的浓度极低的模板(1个或数个copies)，能大大增加扩增的效率和忠实性，对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增，能完全满足鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性的要求。
文档编号C12Q1/68GK102071264SQ201010576700
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者廖明, 廖秀云, 徐海聂, 杨素, 沙才华 申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局