/ml 的氨节青霉素，其中TB3液体培养基组成为；酵母浸粉3g/L、酸水解酪素3g/L和庶糖200g/ L，28°C，lOOr/min摇床振荡培养 16h。
[0034] 将原生质体再生物5000r/min离屯、lOmin，弃上清并用200y1STC重悬沉淀。将 重悬液加入10ml的含低烙点琼脂糖的TB3培养基中，加入终浓度为300yg/ml的潮霉素和 终浓度为100yg/ml的氨节青霉素，混匀后倒板，28°C培养过夜。表面覆盖10ml含低烙点 琼脂糖和终浓度300yg/ml的潮霉素的TB3培养基。26°C培养箱避光培养3~5山将得到 的转化子转接到含终浓度为300yg/ml的潮霉素的PDA培养基上，连续转接S代，获得稳定 遗传的转化子。
[0035] 对获得的转化子提取RNA，并通过反转录试剂盒获得cDNA，W转化子cDNA为模板， WhphF和hphR为上下游引物进行PCR扩增，扩增到潮霉素片段的为阳性转化子。hphF: (5' -3' )ATGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG，h地R;CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG。PCR条件为； 95°C预变性5min，按W下步骤进行30个循环；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin。 最后在72°C下保持lOmin。随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性转化子。
[0036] 实施例4
[0037] 工程菌株&-chi32中的几了质酶活性测定
[003引首先制备胶体几了质：取几了质lOg，缓慢加入预冷的200ml浓盐酸中，揽拌至几 了质溶解，4°C下放置2化，加入到化4°C预冷的50%己醇中揽拌成胶体状，40(K)r/min离屯、 lOmin取沉淀，沉淀用无菌水反复洗漆至中性，离屯、去多余水分，调整浓度至1 %。
[0039] 将阳性转化子和野生株接种于含有1%菌核粉的PD液体培养基中，28°C下摇床振 荡培养4d。发酵液4°C，600化/min离屯、20min，上清液作为粗酶液。分别取0. 4ml粗酶液、pH5. 8的磯酸缓冲液和1%胶体几了质混合均匀，置于37°C水浴锅中水浴2h。然后lOOOr/ min下离屯、lOmin，取0. 4ml上清，加入40y1 30%的蜗牛酶溶液，37°C水浴30min，加入饱 和棚砂溶液0. 2ml，100°C沸水浴7min，冷却后加入1ml1%DMAB(对二甲氨基苯甲醒）溶液 和0. 2ml冰醋酸，37°C水浴15min等待显色，使用分光光度计在585nm波长下测定吸光值。 结果显不化-chi32园株几了质酶重是野生园株HLD-1的1. 9倍。
[0040] 实施例5
[0041] 工程菌株化-chi32中的几了质酶基因表达量的测定
[0042] 采用实时巧光定量PCR法测定转化工程菌株化-chi32和野生株HLD-1中几了 质酶基因的表达量，W延伸因子作为内参基因。使用Prime巧软件分别设计延伸因子和 几了质酶巧光定量引物。EFF;TCGATGTCGCTCCTGACT，EFR;AGCGTGACCGTTTATTTGA，chiYF; GTTGTGGTTTGCCTGGTG，chiYR;CCGATACTCTGCTGCTCAT。将各样品cDNA浓度稀释 10 倍后，使 用SYBRGreen法进行巧光定量PCR。PCR反应体系为；SYBRPremix12. 5yl，cDNA模板 2yl，上下游引物各lyl，W及(1化0 8. 5yl。反应条件为；95°C变性2min，按W下反应40 个循环；95°C变性10s和60°C退火30s。从55°C到85°C每隔0. 5°C采集一次巧光，相对表 达量的计算采用法。每个反应3次重复。通过表达量计算表明，工程菌株化-chi32 几了质酶基因表达量是野生菌株的90倍。
[0043] 实施例6
[0044] 工程菌株&-chi32对大豆核盘菌菌核的寄生性测定
[0045] 胡萝h切片、灭菌，接种培养好的核盘菌菌块。26°C下培养lOd后，将培养物倒于 10目的筛网中，自来水反复冲洗，去除残留培养基，收集菌核。挑取大小一致的菌核，分别用 75%己醇和1 %化CIO消毒，在重组工程菌株化-chi32抱子悬液中浸泡15min，然后置于无 菌滤纸上保湿培养。解剖镜下观察，她时菌核上开始有化-chi32菌丝长出，到12h，有一半 的菌核被侵染，1化菌核寄生率达到100%。野生菌株培养1化开始寄生，1化寄生率达到 43. 3%，2化后观察到全部供试菌核长出寄生菌菌丝。
[0046] 实施例7
[0047] 工程菌株&-chi32温室防治大豆菌核病试验
[0048] 日光温室播种大豆种子，每盆4粒。出苗后间苗至每盆2株。待长至9片复叶，叶 子正、背面均匀涂抹化-chi32菌株抱子悬液，浓度5X106CFU/ml。化后，喷雾接种浓度为 3XlOVml的菌核病菌发酵液。保湿培养，日间温度26°C，夜晚15°C。7d后按9级分级标 准调查大豆叶片发病情况，计算病情指数和防效，W清水和98%多菌灵1000倍稀释液为对 照。对大豆菌核病防效，&-chi32工程菌株达到81. 4%，比野生菌株和多菌灵处理分别提 高 31. 7%和 28. 7%。
【主权项】
1. 一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-chi32,其特征在于， 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏登记号为CGMCC No. 10027。2. 如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于工程菌株Cr-chi32中的几丁质酶基因具 有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。3. 如权利要求1所述的工程菌株Cr-chi32的构建方法，其特征在于具体步骤为： 1) 对PAN7-1载体通过酶切获取线性化pAN7-l载体，将线性化pAN7-l载体与几丁质酶 目的基因融合拼接，获得过表达载体； 2) 将粉红螺旋聚孢霉HLD-I菌株进行培养，筛选收集幼龄菌丝，将幼龄菌丝与蜗牛酶 进行混合酶解，过滤并离心，收集原生质体沉淀物，用STC溶液溶解后获取原生质体溶液； 3) 将过表达载体与原生质体溶液混合静置，通过液体培养基TB3进行复苏，振荡培养， 离心去除上清，通过STC溶液悬浮沉淀后，与TB3培养基混合、倒板培养，挑取转化子。4. 如权利要求1-2所述的工程菌株Cr-chi32在植物病害防治中的应用。5. 如权利要求1-2所述的工程菌株Cr-chi32在制备植物病害防治药物中的应用。6. -种菌剂，其特征在于该菌剂中包含工程菌株Cr-chi32。7. -种如权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：将重组菌株 Cr-chi32接种于PDA平板上培养7~10d，从平板上切取菌块，接入培养液中，振荡培养， 最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获得菌剂。8. 如权利要求6所述的菌剂在植物病害防治中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-chi32，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏登记号为CGMCC No.10027。该工程菌株Cr-chi32增强了粉红螺旋聚孢霉的抗病性能，提高了防效稳定性，同时能够有效应用于植物病害的防治，尤其是可以用来防治农作物菌核病、灰霉病，同时对枯萎病、根腐病等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。CGMCC No.1002720141128
【IPC分类】C12N15/56, C12R1/645, C12N15/80, C12N1/15, A01P3/00, A01N63/04
【公开号】CN104988080
【申请号】CN201510137425
【发明人】李世东, 孙漫红, 孙占斌
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年3月27日