提高植物的胁迫耐性的人工融合基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高植物的胁迫耐性的人工融合基因及其应用。该基因具有的多核苷酸序列包含：（a）编码水稻GPDH蛋白的NAD(P)结合功能结构域的多核苷酸序列；和（b）编码大肠杆菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脱氢酶功能结构域的多核苷酸序列。本发明的人工融合基因，能够用于制备水稻等转基因植物，提高植物的抗胁迫耐性的能力。
【专利说明】提高植物的胁迫耐性的人工融合基因
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及提高植物的胁迫耐性的人工融合基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长过程中会遭遇到各种各样的非生物逆境，诸如干旱、高低温和滞涝等自然灾害，常造成农作物大量减产，另外，在我国，耕地缺磷也是一种常见的非生物胁迫环境(我国有半数以上的耕地缺磷，生产中经常大量施用磷肥以保证粮食产量(李永夫等，应用生态学报，2005，16 (I):119-124))。因此，植物非生物胁迫生物学是农业科学技术研究的重要目标之一。例如，当前一个重要的育种手段是尝试将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。
[0003]科学研究发现，为抵抗不良的外界环境的胁迫，植物体细胞感受外界环境的变化并将信号传递到细胞内，会诱导细胞表达各种应答基因共同来抵御不良环境对植物体的伤害。信号传递分子在植物抗逆/耐受胁迫的过程中发挥了关键作用。例如，甘油-3-磷酸(又称3-磷酸甘油，Glycerol-3-phosphate, G_3_P)不仅是各种甘油酯物质(诸如膜脂等)合成的前体物，同时也是植物体内信号小分子物质，在植物的抗逆过程中起关键性作用。
[0004]甘油-3-磷酸是细胞膜质膜中磷脂的重要前体物，其含量的变化对质膜磷脂的构成有明显影响。再者，实验研究已经证明，拟南芥细胞内的甘油-3-磷酸的表达水平的高低反映了其抗病能力，证明了甘油-3-磷酸是植物系统获得抗性的强有力的诱导者，是植物免疫系统中重要的成员。
[0005]由于甘油-3-憐酸脱氧酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase,又称 GPDH蛋白)是植物产生甘油-3-磷酸的关键酶之一。其由两个结构域组成，在其N端结构域为NAD (P)结合功能结构域，其主要功能是结合NAD+/NADP+，其C端为NAD_Gly3P脱氢酶水解功能结构域，其主要功能是催化利用NADH和二羟基丙酮磷酸酯产生甘油-3-磷酸。
[0006]为提高植物细胞中甘油-3-磷酸的表达水平，一般的做法是提高植物细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达水平。科学家们尝试将在植物细胞中不具有反馈作用的细菌来源的甘油-3-磷酸脱氢酶基因来转化拟南芥,参见文献Shen W et al, The Journal ofBiological Chemistry, 2010, 285: 22957 - 22965，拟南芥细胞内过量表达 gpsAFK 基因(经改造后的细菌来源的甘油-3-磷酸脱氢酶基因)改变了大量的磷脂代谢相关基因表达量，改变了膜磷脂中脂肪酸构成和膜脂成分。科学家们也尝试着将该基因导入油菜的基因组中，发现该基因在实验室条件下能够改善油菜在低磷条件下的生长，并抵抗一定的渗透胁迫，但是仅是在实验室条件下能够实现。直接使用细菌来源的基因进行植物改良其效果有限。再者，目前暂未发现该gpsAFR基因应用于水稻或其他经济作物。
[0007]目前，需要一种新的抗性基因，能够提高植物的胁迫耐性，并且能够更广泛地适用于水稻以及其他经济作物。
【发明内容】
[0008]本发明一方面提供了一种提高植物的胁迫耐性的人工融合基因，其中，
该基因具有的多核苷酸序列包含:
(a)编码水稻GPDH蛋白的NAD(P)结合功能结构域的多核苷酸序列；和6)编码大肠杆菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脱氢酶功能结构域的多核苷酸序列。
[0009]在本发明的一个优选实施方案中，所述的(b)为采用植物偏好性密码子人工合成的序列。在本发明的一个更优选实施方案中，该人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQID N0.1所示序列。另外，发明人将SEQ ID N0.1所示核苷酸序列命名为基因。优选的，该人工融合基因编码的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。
[0010]本发明另一方面提供了含有上述人工融合基因的重组载体。
[0011]本发明的再一方面提供了上述重组载体转化的宿主细胞。
[0012]本发明另一方面提供了一种生产胁迫耐性的转基因植物的方法，其中:
该方法包括以下步骤:
1)将权利要求1所述的人工融合基因可操作地连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体；
2)将步骤I)所得的植物表达载体转入植物细胞；
3)经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代，所述的植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。
[0013]在本发明的一个优选的实施方案中，所述的植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘或黄瓜中任意一种。
[0014]本发明另一方面还提供了上述的人工融合基因在制备具有胁迫耐性的转基因植物方面的用途。
[0015]本发明的人工融合基因，能够用于制备转基因植物，提高植物的抗胁迫耐性的能力，尤其是抗旱、高温、低磷、耐渗透胁迫的能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为各种植物GPDH蛋白比对图:
采用ClustalW软件将各种植物的野生型GPDH蛋白序列进行比对分析；图中Glycine表不大豆(Glycine max),序列 ID 为 XP_003553315 ；Medicago 表不苜猜(Medicagotruncatula),序列 ID 为 XP_003622291 ；Cucumis 表不黄瓜(Cucumis sativus),序列 ID 为XP_004156696 ；Citrus 表不柑橘(Citrus Clementina),序列 ID为XP_006446670 ；Ricinus表不蓖麻(Ricinus communis),序列 ID 为 XP_002526956 ;Solanum 表不马铃薯(Solanumtuberosum),序列 ID 为 XP_006357169 ；Setaria 表不黍(Setaria italic),序列 ID 为XP_004971422 ；Zea 表示玉米(Zea mays)，序列 ID 为 ΝΡ_001150493 ;Sorghum 表示高粱(Sorghum bicolor),序列 ID 为 XP_002459175 ;0razy 表不水稻(Orazy sativa),序列 ID为 0s01g0971600 ；Hordeum 表不大麦(Hordeum vulgare),序列 ID 为 BAK07844 ；Triticum表示小麦(Triticum aestivum),序列ID为AGS79224 ;图中下划线，实线表示NAD (P) _b结构域，虚线表示NAD_Gly3P_DH结构域。
[0017]图2为表达载体PCB4004- OEGD的构建示意图。[0018]图3为在转基因水稻叶片中基因表达水平图。采用实时RT-PCR方法检测OEGD基因在转基因水稻叶片中表达量，其中，横轴的XQ表示品种湘晴对照(非转基因水稻)，编号H1G072-094表示不同转64^?基因株系；纵轴表示=1g2 (转基因与对照XQ表达量倍数)。
[0019]图4为转基因水稻低磷处理后株高图。(当水稻生长到4叶期时，开始使用无磷配方营养液浇灌水稻，无磷浇灌10天后统计植株的高度；其中，横轴的XQ表示湘晴对照(非转基因水稻)；编号H1G072-78为转^^^基因水稻；纵轴表示:水稻幼苗植株高度(单位为厘米)；*表示与对照的t-test显著性分析P<0.05, **表示P < 0.01。
[0020]图5A为渗透胁迫处理后水稻株高图；图5B为渗透胁迫处理复水后水稻死亡率图；当水稻生长到4叶期时，开始使用含20% PEG6000的营养液浇灌水稻，处理7天后使用正常营养液复水处理，3天后统计植株的高度和死亡率；图5A和图5B的横轴中，XQ表示湘晴对照，为非转基因水稻；编号H1G072-78为转OEGD基因水稻；图5A的纵轴表示:水稻幼苗植株高度(单位为厘米)；图5B的纵轴表示死亡的植株数占总植株数的比例；*表示与对照的t-test显著性分析P < 0.05, **表示P < 0.01。
[0021]图6为高温胁迫处理后水稻株高图；(当水稻生长到4叶期时，将幼苗移置到高温大棚中，高温环境下生长12天后，移植到室温进行株高统计，单位为厘米；图6的横轴中，XQ表示湘晴对照(非转基因水稻);编号H1G072-78为转^^^基因水稻；图6的纵轴表示水稻幼苗植株高度(单位为厘米);*表示与对照的t-test显著性分析P ( 0.05,**表示P < 0.01。
[0022]图7为转64--基因水稻叶片中SOD含量图；当水稻生长到4叶期时，20% PEG6000处理3天后取幼苗叶片，测定叶片中SOD含量；图7的横轴中，XQ表示湘晴对照(非转基因水稻)，编号H1G072-87为转OEGD基因水稻；图7的纵轴表示每毫克鲜重叶片中SOD单位活性；*表示与对照的t-test显著性分析P < 0.05, **表示P < 0.01。
[0023]图8为转64--基因水稻在海南大田干旱胁迫下单株平均产量图；当水稻进入幼穗分化时期，开始进行旱管种植。成熟后拷种统计产量；湘晴对照为非转基因水稻；图7的横轴中，湘晴为对照(非转基因水稻)，编号H1G070-87为转撕似基因水稻；纵轴表示平均每株产量，单位克。
[0024]图9为转64--基因水稻在上海大棚干旱胁迫下单株平均产量图；每个株系单株种植，左右种植对照；当水稻进入幼穗分化时期，开始进行旱管种植；成熟后拷种统计产量；转基因植株产量与相邻的对照植株进行产量比较；图9的横轴中，湘晴对照(非转基因水稻)，编号H1G070-87为转OEGD基因水稻；纵轴表示每株产量，单位克；*表示与其相邻对照的t-test显著性分析P^0.05, **表示P ^ 0.010
【具体实施方式】
[0025]在本文，术语“分离的”、“纯化的” DNA或基因是指，该DNA或基因片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或基因片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。 [0026]在本发明的一个具体实施方案中，一种提高植物的胁迫耐性的人工融合基因，该基因具有的多核苷酸序列包含:
Ca)编码水稻GPDH蛋白的NAD (P)结合功能结构域的多核苷酸序列；和(b)编码大肠杆菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脱氢酶功能结构域的多核苷酸序列。
[0027]所述的(a)和(b)序列包括野生型的多核苷酸序列和能够编码相同功能蛋白的变异形式，该变异形式是野生型序列的开放阅读框部分发生核苷酸缺失、插入和/或取代后获得的。这些变异形式包括，但并不限于:若干个(通常为1-90个，较佳的1-60个，更佳的1-20个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳的为30个以内，更佳的为10个以内，最佳的为5个以内)核苷酸。
[0028]在本发明的一个具体实施方案中，本发明的提高植物的胁迫耐性的人工融合基因由(a)和(b)序列组成，即(a)和(b)序列直接连接而成。在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的提高植物的胁迫耐性的人工融合基因是(a)与(b)序列通过一段连接子序列连接而成，该连接子序列不影响蛋白的编码，不影响最后形成的蛋白的功能。
[0029] 在一个优选的实施方式中，所述的(b)为采用植物偏好性密码子人工合成的序列。
[0030]蛋白质中每一个氨基酸对应于不同的密码(少的一个，多的有6个)，不同物种使用不同密码的频率不一样。植物使用秘码偏好性有公共数据提供Codon Usage Database(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)。故改变密码使用偏好,无法在现存的物种中找到,就必须进行人工合成。采用植物偏好性密码子人工合成序列是本领域技术人员所熟知的技术手段。
[0031]该人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1所示序列。在本发明的一个具体实施方案中，该人工融合基因的序列如SEQ ID N0.1所示序列。发明人将SEQ ID N0.1所示核苷酸序列命名为OEGD基因。
[0032]本发明的人工融合基因的多核苷酸序列还包括能编码具有OEGD相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
[0033]在本发明的人工融合基因的多核苷酸序列，还包括指编码具有OEGD相同功能蛋白的SEQ ID N0.1序列的简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQID N0.1序列同源性低至89%的简并序列也能够编码出SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID N0.1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.1核苷酸序列同源性至少89%，较佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。
[0034]该人工融合基因编码的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。在本发明的一个具体实施方案中，该人工融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示序列，即
基因编码的蛋白，发明人将该蛋白命名为OEGD蛋白。
[0035]在本发明中，还包括具有与OE⑶相同功能的、SEQ ID N0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0036]蛋白的同源性百分比由GAP (Needleman和Wunsh , 1970)分析(GCG程序)确定，其中参数 gap creation penalty = 5，gap extension penalty = 0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
[0037]通过本领域已知的方法可以合成、分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
[0038]本发明所分离合成的人工融合基因的多核苷酸，包括但不限于:SEQ ID N0.1编码OE⑶基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID N0.1中从核苷酸第1-1062位的核苷酸序列杂交；或者其 功能相当于SEQ ID N0.1所示序列的亚片段。
[0039]用于本发明的人工融合基因的重组载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998, Method for PlantMolecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp.411—463; Geiserson andCorey, 1998， Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0040]已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端或重组酶使多核苷酸与载体可操作地相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段末端添加特异设计的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子；或者利用DNA重组原理，使用特定的重组酶进行重组反应，形成重组DNA分子。
[0041]术语“可操作地相连”表示如下情况:即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连接于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连接于编码序列。一般，“可操作地连接于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0042]多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λ PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
[0043]如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如:新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因npt I1、潮霉素憐酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase)基因dhfr ;另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyl transferase)基因bar、5_烯醇丙酮酸草酸_3_憐酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。适当宿主的代表性例子包括但不限于:原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
[0044]目的基因或目的多核苷酸的转化方法:一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant),即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。
[0045]本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞,所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。
[0046]通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。
[0047]在本发明的一个具体实施方案中，一种生产胁迫耐性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤:
1)将权利要求1所述的人工融合基因可操作地连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体；
2)将步骤I)所得的植物表达载体转入植物细胞；
3)经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代，所述的植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。
[0048]上述的“人工融合基因可操作地连接于植物表达调控序列”，是指将人工融合基因序列有效连接至植物组成性表达或胁迫诱导表达启动子。
[0049]所述的植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘或黄瓜中任意一种。在本发明的一个具体实施例中，将OEGD基因的载体转入水稻细胞中获得转OEGD基因水稻。
[0050]由于水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘和黄瓜的GPDH蛋白序列的高度的同源性，参见下述的实施例1，因此，能够适用于水稻细胞的人工融合基因，也能够适用于玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘和黄瓜，这是本领域一般技术人员根据本领域公知常识所能够推测到的。
[0051]以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0052]实施例1:植物GPDH蛋白序列比对
从NCBI基因数据库平台(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下载水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、柑橘、蓖麻等物种的GPDH蛋白的氨基酸序列(其中，水稻的GPDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.7)，采用ClustalW软件将植物GPDH蛋白序列进行比对分析，具体结果见图1。从图1可以看出，这些来源于双子叶和单子叶物种的GPDH蛋白十分保守，无论是NAD(P)结合功能结构域还是NAD_Gly3P脱氢酶结构域，其序列相似性十分高，且这些蛋白之间的功能也是极其相似的。
[0053]因此，在基因操作中，相同功能的结构域基因在上述的这些植物物种中互换对基因功能影响很小。
[0054]当然，植物来源的GPDH蛋白与大肠杆菌来源的gpsA蛋白同源性很低，例如，水稻GPDH蛋白和大肠杆菌gpsA蛋白(ID accession: P37606)的一致性仅为21.4%,考虑同性质氨基酸因素，其相似性也仅为35.1%。将植物来源的NAD(P)结合功能结构域与细菌来源的NAD_Gly3P_DH结构域进行 人工融合，无论使用何种植物序列，其对人工融合基因功能影响将十分小。即本发明中NAD(P)结合功能结构域可以使用不同植物来源的序列，而NAD_Gly3P_DH结构域使用大肠杆菌来源序列，不影响融合基因功能的表现。
[0055]本发明以水稻作为下面实施例的植物来源。
[0056]实施例2:合成分离克隆OEGD基因
从 NCBI 数据库平台(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下载水稻 0s01g0971600 和细菌P37606序列。首先分离克隆水稻GPDH基因。采用TRIzol试剂(GIBCO BRL, USA)抽提水稻叶片总RNA。利用反转录酶MLV (Tiangen，China)将其反转录成cDNA。用引物GPDF(5， - atggagaacggacacgccaagaatc-3，)和弓丨物 GGR (5， - gctggactccaatgaagtcctctacaacagaaaccagg -3’)，扩增含基因NAD (P)结合功能结构域cDNA的PCR产物。PCR反应条件为:94°C预变性 3min ；94°C 30sec, 60°C 30sec，72°C 90sec 共 35 个循环；72°C延伸 5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(Promega，USA),筛选阳性克隆并测序，获得OsGPDH基因的部分cDNA序列(SEQ ID N0.3)。然后参照细菌gpsA蛋白序列(SEQ ID N0.5)，按照水稻密码子偏好在DNA合成仪上人工合成细菌gpsA的NAD_Gly3P脱氢酶结构域(SEQID N0.4) ο 以合成序列为模板，用引物 GGF (5’_cctggtttctgttgtagaggacttcattggagtccagc-3’)和引物 gpsAR (5，- cagtgactggagcgctcgtcc-3’)，扩增含合成 DNA 片段的 PCR 产物。PCR反应条件同上。随后将两个PCR产物混合，进行94°C变性3min，然后以每秒降低1°C使温度逐渐降低到60°C，加Taq酶在72°C延伸5min。最后添加引物GPDF和gpsAR，扩增包含水稻NAD (P)结合功能结构域和大肠杆菌NAD_Gly3P脱氢酶结构域的人工合成基因。PCR反应条件同上。将PCR产物装入pGEM-T载体(Promega, USA)，筛选阳性克隆并测序，获得OEGD基因的cDNA序列(SEQ ID N0.1)。
[0057]实施例3 ,OEGD基因超表达载体的构建和遗传转化
3.1含目的基因表达载体的构建:根据^^^基因的全长序列(SEQ ID N0.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物和下游引物上分别引入BP Clonase ?酶重组序列位点，以便通过GATEWAY?技术构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真Taq酶pfu酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，将OEGD基因cDNA克隆至中间载体(如pD0NR207)，进一步转化大肠杆菌DH5a，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，使用PCB4004植物表达质粒进行LR Clonase "*酶重组，这样就将基因两头分别加入了 CAMV35S转录启动子和终止子，构成了一个包含64--基因完整表达单元的植物表达载体PCB4004::0E⑶中，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。
[0058]3.2水稻遗传转化 3.2.1种子消毒
成熟的湘晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3_4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS + 2,4- D 2.0 mg/L)上，每皿约30粒，于28 °C暗培养。
[0059]3.2.2继代培养
经过近I月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2_4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
[0060]3.2.3农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在Iml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28°C培养5-6hr至0D600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS,终浓度IOOuMX取上述菌液在室温下,4000rpm, IOmin,弃上清，加入MS液体培养基(含AS IOOuM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的0D600=0.5-1,此时可用来转化愈伤组织。AS=acetosringone乙酰丁香酮。
[0061]3.2.4 共培养
将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM)上，28°C暗培养三天。
[0062]3.2.5 洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400 mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
[0063]3.2.6选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L +Cef 400 mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L +Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L)上，再选择 2 周。
[0064]3.2.7分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6 + KT 2.0 mg/L + NAA0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 200 mg/L + 琼月旨 9g/L + 鹿糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6 + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0mg/L + Hyg 30 mg/L + 琼脂 4.5g/L + 鹿糖 30 g/L)上光照培养。
[0065]3.2.8生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS + Hyg 15 mg/L +琼脂4.5g/L +蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。
[0066]3.2.9转基因苗的移栽
当幼苗长至IOcm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
[0067]3.3烟草的遗传转化
3.3.1烟草无菌苗的快繁
先将烟草种子用75%乙醇浸泡0.5min，再用2%NaC10浸泡lOmin，无菌水冲洗3_4次，用无菌吸水纸吸干水分，接种于MS培养基上，25°C下光照培养，即可获得烟草无菌试管苗。切取烟草无菌试管苗的叶片，去掉其主叶脉和叶缘，将其剪成约Icm2见方的小叶片，接种于芽分化培养基MSl中，待芽长出以后，切取单个芽接种于MS培养基中，20天左右即可长成植株。
[0068]3.3.2农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在Iml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm, 28°C振荡培养过夜；室温下4000rpm，IOmin,弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr,使菌液的0D600=0.5左右。
[0069]3.3.3农杆菌侵染
取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉和叶缘，将其剪成约Icm2见方的小叶片。将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5 min 190rpm，在无菌滤纸上吸干多余菌液。
[0070]3.3.4 共培养
将吸干的叶片外植体放在愈伤组织诱导或分化培养基MSKMS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA
0.1 11^/1)，251:暗培养48111.。
[0071]3.3.5选择培养
将经过共培养的叶片外植体转入加有选择压的脱菌分化或愈伤组织诱导培养基MS29MS +6-BA 1.0 mg/L + NM 0.1 mg/L + Hpt 50 mg/L + Cb 250mg/L)上，叶片背面向下，边缘压入培养基中，25°C光照下培养。培养7-15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出。
[0072]3.3.6生根培养
待芽长大后，切下，置于含有选择压的生根培养基MS3(1/2MS + NAA 0.5mg/L + Hpt25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右长出不定根。
[0073]3.3.7转基因烟草的移栽
等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
[0074]实施例4 'OEGD基因超量表达转基因植株表达量分析
4.1材料准备
将实施例3.2获得的转基因水稻植株T2代种子和对照品种湘晴种子发芽后，移植于液体培养基(国际水稻所水稻水培营养液,配方见http://irr1.0rg/)。幼苗生长15 d后,剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。
[0075]4.2无DNA的总RNA制备
按上海华舜生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman Coulter ? DU?640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5 μ g，加入I μ L DNAase
I (美国Invitrogen公司)和I μ LlOX反应缓冲液，补足体积至10 μ L，常温反应30
min，然后每管加入IyL 2 mmol L-1 EDTA终止反应，最后在70°C加热10 min使DNAase I失活。
[0076]4.3第一链cDNA的合成
将上述RNA样品各取2 μ L,按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μ L 25 mmol L-1 MgCl2, 2 μ LlOXRT 缓冲液，2 μ L dNTP混和液和 I μ L oligo(dT) 15,加水补足体积到18.5 μ L，在70°C加热变性10 min,快速在冰上冷却。然后加0.5 μ LRNase inhibitor 和 I yL AMVRTase，在 42 °C 水浴 60 min，70°C 下加热 10 min 终止反应。
[0077]4.4 定量 PCR
根据基因见必的序列设计特异性引物RF: 5’- agcttgcccaccgcttcggag _3’，RR:5，-cagtgactggagcgctcgtcc-3?用于突光定量 PCR,根据 Actin (GenBank accessionN0.AY212324)基因的 cDNA 序列设计特异性引物 AF: 5’ -cttcctcatgccatcctgc-3’，ar:5’-gcaagcttctccttgat gtcc-3’用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国ABI PRISM?7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含SYBR Premix Ex Taq?(2X)10μ L,正反向引物各0.5 μ L,各种处理的cDNA模板I yL,加水补足体积至25 μ L。反应程序为:95°C 30 s，然后在95°C10 s,61°C 34 s下循环40次，设定在每个循环中60°C 34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取Iμ L RNA作为模板进行PCR，方法同上。
[0078]4.5分析方法
Ct是通过7000 system SDS Versionl.2.3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0.2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2_" "CT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图(-Λ ACT)。
[0079]4.6分析结果
从图3可以看出，6好似基因在转基因水稻株系H1G072-094中均得到高表达，其表达量与对照相比，均超过100倍，最高表达量甚至超过500 (29)倍，表明这些转基因植株中OEGD基因在水稻中能够正常地高表达，可以进一步进行下一步检测试验。
[0080] 实施例5 'OEGD基因超量表达转基因植株在实验室条件下耐逆试验
5.1材料准备
将实施例3.2获得的转基因水稻T2代种子和对照品种湘晴种子发芽后，移植于液体培养基(国际水稻所水稻水培营养液，配方见http://irr1.0rg/)。幼苗生长到4叶时,开始进行耐渗透胁迫、耐低磷和高温试验。
[0081]5.2胁迫处理
对于低磷处理，将原营养液配方中的NaH2P04-2H20在重新配制营养液时不添加,然后每隔3天换一次营养液，在第10天观察幼苗生长高度。
[0082]对于渗透胁迫处理，将营养液中添加200克PEG6000每升，PEG6000处理10天后
换正常营养液，观察幼苗生长和死亡情况。
[0083]对于高温处理，夏季高温期间，将幼苗移植到密闭玻璃温室中，其昼夜温度范围在30-55°C之间，营养液水温最高超过52°C，培养12天后观察幼苗生长状况。
[0084]为了了解这些转基因植株提高植物耐逆性能力的生理生化原因，将20% PEG6000处理3天的幼苗取叶片，测定叶片中SOD (超氧化物歧化酶)含量。液氮研磨叶片，取0.05g样品粉末，加Iml生理盐水(0.86%)，匀浆，3500-4000转/分钟离心10min，取上清测定。试剂盒采用南京建成生物研究所总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(货号:A001-1羟胺法)。
[0085]5.3分析结果
使用低磷营养液浇灌水稻幼苗10天后，4个转基因株系中，有3个转基因株系H1G072、073和074其株高高度显著或极显著高与对照植株，表明这3个转基因株系耐受低磷能力明显高于对照，见图4。说明水稻中过量表达64--基因后明显提高了水稻耐受低磷营养的能力，能够促进植物在磷营养贫瘠的土地上正常生长。
[0086]使用PEG6000处理幼苗，发现3天后转基因植株和对照植株之间呈现明显差异，处理时间到第7天时，对照植株开始死亡。第10天复水后统计植株的成活率和生长状况，编号H1G072-74转基因植株不仅株高极显著高于对照，而且其死亡率低于5%，而对照死亡率超过30% (见图5)。说明超表达该基因后明显提高了水稻的抗渗透胁迫能力，以及复水后恢复生长的能力。
[0087]在高温培养间中，对照植株的生长开始受到抑制，随着时间的延长，对照植株生长缓慢甚至停止，但对照转基因植株依然能够较好的生长，其株高显著明显优于对照(见图6)，说明转基因植株在高温条件下有很好的修复功能，能保证植株在有一定的昼夜温差的条件下维持植株的正常生长。
[0088]PEG6000处理后检查水稻植株叶片中SOD含量，发现转基因植株中含量均显著高于对照植株(见图7)，说明转基因植株在胁迫来临后积极改变植株体内的生理生化反应，来抵抗不良的外界环境。
[0089]实施例5 ,OEGD基因超量表达转基因水稻在田间抗旱试验
选取了实施例3.2中所获得的基因超量表达转基因T2代家系植株(编号H1G070、71、72、81、83、85和87)进行了穗期干旱胁迫试验，本实验分别在海南和上海进行。首先将转基因植株T2代种子和对照品种湘晴种子催芽后在田间播种。3个星期后将幼苗移栽。海南省冬季干旱胁迫试验如下:每份材料种植3行，每行7株，当群体内大部分材料进入幼穗分化时期(水稻对水分最敏感时期)，开始排空田间水分，大约2个星期以后，田间开始出现部分植株卷叶，表明开始出现干旱胁迫症状。当大部分植株结实并成熟，收获种子称重，统计单株平均产量。结果表明，干旱胁迫下，对照品种湘晴单株产量仅为7.27克/株，本发明克隆的OEGD基因超表达的转基因植株单株产量大部分超过9克/株，最高的达到10.3克/株，说明在干旱逆境胁迫处理后其产量表现要明显地优于对照(见图8 )。
[0090]为了提高试验的精度，在上海大棚中进行了干旱胁迫试验。将幼苗移栽到大棚水泥池中，每个转基因株系种植5株，在田间随机分布，在转基因植株左右同时种植2株对照植株。当群体内大部分材料进入幼穗分化时期，排空水分进行干旱处理。大约3个星期以后，田间开始出现部分植株卷叶，表明开始出现干旱胁迫症状。随着胁迫程度的加重，部分植株叶片开始枯黄死去，但有部分转基因植株仍然叶片保持绿色。当大部分植株结实并成熟，收获种子称重，统计单株平均产量。将转基因植株与紧挨的对照植株产量的平均数进行比较，发现在干旱胁迫下，转基因植株单株产量明显优于对照品种湘晴单株产量(见图9)，其中对照湘晴植株平均单产为6.2-10.8克/株，而本发明克隆的OEGD基因超表达的转基因植株!116072、73、74、87平均单产在17.6-22.6克/株之间，显著优于对照，但株高统计没有差异。说明在干旱逆境胁迫处理后64--基因的表达可以缓解水稻在进入生殖生长后干旱胁迫造成的植株生长受阻，能有效保护水稻免于非生物胁迫的损坏，提高了植株的结实率和种子灌浆，增强转基因水稻对非生物逆境的抗性而减少产量的损失。
[0091]实施例6:0E⑶基因超量表达转基因烟草在田间抗旱试验 将获得的转基因烟草抽提DNA，将PCR检测阳性的烟草植株进一步繁殖获得T2代种子。将转基因烟草阳性T2代种子和对照非转基因烟草种子直接播种于营养钵中。当烟草苗生长到5片叶时，停止水分灌溉。7天后对照烟草植株叶片开始萎皱，而转基因烟草植株叶片仍十分舒展。两个星期后，对照烟草已停止生长，并有一半叶片已经枯死，而对照植株叶片才开始萎皱。一个月后，对照植株完全枯死，转基因烟草仍有2片叶保持绿色。复水三天后，对照烟草无法成活，而转基因烟草又开始复活，叶片舒展开来，并长出新叶。从以上结果可以看出，在烟草中超表达OE⑶基因，能显著提高烟草对干旱胁迫的耐受性，提高烟草的成活率。说明该改造基因能应用于多种植物中提高植物对逆境胁迫的抵抗力。
[0092]本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
【权利要求】
1.一种提高植物的胁迫耐性的人工融合基因，其特征在于: 该基因具有的多核苷酸序列包含: (a)编码植物GPDH蛋白的NAD(P)结合功能结构域的多核苷酸序列；和 (b)编码大肠杆菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脱氢酶功能结构域的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的人工融合基因，其特征在于: 所述的(b)为采用植物偏好性密码子人工合成的序列。
3.如权利要求2所述的人工融合基因，其特征在于:该人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1所示序列。
4.权利要求3所述的人工融合基因编码的蛋白，其特征在于:该人工融合基因编码的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。
5.含有权利要求1所述的人工融合基因的重组载体。
6.采用权利要求5所述的重组载体转化的宿主细胞。
7.—种生产胁迫耐性的转基因植物的方法，其特征在于: 该方法包括以下步骤: 1)将权利要求1所述的人工融合基因可操作地连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体； 2)将步骤I)所得的植物表达载体转入植物细胞； 3)经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代，所述的植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘或黄瓜中任意一种。
9.权利要求1所述的人工融合基因在制备具有胁迫耐性的转基因植物方面的用途。
【文档编号】C12N5/10GK103911386SQ201410153854
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】余舜武, 李天菲, 陈晨, 吴金红, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心