一种茶树dna的提取方法
【专利说明】一种茶树DNA的提取方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茶树DNA的提取方法。
【背景技术】
[0003]茶树(Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze)属山茶科山茶属茶亚属茶种植物，起源于我国西南地区，经长期的引种、传播，我国茶树生长区域从N 18° 30' -35° 13'，E94° -122°，南至热带边缘，北至暖温带。我国是茶树的主要原产地，至今已有3000多年的人工栽培历史，经过几千年的人工或自然育种，形成了非常丰富的茶树种质资源。
[0004]DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多样性、品种鉴定的一个重要工具。目前常见的茶树DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法，这两种方法已有很多研究，也有很多优化方案。由于茶树组织中含有大量的多糖多酚，而多糖多酚又容易与DNA结合，所以茶树DNA的提取一直没有理想的方法。而通过对已有的优化方法进行重复发现:若要提取高纯度的DNA则单样提取周期长，反之，若缩短提取时间，所提的DNA纯度较低。试剂盒法提取茶树DNA，虽然提取纯度高，但因膜过滤使提取量降低。所以，如何提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法是目前急需解决的一个难题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于:提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
一种茶树DNA的提取方法，具体步骤如下:
(O取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状；
(2)将步骤(I)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后，加入650 μ L水浴的提取液，所述的提取液由 ΡΗ8.0 ； 10mmoI/L 的 Tris-盐酸、ρΗ8.0 ；20mmol/L 的 EDTA、1.0moI/L 的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成，漩涡震荡充分混匀后，再加入15 μ L的β -巯基乙醇，60°C -70°C，水浴15-25min，每隔5min混匀一次，得到粗样品；
(3)水浴结束后加入ΙΟμ?，10mg/mL的RNase-A混匀后，40°C水浴5min，得到粗样品；
(4)取出离心管先后加入PH8.0 ；400μ?的Tris平衡酚和400μ?氯仿/异戊醇，漩涡震荡充分混匀后10000 rpm离心lOmin，获得上清液；
(5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中，加入3倍上清液体积的-20°C预冷无水乙醇，混匀，此时有DNA析出，倒去上清液，后再用lml-20°C预冷无水乙醇清洗一次，倒去上清液；
(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45°C预热的去离子水，再放入45°C水浴锅中溶解，重复步骤(5)的操作一至两次，1000rpm离心Imin后，去上清后再次空转1000rpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇，待沉淀微白时取出，加入200μ?去离子水后获得DNA，后将提取的DNA放置_20°C冰箱中备用。
[0007]优选地，步骤(2)中CTAB/SDS的体积比为1:6。
[0008]优选地，步骤(4)中氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
[0009]本发明的有益效果在于:
1、提取的茶树叶片的基因组DNA浓度高。
[0010]2、提取时间短，在1-2小时内可以完成，且所用试剂价格便宜，降低了成本。通过反复实验验证，在提取试剂中加入可以结合多酚的试剂，同时简化操作步骤。使提取的DNA的质量与含量都较高的同时将提取单个样品的时间控制在lOOmin以内，大大节省了操作的时间，由于提取试剂可以自行配制降低实验的成本。
【附图说明】
图1是本发明提取的茶树DNA的电泳图；
图2是本发明提取的茶树DNA进行PCR扩增的电泳图。
【具体实施方式】
[0011 ] 茶树DNA的提取方法，具体步骤如下:
(1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状；
(2)将步骤(1)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后，加入650 μ L水浴的提取液，所述的提取液由 ΡΗ8.0 ；100mmol/L 的 Tris-盐酸、pH8.0 ；20mmol/L 的 EDTA、1.0mol/L 的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成，漩涡震荡充分混匀后，再加入15 μ L的β -巯基乙醇，60°C -70°C，水浴15-25min，每隔5min混匀一次，得到粗样品；
(3)水浴结束后加入ΙΟμ?，10mg/mL的RNase_A混匀后，40°C水浴5min，得到粗样品；
(4)取出离心管先后加入PH8.0 ；400μ?的Tris平衡酚和400μ?氯仿/异戊醇，漩涡震荡充分混匀后10000 rpm离心lOmin，获得上清液；
(5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中，加入3倍上清液体积的-20°C预冷无水乙醇，混匀，此时有DNA析出，倒去上清液，后再用lml-20°C预冷无水乙醇清洗一次，倒去上清液；
(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45°C预热的去离子水，再放入45°C水浴锅中溶解，重复步骤(5)的操作一至两次，lOOOOrpm离心lmin后，去上清后再次空转lOOOOrpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇，待沉淀微白时取出，加入200μ?去离子水后获得DNA，后将提取的DNA放置_20°C冰箱中备用。
[0012]其中，步骤(2 )中CTAB/SDS的体积比为1:6 ;步骤(4)中氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
[0013]1、DNA核酸定量
测定上述方法提取的茶树DNA在230nm，260nm、280nm的光密度值，通过计算得到以下数据:A260/A280=2.00，A260/A230=l.98，DNA 浓度=577.7ng/^L。
[0014]以上数据可以看出:本发明的方法提取的DNA浓度高，纯度高，受RNA、碳水化合物和盐类的污染较少。
[0015]2、琼脂糖凝胶电泳分析
称取2g琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入0.5 X TBE电泳缓冲液20ml ;随即用微波炉加热至粉末完全溶化，稍摇匀，待溶液完全透明，冷却至60°C左右，倒入已经在一端插好梳子的有机玻璃胶槽中。当胶凝固后，拔起梳子，将加样孔端放进电泳槽阴极段。在电泳槽内加0.5XTBE缓冲液至液面覆盖过胶面。用移液枪取2 μ I本发明提取的DNA原液和I μ Iloadingbuffer，充分混匀后加进点样孔；在0.5 X TBE缓冲液中用100 V电压，电泳40 min，最后将凝胶置于紫外光与凝胶成像系统上观察，并保存图像，如图1所示。
[0016]从图1中可以看出:使用本发明的方法提取的基因组DNA电泳呈现一条较粗且明亮的条带，点样孔有一点微微的发亮，表明提取的DNA样品浓度较高。
[0017]3、PCR扩增及电泳分析
PCR的扩增检测，所用引物是上海生工公司生产引物Ss2，反应仪器S1000? PCR仪。PCR 反应总体积为 11 μ 1，其中模板 DNA 2.0 μ 1，PCR buffer 1.0 μ I, MgCl2 1.0 μ I, dNTP0.9 μ 1，引物 0.5 μ 1，taqDNA 聚合酶 0.1 μ I。
[0018]PCR循环程序:95°C预变性I分钟，98°C变性15秒，57°C退火25秒；然后72°C延伸20秒，一共35个循环，最后延伸10分钟，4°C条件下保存。PCR结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，在100V电压下电泳45min，最后置于凝胶成像系统下观察，并保存图片，如图2所示。
[0019]从图2中可以看出:对本发明提取的基因组DNA进行PCR扩增，获得清晰的扩增条带。说明高效提取法提取的基因组DNA活性良好，可作为PCR反应的模板，满足PCR反应对DNA质量需求。
【主权项】
1.一种茶树DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状； (2)将步骤(1)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后，加入650 μ L水浴的提取液，所述的提取液由 ΡΗ8.0 ；100mmol/L 的 Tris-盐酸、pH8.0 ；20mmol/L 的 EDTA、1.0mol/L 的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成，漩涡震荡充分混匀后，再加入15 μ L的β -巯基乙醇，60°C -70°C，水浴15-25min，每隔5min混匀一次，得到粗样品； (3)水浴结束后加入ΙΟμ?，10mg/mL的RNase_A混匀后，40°C水浴5min，得到粗样品； (4)取出离心管先后加入PH8.0 ；400μ?的Tris平衡酚和400μ?氯仿/异戊醇，漩涡震荡充分混匀后10000 rpm离心lOmin，获得上清液； (5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中，加入3倍上清液体积的-20°C预冷无水乙醇，混匀，此时有DNA析出，倒去上清液，后再用lml-20°C预冷无水乙醇清洗一次，倒去上清液； (6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45°C预热的去离子水，再放入45°C水浴锅中溶解，重复步骤(5)的操作一至两次，lOOOOrpm离心lmin后，去上清液后再次空转lOOOOrpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇，待沉淀微白时取出，加入200μ?去离子水后获得DNA，后将提取的DNA放置_20°C冰箱中备用。2.根据权利要求1所述的茶树DNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)中CTAB/SDS体积比为1:6o3.根据权利要求1所述的茶树DNA的提取方法，其特征在于，步骤(4)中氯仿/异戊醇体积比为24:1ο
【专利摘要】本发明涉及茶树DNA的提取方法，具体步骤如下：（1）取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放研磨成粉末状；（2）取粉末放入离心管，依次加入水浴的提取液，β-巯基乙醇，60℃-70℃，水浴15-25min，得粗样品；（3）加入RNase-A混匀后，40℃水浴5min，得粗样品；（4）取出离心管先后加入Tris平衡酚和氯仿/异戊醇，混匀后离心得上清液；（5）将上清液用-20℃预冷无水乙醇，清洗两次；（6）将步骤（5）得到的沉淀物中加入45℃预热去离子水，放入45℃水浴锅中溶解，重复步骤（5）的操作一至两次，蒸发剩余乙醇，在加入200μL去离子水后获得DNA。本发明提取的茶树叶片的基因组DNA浓度高、提取时间短。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105255857
【申请号】CN201510556916
【发明人】丁洲, 李烨昕, 江昌俊, 刘学诗
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月2日