OsVTC1-1在提高植物盐胁迫耐性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种OsVTC1-1蛋白在促进植物维生素C合成中的应用。在体外OsVTC1-1蛋白可以催化甘露糖-1-磷酸生成GDP-甘露糖，表明OsVTC1-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在体内可能参与半乳糖途径而调控Vc合成，提高植物盐胁迫耐性。OsVTC1-1可以提高拟南芥VTC1突变体vtc1-1中Vc含量，增加了转基因植物的耐盐性。另外，干扰水稻中OsVTC1-1的表达显著抑制了水稻Vc的合成，降低了水稻的盐胁迫耐性。可见OsVTC1-1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中具有重要作用。
【专利说明】OsVTC1-1在提高植物盐胁迫耐性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种OsVTCl-1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中的应用。
【背景技术】
[0002]维生素C是动、植物体内重要的抗氧化剂和辅酶，可以清除植物体内在正常生理活动和胁迫条件下积累的活性氧(R0S)，在植物的胁迫应答中可以提高植物体内积累的R0S，在提高植物胁迫耐性中具有重要作用，所以通过生物技术的方法提高植物中维生素C含量在改善作物胁迫耐性中具有重要作用。
[0003]研究表明L-半乳糖途径是植物维生素C生物合成的主要途径，其活性与植物中维生素C含量密切相关。半乳糖途径合成途径以磷酸果糖为初始底物，磷酸果糖在甘露糖-6-磷酸异构酶的生成6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖在甘露糖磷酸变位酶的作用下生成1-磷酸甘露糖，1-磷酸甘露糖在GDP-甘露糖焦磷酸化酶生成GDP-甘露糖，进入植物维生素C生物合成主要调控途径、然后⑶P-甘露糖顺序在⑶P-甘露糖_3’，5’ -差向酶、GDP-L-半乳糖磷酸化酶、半乳糖-1-磷酸化酶、半乳糖脱氢酶、半乳糖内酯脱氢酶等相关酶的催化下生成维生素C。L-半乳糖途径中，催化1-磷酸甘露糖生成⑶P-甘露糖的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶是该合成途径的一个关键调控酶，其活性与植物中维生素C合成量密切相关，在植物维生素C生物合成中发挥关键的调控作用。拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶VTCl的点突变体vtcl-1因为VTCl的GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性降低而抑制了拟南芥中维生素C的生物合成，其维生素C含量只有野生型的25 - 30%。而VTCl功能缺失突变体，不仅抑制了维生素C的生物合成，而且影响了植物的开花时间，氧化胁迫耐性等多方面的生理活动，降低了植株对盐等胁迫的耐性。所以通过调节植物中编码GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因的表达，不仅可以调控植物中维生素C的生物合成，而且也可以调控植物的盐胁迫耐性。
[0004] 目前，尽管在模式植物拟南芥中Vc合成途径中关键酶基因的功能比较清楚，但在粮食作物如水稻中Vc还不清楚。我们通过同源克隆的方法从水稻中克隆了拟南芥VTCl的同源基因OsVTCH。体外表达并纯化OsVTCl-1蛋白，在体外检测OsVTCl-1蛋白的酶活性。实验结果显示在体外OsVTCl-1可以催化1-磷酸甘露糖生成⑶P-甘露糖，表明OsVTCl-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在体内可能参与半乳糖途径而调控Vc合成。将OsVTCl-1构建到植物表达载体，转化模式植物拟南芥，进一步研究OsVTCl-1在植物体内的功能。实验结果显示表达OsVTCl-1可以互补拟南芥VTCl功能，提高拟南芥VTCl突变体vtcl-1中Vc含量，表明OsVTCl-1在植物中有VTCl类似功能，通过催化⑶P-甘露糖合成调控植物Vc合成。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种OsVTCl-1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中的应用。
[0006]在体外OsVTCl-1蛋白可以催化甘露糖-1-磷酸生成⑶P-甘露糖，表明OsVTCl-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在体内可能参与半乳糖途径而调控Vc合成。OsVTCl-1可以提高拟南芥WCi突变体Vtcl-1中Vc含量，显著增加了转基因拟南芥的盐胁迫耐性。另外，干扰水稻中OsVTCl-1的表达显著抑制了水稻Vc的合成，则明显降低了水稻盐胁迫耐性。可见OsVTCl-1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中具有重要作用。
[0007]本发明提供的技术方案是:一种OsVTCl-1基因在改变植物盐胁迫耐性中的应用，所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0008]一种OsVTCl-1基因在改变植物盐胁迫耐性中的应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1 所示。
[0009]所述的应用，所述植物是水稻。
[0010]所述的应用，所述改变植物盐胁迫是降低植物的耐受性，其通过基因工程技术降低所述基因的表达来实现。
[0011]所述的应用，所述改变植物盐胁迫是提高植物的耐受性，其通过基因工程技术使所述基因在植物中过量表达来实现。
[0012]同时，本发明还提供所述的OsVTCl-1基因的载体，转化细胞或宿主细胞。
[0013]本发明还提供一种提高植物中Vc合成的方法:将SEQ ID N0.1所示序列的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的维生素C合成提高，盐胁迫耐性增强。
[0014]上述的方法，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PCAMBIA1307的多克隆位点得到的。
[0015]本发明具有以下有益效果:
OsVTCl -1蛋白具有催化甘露糖-1-磷酸生成⑶P-甘露糖的功能，其过表达不仅可以通过半乳糖途径提高植物中Vc的生物合成，而且可以显著增加植物的盐胁迫耐性。Vc是人体必需的营养元素，本发明提供了一种提高作物(水稻)胁迫耐性(耐盐胁迫)，同时改善其营养价值(高Vc含量)的有效方法，在粮食作物耐性和营养改良中具有重要意义。
[0016]
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1 为 OsVTC卜I mRNA 序列。
[0018]图2为OsVTCH基因过表达载体pCAMBIA1307-0sVTCl_l构建示意图。
[0019]图3为OsVTCH基因干扰表达载体pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl_l示意图。
[0020]图4为OsVTCl-1基因过表达材料与干扰材料中OsVTCl-1基因表达检测结果，其中，A为转基因材料的Western blot的检测结果，B为转基因材料中OsVTCl-1基因表达的Q-PCR检测结果。
[0021]图5为OsVTCl-1基因过表达材料与干扰材料中维生素C含量的检测结果，A中，WT为T3織OsVTCl-1植物表达载体pCAMBIA1307空载体的拟南芥，vtcl-Ι为拟南芥VTCl的单点突变体vtcl-1，0E7和0E13为T3代转OsVTCH过表达载体pCAMBIA1307_0sVTCl_l拟南芥的两个独立株系；B中，WT为野生型水稻中花17，R1-l、R1-2、R1-3为T3代转flsK7T7-7干扰载体pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l水稻的3个株系。
[0022]图6为OsVTCl-1基因过表达拟南芥盐胁迫耐性，其中，A为用150 mM NaCl处理两周拟南芥苗7天后，过表达OsVTCl-1拟南芥在盐胁迫处理下的耐盐表型；B为用150 mMNaCl处理两周拟南芥苗10天后，过表达AsITCV-7拟南芥在盐胁迫处理下存活率的统计数据。。
[0023]图7为OsVTCl-1基因干扰水稻盐胁迫耐性，其中A为用150 mM NaCl处理两周龄抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗10天后，抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗在盐胁迫处理下的盐敏感表型；B为用150 mM NaCl处理两周龄抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗10天后，在正常生长条件下恢复培养I周后抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗存活率的统计数据。
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]水稻中花17 (Zhonghua 17)在文献“ Liu D, Chen X，Liu J, Ye J, Guo Z.(2012)
The rice ERF transcription factor 0sERF922 negatively regulates resistance to
Magnaporthe oryzae and salt tolerance.J Exp Bot.63:3899-3911.，，中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。 [0027]拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体vtcl-1在文献“Conklin PL,Saracco SA, Norris SR, Last RL.(2000) Identification of ascorbic acid-deficientArabidopsis thaliana mutants.Genetics.154:847-856.” 中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
[0028]pCAMBIA1307购自上海吉然生物科技有限公司，产品目录号为JR13080311。
[0029]农杆菌LBA4404购自行知生物科技有限公司http://www.biomart, cn/8627/index, htm，产品目录号为 AABV02-03。
[0030]诱导培养基(NB培养基)购自上海科敏生物科技有限公司，货号为BS1309。
[0031]继代培养基为NB培养基中加2mg/L 2，4_D制成。
[0032]IOOuM AS+AA液体培养基由NB培养基加2mg/L 2，4-D以及100uM/L AS制成。
[0033]pUCCRNAi 在文献 “Gan D, Zhang J, Jiang H, Jiang T, Zhu S，Cheng B (2010)Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep.29:1261-1268.”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
[0034]PCAMBIA2300购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，产品目录号为MCV036。
[0035]实施例1、OsVTCl-1基因过表达载体转化拟南芥 一、干扰表达载体的构建
(一)提取水稻中花17的基因组DNA。
[0036](二)设计并合成如下引物:
上游引物:5’ -GCTCTAGAACCATGAAGGCGCTCATT-3，(SEQ ID N0.4)
下游引物:5’ -CAGTCGACCATGACAATCTCAGGCTT-3’ (SEQ ID N0.5)
(下划线所示序列为酶切识别位点)
(三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)中的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到OsVTCH基因。
[0037](四)用尬aI与I双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到基因片段伽I与Sal I双酶切PCAMBIA1307，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA1307-0sVTCl-l，将该质粒送测序结果正确，其构建示意图如图2所示。[0038]二、将pCAMBIA1307-0sVTCl-l通过电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-l。
[0039]三、过表达载体转化拟南芥
(一)取生长状况良好的、有较多的花苞的拟南芥维生素C合成关键基因VTCl的单点突变体ric7-7,转化前一天烧水。
[0040](二)将重组农杆菌 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-l 于 28 °C 培养过夜，至OD600=0.8,6000rpm 离心 6min,收集菌体。
[0041](三)将菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0D_=0.4，制成悬浮液。
[0042](四)转化时剪去已经开花的花朵或者已有的果荚，倾倒小盆，确保拟南芥全部花苞都浸没入步骤(三)制备的悬浮液中，浸泡约40s。
[0043](五)吸去植物周围多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿度，避光过夜。
[0044](六)第二天将植物取出，竖直，转移到20°C，16h光照/8h黑暗条件下生长，得到Tl代种子。
[0045](七)将Tl代种子铺于含40ug/mL潮霉素的筛选培养基上，4°C春化48h_72h，移到人工气候室，16h光照/8h黑暗条件下生长两周。
[0046](A)待长出绿色的转基因抗性幼苗(转基因植物为绿色的幼苗且根较长；非转基因植物基本为黄化苗或绿色无根幼苗)后移栽入土继续生长，获得Tl代转基因植株(图4A为转基因材料的Western blot的检测结果)。
[0047](九)筛选Tl代苗的潮霉素抗性与非抗性的种子具有3:1分离比的转基因植株并加代繁殖，得到T3代转基因拟南芥，将其应用于OsVTCl-1蛋白在植物中的功能分析。
[0048]实施例2、Os VTCl_2基因干扰载体转化水稻 一、过表达载体的构建
(一)提取水稻中花17的基因组DNA。
[0049](二)设计并合成如下引物:
上游引物:5’ -CTCTCGAGCCTCCTTTTATGTTATGGTA-3 (SEQ ID N0.6)
下游引物:5’ -CCAGATCTAAGAACAAAGTACAAGGCTG-3’ (SEQ ID N0.7 )
(下划线所示序列为酶切识别位点)
(三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。(ACCESSIONNUMBER 为 NM_001051330 ;序列为
cctccttttatgttatggtatactcaagttcttttaatgcagtatctttagtttatacctgtgatccttccaagatgttgacctagcatgtgtgttactcacattctgaaaactgcttctcaatgagaattcagtgtgccatatttgattgtaccttcatttggaccatccagtaaagttctcaaccctgcaccaagaggaccagaagaaactctttttcctataaaagaagaggatcagccttgtactttgttctt)(该片段不包含基因 cDNA 片段，位于OsVTCl-1 基因的 3’ UTR 区)
m)Xho I与Bgl II双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到OsVTCl-1基因的3’UTR片段'Xho I与Bgl II双酶切pUCCRNAi，得到载体大片段I ;将该片段与载体大片段I连接，得到中间载体I。
[0050]Sal I与BrniH I双酶切中间载体I，得到载体大片段2 'Xho I与Bgl II双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到基因片段；将载体大片段2与基因片段连接，得到中间载体2(.Xho I 与 BanM I ,Bgl II 与 I 是同尾酶)。
[0051]Pst I酶切中间载体2，得到双向互补的OsVTCl-1基因的3’UTR片段^Pst I酶切PCAMBIA2300，得到载体大片段3 ;将双向互补的OsVTCl-1基因片段与载体大片段3连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l，其构建示意图如图3所示。
[0052]二、将pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l以电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为 LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l。
[0053]三、干扰表达载体转化水稻
(一)将用体积百分含量75%乙醇灭菌后的水稻中花17的种子种于诱导培养基上，28°C黑暗培养。两周后，将愈伤组织转入新的诱导培养基，28°C继代暗培养，共继代暗培养2代。
[0054](二)将第三 代继代愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基上，28°C暗培养3天，得到的愈伤组织用于重组农杆菌的转化。
[0055](三)将重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l 悬浮于 IOOuM AS+AA 液体培养基中(0D_为0.3)，然后将步骤(二)得到的愈伤组织置于菌悬浮液中浸泡10-20分钟，其间轻轻摇动，于28°C培养过夜，至OD6tltl=0.8，6000rpm离心6min，收集菌体。将菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0D_=0.3-0.6ο
[0056](四)倒掉菌液，小心取出愈伤组织用滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织转移到共培养培养基上，21 °C -22°C暗培养3天。
[0057](五)挑选共培养后的愈伤组织，滤纸滤干表面水汽后平铺于筛选培养基(含50mg/L潮霉素)上，28°C进行暗培养。2周时继代一次，共继代2次。
[0058](六)将步骤(五)得到的生长旺盛，呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织转至预分化培养基，28°C暗培养I周左右，然后28°C光照培养，两周左右继代一次，得到分化苗。
[0059](七)将长势好的分化成苗移至生根培养基(瓶装)上。培养1-2周后移栽温室，得到TO代转基因植株以及TO转基因植株的种子。
[0060]将TO转基因植株的种子使用潮霉素选择平板萌发，确认潮霉素抗性具有3:1分离比的株系，然后将由其得到的Tl转基因植株转至土壤培养直至成熟。将获得的转基因材料加代繁殖，利用获得的T3代转基因水稻分析OsVTCl-1蛋白在植物中的功能。
[0061](图4B为转基因材料中OsVTCl-1基因表达的Q-PCR检测结果)
实施例3、转基因植株中的维生素C含量检测
一、选取3周龄T3代转基因水稻和野生型水稻中花17的根及转基因拟南芥、野生型拟南芥和拟南芥VTCl突变体Vtcl-1的叶片,用水冲洗干净,并用吸水纸吸干多余的水分,然后分别用液氮迅速冷冻，于_80°C保存。
[0062]二、准确称取0.175g AsA,溶于Iml体积百分含量为6%的高氯酸(HClO4)水溶液中，即得lmmol/ml的AsA溶液。[0063]三、将lmmol/ml的AsA溶液用体积百分含量为6%的高氯酸溶液将其最终稀释为浓度分别为 1000nmol/ml、800nmol/ml、600nmol/ml、400nmol/ml、200nmol/ml、100nmol/ml的AsA溶液。
[0064]四、分别取300μ I步骤三得到的不同浓度的AsA溶液，加入2700μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，混匀，此时的ρΗ=5.8左右，AsA的浓度相应减少了 10倍。在265nm处测不同浓度的AsA的吸收值。以吸收值(OD)为横坐标，AsA浓度为纵坐标作图，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
[0065]五、分别取步骤一得到的0.5g的各植株的材料，在液氮下研磨，分别加入1ml体积百分含量为6%的HClO4水溶液，混匀，冰上放置5min，4°C，12000g,离心10min。取上清，提取其中的AsA。
[0066]六、将步骤五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，然后加入4U的抗坏血酸氧化酶(购自Sigma),反应10min后，记录265nm紫外吸收值,记作ODl ;取步骤五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸钠缓冲液中，加入DTT至终浓度为30mM，室温反应30min，记录265nm紫外吸收值，记作0D2。
[0067]七、将0D2-0D1值代入步骤四得到的线性回归方程，计算出AsA的浓度。
[0068]各植株中的维生素C含量检测结果如图5所示。
[0069]实施例4、转基因植株盐胁迫耐性检测 将野生型和OsVTCl-1过表达拟南芥T3种子在MS基本培养基上萌发，并生长两周。将两周龄的拟南芥苗转入含150 mM NaCl的MS基本培养基上，14小时光照/10黑暗，22°C，生长7天。观察盐胁迫条件下野生型和OsVTCl-1过表达拟南芥苗生长情况，记录实验结果。实验重复3次，分析提高OsVTCH表达在改善拟南芥盐胁迫耐性中的作用。将野生型和抑制OsVTCl-1表达水稻T3种子37°C催芽24小时后，在水中30°C发芽并生长3_4天，然后中植土中，28-32°C培养2周。然后用浇150 mM NaCl溶液处理水稻苗10天。观察盐胁迫条件下野生型和抑制OsVTCl-1表达水稻苗生长情况，记录实验结果。在150 mM NaCl溶液处理水稻苗10天后，恢复浇灌不加NaCl水溶液，恢复培养I周，然后统计野生型和抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗存活率。实验重复3次，分析抑制OsVTCl-1表达对水稻盐胁迫耐性的影响。
[0070]图6展示提高OsVTCl-1表达在改善拟南芥盐胁迫耐性中的作用。图6A为用150mM NaCl处理两周拟南芥苗7天后，过表达OsVTCl-1拟南芥在盐胁迫处理下的耐盐表型；图6B为用150 mM NaCl处理两周拟南芥苗10天后，过表达OsVTCl-1拟南芥在盐胁迫处理下存活率的统计数据。上述研究发现提高OsVTCl-1表达可以增加拟南芥的盐胁迫耐性，表明OsVTCl-1蛋白在植物中能通过提高植物Vc合成，增加植物盐胁迫耐性。
[0071]图7展示抑制OsVTCl-1表达降低了水稻盐胁迫耐性。当用NaCl处理抑制水稻中OsVTCl-1表达的转基因材料时发现用NaCl处理抑制水稻中OsVTCl-1表达的转基因水稻苗后，转基因水稻表现出盐敏感性。图7A为用150 mM NaCl处理两周龄抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗10天后，抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗在盐胁迫处理下的盐敏感表型；图6B为用150 mM NaCl处理两周龄抑制OsVTCl-1表达的转基因水稻苗10天后，在正常生长条件下恢复培养I周后抑制表达的转基因水稻苗存活率的统计数据。上述研究发现抑制OsVTCl-1表达显著降低了转基因水稻的盐胁迫耐性，表明OsVTCl-1可通过调节水稻Vc合成调控水稻的盐胁迫耐性。
[0072]综上所述，OsVTCl-1在植物盐胁迫应答中具有重要作用(图6，图7)。
【权利要求】
1.一种OsVTCl-1基因在改变植物盐胁迫耐性中的应用，其特征在于:所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.—种OsVTCl-1基因在改变植物盐胁迫耐性中的应用，其特征在于:所述基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述植物是水稻。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于:所述改变植物盐胁迫是降低植物的耐受性，其通过基因工程技术降低所述基因的表达来实现。
5.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于:所述改变植物盐胁迫是提高植物的耐受性，其通过基因工程技术使所述基因在植物中过量表达来实现。
6.含权利要求1中所述的OsVTCl-1基因的载体，转化细胞或宿主细胞。
7.一种提高植物中Vc合成的方法，其特征在于:将SEQ ID N0.1所示序列的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的维生素C合成提高，盐胁迫耐性增强。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PCAMBIA1307的多克隆位点得到 。
【文档编号】C12N15/82GK104004078SQ201410269067
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】张执金, 秦华, 邓载安, 张传玉, 王亚云, 王娟, 张海文, 权瑞党, 黄荣峰 申请人:中国农业科学院生物技术研究所